The present work showed that teeth

The present work showed that teeth samples of dolphins preserved in collections were a good source of mitochondrial DNA for population genetics and taxonomic studies. The positive results in obtaining DNA showed that the pre-treatment of samples chosen for decontamination from exogenous sources was efficient and did not damage totally the DNA, leaving enough DNA for the amplification of the region of interest. Rosenbaum et al. (1997) did not succeed in obtaining DNA from Baleen plates after soaking them overnight in absolute ethanol, as was done in the present work. They were able to obtain DNA only when submitted them to a surface cleaning with this component. In the case of teeth the DNA is localised internally surrounding the pulp cavity, therefore, it may be less exposed to the ethanol. The demineralization process was necessary because it was expected that mineral compounds were likely to inibit the PCR, which were also responsible for the higher preservation of DNA at this regions. Kiesslich et al. (2002) described an efficient and quick method of DNA purification by the use of dialysis using nitrocellulose membranes. The silica-GUSCN protocol for DNA extraction was efficient for the present purpose of extracting DNA from grained teeth, showing that it was a good protocol for difficult templates as was stated previously by Hoelzel (1998). More recently, other authors have used other extraction protocols for preserved part of specimens from collections, such as Proteinase-k for lisis, Phenol/Chloroform for purification, and absolute ethanol for precipitation (Rosenbaum et al., 1997; Sweet and Hildebrand, 1998) and alternatively using nitrocelulose-mediated dialysis for purification (Kiesslich et al., 2002). The sílica-GUSCN protocole has the advantage of providing highly pure DNA, eliminating known and unknown PCR inibitors (Höss and Pääbo, 1993; Yang, 1997).

The primers used for amplifying the 16S rRNA mitochondrial gene described by Palumbi et al. (1991) were not useful for obtaining part of this gene in T. truncatus. Therefore, it seemed that they were not useful for vertebrates. These primers have proven to be very useful in a variety of invertebrates (Palumbi et al., 1991; Rawson and Hilbish, 1995; pers. obs.). In the case of the BDR region of the Cytochrome-b gene, the primers tested, described by Unseld et al. (1995) for a very conservative region of vertebrate species, were useful for amplifying this gene in T. truncatus. The fragment obtained for this species was close to 123 bp, the size observed for tunnids (Fig.1).The yield of PCR product tended to increase with higher quantities of dentin powder used for DNA extraction (see linear regression in Fig. 2) and no negative results were found when quantities over 110 mg were used. Although the correlation was very low (r= 0.492) between the quantity of dentin powder used for DNA extraction and the concentration in ng/µl of the amplified fragment of the BDR region of the Cytochrome-b gene (y= 0.464 + 22.127 x), the regression was significant (p= 0.045) and when adjusting to an intercept of zero (no DNA implies no amplified product) the correlation increased to r= 0.816 turning it highly significant (p< 0.0001).Although enough quantity of DNA was extracted from individual teeth for PCR, it yielded only few nanogrames after amplification. Sweet and Hildebrand (1998) recovered quantities of extracted DNA up to 97.5mg from fresh human molars. Of course this high yield was achieved only from fresh tissue of the pulp cavity of recently extracted teeth. After death, cells around the pulp cavity suffered chemical degradation due to hydrolitic processes (Lindahl, 1993) and oxydative damage (Höss et al., 1996), which led to chain-breaking vulnerability, as well as physical fragmentation due to enzimatic activity by bacteria that digested the DNA (Yang, 1997). It has proven that DNA decay is not linear and shows an initial rapid decay shortly after death, showing afterwards a "plateau effect" of largely reduced damage (Yang, 1997). Therefore, the immediate post-mortem period is critical. Collection parts that were preserved in dry showed lower levels of DNA damage. Hard parts of specimens, such as teeth and bones showed better preserved DNA, which was attributed to the interaction with mineral grains (Keil et al., 1994), with hydroxypatite (Tuross, 1994), and the presence of chemicals that inhibited the action of enzymes that otherwise would degrade the DNA, such as tocopherols and flavonoids (Eglinton and Logan, 1991; Yang, 1997).

Analysis of SSCP allowed ruling out any possible contamination with human and tunnid DNAs, because their SSCP patterns were different from those of Tursiops (Figs. 3 and 4). Polymorphism was detected for the BDR region of Cytochrome-b within T. truncatus, where dentin samples showed a unique pattern, while muscle positive controls showed other distinct ones (Fig. 3). Tursiops samples were collected from different geographical regions, suggesting that this polymorphism might be associated to geographical distribution.In conclusion, the present work confirmed the possibility of using dentin powder as a source of DNA for bottlenose dolphin population genetics and taxonomic studies through mtDNA analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

งานปัจจุบันพบว่า ตัวอย่างฟันของปลาโลมาที่เก็บรักษาไว้ในคอลเลกชันเป็นแหล่งที่ดีของ mitochondrial DNA พันธุศาสตร์เชิงประชากรและการศึกษาอนุกรมวิธาน ผลบวกในการรับดีเอ็นเอพบว่า รักษาก่อนตัวอย่างสำหรับ decontamination จากแหล่งบ่อยมาก และไม่ได้เสียทั้งหมดดีเอ็นเอ ออกจากดีเอ็นเอเพียงพอสำหรับการขยายภาคน่าสนใจ ไม่ Rosenbaum et al. (1997) ได้ประสบความสำเร็จในการรับดีเอ็นเอจาก Baleen แผ่นหลังอย่างนั้นค้างคืนแน่นอนเอทานอล ที่ทำงานปัจจุบัน พวกเขาเคยได้รับดีเอ็นเอเฉพาะเมื่อส่งพวกเขาไปที่พื้นผิวทำความสะอาด ด้วยคอมโพเนนต์นี้ ในกรณีของดีเอ็นเอเป็นไหนรอบโพรงเยื่อภายในฟัน ดังนั้น มันได้น้อยสัมผัสกับเอทานอล การ demineralization ไม่จำเป็นเนื่องจากมันถูกคาดว่า สารแร่มีแนวโน้มที่จะ inibit PCR ซึ่งยังรับผิดชอบสูงในการบำรุงรักษาของดีเอ็นเอในภูมิภาคนี้ Kiesslich et al. (2002) กล่าวถึงวิธีการมีประสิทธิภาพ และรวดเร็วในการทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ โดยใช้หน่วยที่ใช้เยื่อหุ้ม nitrocellulose ซิลิก้า GUSCN โพรโทคอลการสกัดดีเอ็นเอถูกมีประสิทธิภาพสำหรับวัตถุประสงค์มีการสกัดดีเอ็นเอจากฟัน grained แสดงว่า มันเป็นโพรโทคอลที่ดีสำหรับแม่แบบยากตามที่ได้ระบุไว้ก่อนหน้านี้ โดย Hoelzel (1998) เมื่อเร็ว ๆ นี้ คนใช้โปรโตคอลอื่น ๆ สกัดสำหรับหนึ่งรักษาไว้เป็นตัวอย่างจากคอลเลกชัน เช่น Proteinase k สำหรับ lisis วาง/สำหรับฟอก คลอโรฟอร์มและเอทานอลนอนสำหรับฝน (Rosenbaum et al., 1997 หวานและ Hildebrand, 1998) และอีกวิธีหนึ่งคือ ใช้หน่วย nitrocelulose mediated ฟอก (Kiesslich et al., 2002) Protocole sílica GUSCN มีประโยชน์ให้ DNA บริสุทธิ์สูง ตัดรู้จัก และไม่รู้จัก PCR inibitors (Höss และ Pääbo, 1993 ยาง 1997)ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับมือ 16S rRNA mitochondrial ยีนอธิบายโดย Palumbi et al. (1991) ไม่มีประโยชน์สำหรับการได้รับส่วนหนึ่งของยีนนี้ในต. truncatus ดังนั้น มันดูเหมือนว่า พวกเขาไม่มีประโยชน์สำหรับ vertebrates ไพรเมอร์เหล่านี้ได้พิสูจน์ให้เป็นประโยชน์มากหลาย invertebrates (Palumbi et al., 1991 สอนศาสนาและ Hilbish, 1995 อาทิ obs.) ในกรณีที่ภูมิภาคลวิของยีน Cytochrome b ไพรเมอร์ที่ทดสอบ อธิบายโดย Unseld et al. (1995) สำหรับภูมิภาคหัวเก่ามากชนิดหลอด ได้ประโยชน์สำหรับมือนี้ยีนในต. truncatus ส่วนได้รับสำหรับนกชนิดนี้อยู่ใกล้ 123 bp ขนาดสังเกตสำหรับ tunnids (ภาพ) ผลผลิตของ PCR มีแนวโน้มที่จะ เพิ่มปริมาณสูงกว่าเนื้อผงที่ใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ (ดูถดถอยเชิงเส้นใน Fig. 2) และเมื่อใช้ปริมาณกว่า 110 มิลลิกรัมผลเชิงลบไม่พบ แม้ว่าสหสัมพันธ์ต่ำมาก (r = 0.492) ระหว่างปริมาณของเนื้อผงที่ใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอและเข้มข้นใน ng/µl ส่วนเอาต์ภาคลวิของยีน Cytochrome b (y = 22.127 x + 0.464), การถดถอยได้อย่างมีนัยสำคัญ (p = 0.045) และ เมื่อมีการปรับให้มีจุดตัดแกนของศูนย์ (ดีเอ็นเอไม่หมายถึงสินค้าที่ไม่มีเอาต์) เพิ่มขึ้นสหสัมพันธ์ r = 0.816 เปิดมันสูงอย่างมีนัยสำคัญ (p < มาก 0.0001) แม้ปริมาณเพียงพอของดีเอ็นเอที่สกัดจากฟันแต่ละสำหรับ PCR นั้นหาเพียงไม่กี่ nanogrames หลังจากขยาย หวานและ Hildebrand (1998) กู้คืนปริมาณของดีเอ็นเอแยกจากมนุษย์ molars สดถึง 97.5 มิลลิกรัม แน่นอนนี้ผงสำเร็จจากเนื้อเยื่อสดของโพรงเยื่อของฟันเพิ่งแยกเท่านั้น หลังความตาย เซลล์รอบ ๆ โพรงเยื่อประสบการลดประสิทธิภาพของสารเคมีจากกระบวนการ hydrolitic (Lindahl, 1993) และ oxydative ความเสียหาย (Höss et al., 1996), ซึ่งนำไปสู่การแบ่งกลุ่มเสี่ยง เป็นการกระจายตัวของจริงเนื่องจากกิจกรรมของ enzimatic โดยแบคทีเรียที่ต้องการดีเอ็นเอ (ยาง 1997) มันได้พิสูจน์ดีเอ็นเอผุไม่เชิงเส้น และแสดงการผุอย่างรวดเร็วเริ่มต้นหลังจากการตาย การแสดงหลังจากนั้นเป็น "ที่ราบสูงลักษณะพิเศษ" ของความเสียหายลดลงมาก (ยาง 1997) ดังนั้น ระยะพ้นลงทันทีเป็นสิ่งสำคัญ ส่วนคอลเลกชันที่ถูกเก็บรักษาไว้ในแห้งระดับล่างแสดงความเสียหายของดีเอ็นเอ ส่วนหนักของ specimens, DNA ซึ่งถูกบันทึกการโต้ตอบ กับธัญพืชแร่ (Keil et al., 1994) hydroxypatite (Tuross, 1994), และสถานะของสารเคมีที่ห้ามการกระทำของเอนไซม์ที่มิฉะนั้น จะย่อยสลาย DNA, tocopherols และ flavonoids (Eglinton และโลแกน 1991 ที่เก็บรักษาไว้เช่นฟันและกระดูกพบดี ยาง 1997)วิเคราะห์ SSCP ได้ปกครองออกใด ๆ ปนเปื้อนไปด้วยมนุษย์และ tunnid DNAs เนื่องจากพวกเขารูปแบบ SSCP ได้แตกต่างจากของ Tursiops (Figs. 3 และ 4) โพลิมอร์ฟิซึมพบลวิภูมิภาคของ Cytochrome b ภายในต. truncatus ที่เนื้อตัวอย่างแสดงให้เห็นว่าลายไม่ซ้ำกัน ในขณะที่กล้ามเนื้อควบคุมแสดงให้เห็นว่าคนอื่น ๆ หมดบวก (Fig. 3) ตัวอย่าง Tursiops ได้รวบรวมจากภูมิภาคทางภูมิศาสตร์ต่าง ๆ แนะนำที่ โพลิมอร์ฟิซึมนี้อาจเกี่ยวข้องกับการกระจายทางภูมิศาสตร์ เบียดเบียน การทำงานปัจจุบันยืนยันใช้เนื้อผงเป็นแหล่งของดีเอ็นเอพันธุศาสตร์เชิงประชากรโลมา bottlenose การศึกษาอนุกรมวิธาน โดยวิเคราะห์ mtDNA

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทำงานในปัจจุบันแสดงให้เห็นว่ากลุ่มตัวอย่างฟันของปลาโลมาเก็บรักษาไว้ในคอลเลกชันเป็นแหล่งที่ดีของยลดีเอ็นเอสำหรับพันธุศาสตร์ประชากรและการศึกษาอนุกรมวิธาน ผลบวกในการได้รับดีเอ็นเอแสดงให้เห็นว่าการรักษาก่อนของกลุ่มตัวอย่างเลือกสำหรับการปนเปื้อนจากแหล่งภายนอกมีประสิทธิภาพและไม่เกิดความเสียหายโดยสิ้นเชิงไม่ดีเอ็นเอออกจากดีเอ็นเอเพียงพอสำหรับการขยายของภูมิภาคที่น่าสนใจ Rosenbaum, et al (1997) ไม่ประสบความสำเร็จในการได้รับดีเอ็นเอจากแผ่นบาลีหลังจากแช่ค้างคืนในเอทานอลที่แน่นอนตามที่ได้ทำในการทำงานในปัจจุบัน พวกเขาก็สามารถที่จะได้รับดีเอ็นเอเฉพาะเมื่อส่งพวกเขาที่จะทำความสะอาดพื้นผิวที่มีส่วนนี้ ในกรณีที่ฟันดีเอ็นเอเป็นภาษาท้องถิ่นโดยรอบภายในโพรงเยื่อกระดาษดังนั้นมันอาจจะน้อยกว่าที่จะสัมผัสเอทานอล กระบวนการ demineralization เป็นสิ่งจำเป็นเพราะมันเป็นที่คาดว่าสารประกอบแร่มีแนวโน้มที่จะ inibit PCR ซึ่งยังเป็นผู้รับผิดชอบในการดูแลรักษาที่สูงขึ้นของดีเอ็นเอในภูมิภาคนี้ Kiesslich et al, (2002) อธิบายวิธีที่มีประสิทธิภาพและรวดเร็วของการทำให้บริสุทธิ์ดีเอ็นเอจากการใช้ของการฟอกเลือดโดยใช้เยื่อ nitrocellulose โปรโตคอลซิลิกา GUSCN สำหรับการสกัดดีเอ็นเอมีประสิทธิภาพเพื่อวัตถุประสงค์ในปัจจุบันในการสกัดดีเอ็นเอจากเนื้อฟันที่แสดงให้เห็นว่ามันเป็นโปรโตคอลที่ดีสำหรับแม่ยากอย่างที่ได้ระบุไว้ก่อนหน้านี้โดย Hoelzel (1998) เมื่อเร็ว ๆ นี้ผู้เขียนอื่น ๆ ได้ใช้โปรโตคอลสกัดอื่น ๆ เพื่อเป็นส่วนหนึ่งที่เก็บรักษาไว้ของตัวอย่างจากคอลเลกชันเช่นโปร-k สำหรับ lisis, ฟีนอล / คลอโรฟอร์มสำหรับการทำให้บริสุทธิ์และเอทานอลแน่นอนสำหรับการตกตะกอน (Rosenbaum, et al, 1997;. หวานและ Hildebrand 1998 ) และอีกทางเลือกหนึ่งที่ใช้ฟอกไต nitrocelulose สื่อกลางสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ (Kiesslich et al., 2002) ซิลิกา-GUSCN protocole มีความได้เปรียบในการให้ดีเอ็นเอบริสุทธิ์สูง, การขจัดรู้จักและไม่รู้จัก inibitors PCR (HössและPääbo 1993; ยาง, 1997). ไพรเมอร์ที่ใช้ในการขยายยีน 16S rRNA ยลอธิบายโดย Palumbi et al, (1991) ไม่ได้มีประโยชน์สำหรับการได้รับส่วนหนึ่งของยีนนี้ในที truncatus ดังนั้นมันดูเหมือนว่าพวกเขาไม่ได้มีประโยชน์สำหรับสัตว์ที่มีกระดูกสันหลัง ไพรเมอร์เหล่านี้ได้พิสูจน์แล้วว่าเป็นประโยชน์อย่างมากในความหลากหลายของสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง (ที่ Palumbi et al, 1991;. รอว์และ Hilbish, 1995;. pers obs.) ในกรณีของภูมิภาค BDR ของยีน Cytochrome-B ที่ไพรเมอร์ที่ผ่านการทดสอบอธิบายโดย Unseld et al, (1995) สำหรับพื้นที่อนุรักษ์นิยมมากของสายพันธุ์ที่เลี้ยงลูกด้วยนมมีประโยชน์สำหรับการขยายยีนนี้ในที truncatus ส่วนที่ได้รับสำหรับสายพันธุ์นี้ได้ใกล้เคียงกับ 123 bp ขนาดสังเกต tunnids (รูปที่ 1) อัตราผลตอบแทนของผลิตภัณฑ์ PCR ได้โดยเริ่มต้นมีแนวโน้มที่จะเพิ่มขึ้นด้วยปริมาณที่สูงขึ้นของผงเนื้อฟันที่ใช้ในการสกัดดีเอ็นเอ (ดูถดถอยเชิงเส้นในรูป. 2) และไม่มีผลลบของเขาถูกพบเมื่อปริมาณมากกว่า 110 มก. ถูกนำมาใช้ แม้ว่าความสัมพันธ์อยู่ในระดับต่ำมาก (r = 0.492) ระหว่างปริมาณของผงเนื้อฟันที่ใช้ในการสกัดดีเอ็นเอและความเข้มข้นในนาโนกรัม / การไมโครลิตรของส่วนขยายของภูมิภาค BDR ของยีน Cytochrome-B (y = 0.464 + 22.127 x) การถดถอยอย่างมีนัยสำคัญ (p = 0.045) และเมื่อปรับให้ตัดศูนย์ (ที่ไม่มีดีเอ็นเอหมายถึงไม่มีสินค้าขยาย) ความสัมพันธ์เพิ่มขึ้น r = 0.816 เปลี่ยนมันสำคัญมาก (p <0.0001) .Although ปริมาณเพียงพอของดีเอ็นเอถูกสกัด จากฟันแต่ละ PCR ก็ให้ผล nanogrames เพียงไม่กี่หลังขยาย หวานและ Hildebrand (1998) กู้คืนปริมาณดีเอ็นเอที่สกัดได้ถึง 97.5mg จากฟันกรามของมนุษย์สด หลักสูตรนี้ให้ผลตอบแทนสูงก็ประสบความสำเร็จจากเนื้อเยื่อสดของโพรงเยื่อของฟันสกัดเมื่อเร็ว ๆ นี้ หลังจากการตายของเซลล์รอบ ๆ โพรงเยื่อกระดาษได้รับความเดือดร้อนการย่อยสลายสารเคมีที่เกิดจากการกระบวนการ hydrolitic (Lindahl, 1993) และความเสียหาย oxydative (Höss et al., 1996) ซึ่งนำไปสู่ช่องโหว่ห่วงโซ่ทำลายเช่นเดียวกับการกระจายตัวทางกายภาพเนื่องจากกิจกรรม enzimatic โดย แบคทีเรียที่ย่อยดีเอ็นเอ (Yang, 1997) มันได้พิสูจน์แล้วว่าการสลายตัวของดีเอ็นเอเป็นเชิงเส้นและไม่ได้แสดงให้เห็นถึงการสลายอย่างรวดเร็วเริ่มต้นไม่นานหลังจากการเสียชีวิตแสดงให้เห็นหลังจากนั้น "ผลที่ราบสูง" ของที่ลดลงส่วนใหญ่เกิดความเสียหาย (Yang, 1997) ดังนั้นระยะเวลาการชันสูตรศพทันทีเป็นสิ่งสำคัญ ส่วนการเก็บที่ถูกเก็บรักษาไว้ในที่แห้งพบว่ามีระดับที่ต่ำกว่าความเสียหายของดีเอ็นเอ ชิ้นส่วนฮาร์ดตัวอย่างเช่นฟันและกระดูกพบว่ามีดีเอ็นเอที่เก็บรักษาไว้ที่ดีขึ้นซึ่งเป็นผลมาจากการมีปฏิสัมพันธ์กับธัญพืชแร่ (Keil et al., 1994) กับ hydroxypatite (Tuross, 1994) และการปรากฏตัวของสารเคมีที่มีฤทธิ์ยับยั้งการดำเนินการ ของเอนไซม์ที่อาจจะทำให้เสื่อมเสียดีเอ็นเอเช่น tocopherols และ flavonoids (ลินตันโลแกน, 1991; ยาง, 1997). การวิเคราะห์ SSCP อนุญาตให้พิจารณาคดีออกไปปนเปื้อนที่เป็นไปได้ใด ๆ กับดีเอ็นเอของมนุษย์และ tunnid เพราะรูปแบบ SSCP ของพวกเขาแตกต่างจาก Tursiops (มะเดื่อ. 3 และ 4) ความแตกต่างที่ตรวจพบในภูมิภาคของ Cytochrome BDR-B ภายใน T. truncatus ที่ตัวอย่างที่แสดงให้เห็นเนื้อฟันที่ไม่ซ้ำรูปแบบในขณะที่กล้ามเนื้อควบคุมบวกแสดงให้เห็นว่าคนอื่น ๆ ที่แตกต่างกัน (รูปที่. 3) ตัวอย่าง Tursiops ถูกเก็บรวบรวมจากพื้นที่ทางภูมิศาสตร์ที่แตกต่างกันบอกว่าความแตกต่างนี้อาจจะเชื่อมโยงไปสู่ข้อสรุปทาง distribution.In การทำงานในปัจจุบันได้รับการยืนยันความเป็นไปได้ของการใช้ผงเนื้อฟันเป็นแหล่งที่มาของดีเอ็นเอพันธุศาสตร์ประชากรโลมาและการศึกษาอนุกรมวิธานผ่านการวิเคราะห์ mtDNA

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

งานปัจจุบัน พบว่า ฟัน ตัวอย่างของปลาโลมาเก็บรักษาไว้ในคอลเลกชันเป็นแหล่งที่ดีของ mitochondrial DNA พันธุศาสตร์ประชากรและการศึกษาการศึกษา ผลในเชิงบวกในการได้รับดีเอ็นเอ พบว่า กลุ่มตัวอย่างที่ใช้ในการบำบัดสารพิษจากแหล่งภายนอกมีประสิทธิภาพ และไม่ได้เสียหายโดยสิ้นเชิง ดีเอ็นเอออกจากดีเอ็นเอมากพอสำหรับการเพิ่มปริมาณของพื้นที่ที่สนใจ โรเซนบอม et al . ( 1997 ) ไม่ประสบความสำเร็จในการได้รับดีเอ็นเอจากบาลีนแผ่นหลังจากแช่ไว้ค้างคืนแน่นอน เอทานอล ดังที่ทำในงานปัจจุบัน พวกเขาสามารถได้รับ DNA เมื่อยื่นให้ทำความสะอาดผิวหน้าด้วยส่วนนี้ในกรณีของฟันดีเอ็นเอเป็นภาษาท้องถิ่นภายในรอบเยื่อโพรง , ดังนั้นจึงอาจจะไม่สัมผัสกับเอทานอล กระบวนการแร่ธาตุจำเป็น เพราะคาดว่าเป็นสารแร่ มีแนวโน้มที่จะ inibit pcr ที่ต้องรับผิดชอบสูงรักษาดีเอ็นเอในภูมิภาค kiesslich et al .( 2002 ) อธิบายที่มีประสิทธิภาพและรวดเร็ววิธีการบำบัดน้ำเสียโดยการใช้ดีเอ็นเอใช้ไนโตร ไต เยื่อ โปรโตคอล guscn ซิลิกาสำหรับการสกัดดีเอ็นเอให้มีประสิทธิภาพเพื่อสกัดดีเอ็นเอจากฟันปัจจุบันเม็ด แสดงว่า มันเป็นขั้นตอนที่ดีสำหรับแม่แบบยากตามที่ได้ระบุไว้ก่อนหน้านี้ โดย hoelzel ( 1998 ) เมื่อเร็วๆ นี้ผู้เขียนได้ใช้โปรโตคอลอื่น ๆสำหรับการรักษาส่วนของการสกัดตัวอย่างจากคอลเลกชัน เช่น proteinase-k สำหรับ lisis ล / คลอโรฟอร์มและเอทานอลที่บริสุทธิ์ แน่นอนสำหรับการตกตะกอน ( โรเซนบอม et al . , 1997 ; หวานและ ฮิลเดอแบรน , 1998 ) และอีกวิธีหนึ่งคือการใช้ nitrocelulose ) สำหรับฟอกไต ( kiesslich et al . , 2002 )s íไลก้า guscn โพรโทคอลที่มีประโยชน์ให้ดีเอ็นเอสูงบริสุทธิ์ , ขจัดรู้จักและไม่รู้จัก inibitors PCR ( H ö ss และ P ääโบ , 1993 ; ยัง , 1997 ) .

ไพรเมอร์ใช้ amplifying เบส 16S rRNA ยีนไมโทคอนเดรียลอธิบาย โดย palumbi et al . ( จัง ) useful for part การค้าของ gene this in ติดตั้ง truncatus . ดังนั้น ดูเหมือนว่าพวกเขาไม่ได้มีประโยชน์กับกระดูกสันหลังไพรเมอร์เหล่านี้ได้พิสูจน์แล้วว่าเป็นประโยชน์อย่างมากในความหลากหลายของสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง ( palumbi et al . , 1991 ; รอว์สัน และ hilbish , 1995 ; ข่าวสาร ทันอยู่แล้ว ) ในกรณีของ bdr ภูมิภาคของ cytochrome-b ยีน ด้วยการทดสอบที่อธิบายโดย unseld et al . ( 1995 ) สำหรับภูมิภาคอนุรักษ์นิยมมากของสัตว์มีกระดูกสันหลังชนิด มีประโยชน์สำหรับขยายยีนนี้มัก .ส่วนการศึกษาสำหรับชนิดนี้ใกล้เคียงกับ 123 / ขนาด ) tunnids ( ” ) ผลผลิตของผลิตภัณฑ์ PCR เพิ่มขึ้นตามปริมาณที่สูงขึ้นของฟันผงใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ ( เห็นการถดถอยเชิงเส้นในรูปที่ 2 ) และไม่มีผลทางลบ พบว่า เมื่อปริมาณ 110 มิลลิกรัม มากกว่าการใช้ แม้ว่าความสัมพันธ์ต่ำมาก ( r = 0492 ) ระหว่างปริมาณผงซึ่งใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอและความเข้มข้นใน ng / µ L ของ amplified fragment ของ bdr ภูมิภาคของ cytochrome-b ยีน ( Y = 0.464 22.127 x ) , การถดถอยอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ( P = 0.045 ) และเมื่อปรับเพื่อสกัดกั้นของศูนย์ ( ไม่มีดีเอ็นเอ หมายถึงไม่ขยายผลิตภัณฑ์ ) ความสัมพันธ์ ( r = 0.816 เปลี่ยนอย่างมีนัยสำคัญยิ่งทางสถิติ ( P < 0.0001 )แม้ว่าปริมาณเพียงพอของดีเอ็นเอจากฟันแต่ละวิธีก็ให้ผลเพียงไม่กี่หลัง nanogrames ขยาย . หวาน และ ฮิลเดอแบรน ( 1998 ) ปริมาณของการสกัดดีเอ็นเอขึ้น 97.5mg จากฟันกรามมนุษย์สดการกู้คืน ของหลักสูตรนี้เป็นเพียงผลผลิตสูงได้จากเนื้อเยื่อสดจากช่องเยื่อกระดาษที่เพิ่งแยกฟัน หลังจากความตายเซลล์รอบเยื่อโพรงประสบการสลายตัวทางเคมี เนื่องจากกระบวนการ hydrolitic ( ลินดัล , 1993 ) และความเสียหาย oxydative ( H ö ss et al . , 1996 ) ซึ่งนำไปสู่ห่วงโซ่ทำลายช่องโหว่เช่นเดียวกับการกระจายตัวทางกายภาพเนื่องจาก enzimatic กิจกรรมโดยแบคทีเรียที่ย่อยดีเอ็นเอ ( Yang , 1997 ) มันได้พิสูจน์แล้วว่าสลายดีเอ็นเอไม่ได้เป็นเส้นตรง และแสดงการสลายอย่างรวดเร็วเริ่มต้นหลังจากความตายแสดงหลังจากนั้น " ที่ราบสูงผล " ของความเสียหายที่ลดลงส่วนใหญ่ ( Yang , 1997 ) ดังนั้น ระยะเวลาหลังจากการตายทันทีเป็นสําคัญ นาย parts นั้น dry ซ้าย in เตอร์ lower ของ damage ดาวอังคาร . ส่วนที่ยากที่สุดของชิ้นงาน เช่น กระดูกและฟัน พบดีกว่ารักษาดีเอ็นเอ ซึ่งเกิดจากการปฏิสัมพันธ์กับเม็ดแร่ ( ไคล์ et al . , 1994 )กับ hydroxypatite ( tuross , 1994 ) และการปรากฏตัวของสารเคมีที่ยับยั้งการกระทำของเอนไซม์ที่มิฉะนั้นจะทำให้ดีเอ็นเอ เช่น โทโคฟีรอลและสารฟลาโวนอยด์ ( เอกลินเติ้นและโลแกน , 1991 ; ยัง , 1997 ) .

การวิเคราะห์ยีนได้ปกครองออกที่เป็นไปได้ใด ๆเจือปนกับมนุษย์และ tunnid จำเพาะ เพราะรูปแบบยีนของพวกเขา แตกต่างจากบรรดาหัวบาตร ( Figs 3 และ 4 )ไม่มีพบสำหรับ bdr ภูมิภาคของ cytochrome-b ภายในมัก ซึ่งตัวอย่างซึ่งมีรูปแบบเป็นเอกลักษณ์ ในขณะที่กล้ามเนื้อบวกการควบคุมที่แตกต่างกันอื่น ๆแสดง ( รูปที่ 3 ) ตัวอย่างหัวบาตรเก็บมาจากภูมิภาคทางภูมิศาสตร์ที่แตกต่างกัน แนะนำว่า รูปแบบนี้อาจจะเกี่ยวข้องกับการกระจายทางภูมิศาสตร์ สรุป