2. Experimental2.1. Preparation of

2. Experimental
2.1. Preparation of aptamer-functionalized agarose resin

Aptamer functionalized agarose resin was obtained by derivatizing N-hydroxysuccinimide (NHS) activated agaroses according to the manufacturer’s protocol (Pierce, Thermo Scientific, USA). Briefly, the activated agarose resin was charged with aminated Con A aptabody (5′-NH2-CGAGTAACGCTGTCTCTTCCGAATCGGGGGAAGGCGGAGGG-3′) in binding buffer (0.1 M PBS, pH 7.4) to obtain 5 mM aptamer derivatized agarose. Coupling efficiency of aptamer over the activated agarose resin was calculated using UV absorption values of the loaded aptamer solution and the wash-through. Unreacted active-ester groups on agaroses were quenched with 1 M Tris buffer (Tris–HCl, pH 9.0). In control, NHS functionalized aptamer-free Tris-quenched agaroses were used to check the non-aptameric retention of Con A.

2.2. Aptamer-affinity chromatography

A 10% meal was prepared by soaking finely crushed powder of jack bean seeds in 10 mM phosphate buffer, 0.5 M NaCl for overnight at 4 °C. The resulting meal was filtered and the obtained homogenate was centrifuged to collect the supernatant. Collected jack bean seed extract was loaded directly to the prepared aptamer-affinity column and was allowed to bind for 2 h. Then the column was washed extensively with 0.1 M PBS and the column retained proteins were eluted with high salt buffer (1.5 M NaCl in 10 mM Tris, pH 7.0). After desalting the eluent, its total protein and total Con A content were determined using BCA and ELISA assays, respectively.

2.3. Effect of salt concentration on Con A elution

To determine the optimal salt concentration for Con A elution from developed aptamer-affinity chromatography columns, seven 1.5 mL spin columns, each carrying 500 μL of agarose slurry having immobilized aptamer-Con A complexes were loaded with 0.25–2.0 M NaCl solutions in 10 mM Tris–HCl and incubated for 10 min with continuous mixing. Thereafter, the eluted proteins were collected and its UV absorption at 280 nm was measured.

2.4. SDS PAGE and western blot

For SDS PAGE, different amounts of proteins from load and wash through from aptamer-affinity columns were loaded and electrophoresed on 12% denaturing PAGE. The gel was visualized by Coomassie staining. For western blot, an equivalent amount of these proteins were gel separated on 12% SDS PAGE and electroblotted to nitrocellulose. After blocking with 5% BSA, the membrane was probed with Con A-antibody (1:2000) and conjugated secondary antibody (1:5000) in a sequential manner and developed using DAB dye.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. ทดลอง2.1 การเตรียม agarose aptamer functionalized เรซินAptamer functionalized agarose ยางกล่าว โดย derivatizing N-hydroxysuccinimide (NHS) เรียกใช้ agaroses ตามของโพรโทคอล (เพียร์ซ เทอร์โมวิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา) สั้น ๆ ยางเปิด agarose คิดกับ aminated A คอน aptabody (5′-NH2-CGAGTAACGCTGTCTCTTCCGAATCGGGGGAAGGCGGAGGG-3′) ในบัฟเฟอร์รวม (PBS 0.1 M, pH 7.4) รับ agarose aptamer derivatized มม. 5 Coupling ของ aptamer ผ่านเรซิ่น agarose เปิดถูกคำนวณโดยใช้ค่าดูดซับ UV aptamer โหลดโซลูชันและล้างผ่าน กลุ่มใช้งานเอส unreacted agaroses ถูก quenched กับบัฟเฟอร์ทริสเรทติ้ง M 1 (ตรี – HCl, pH 9.0) ในการควบคุม NHS functionalized aptamer ฟรีตรี-quenched agaroses ถูกใช้ในการตรวจคงไม่ใช่ aptameric ของอ.คอน2.2. Aptamer ความสัมพันธ์ chromatographyอาหาร 10% ที่เตรียม โดยการแช่ผงบดประณีตของเมล็ดถั่วแจ็คบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 10 มม. 0.5 M NaCl สำหรับ 4 องศาเซลเซียส อาหารได้ถูกกรอง และ homogenate ได้รับถูก centrifuged supernatant รวบรวม สารสกัดจากเมล็ดถั่วแจ็ครวบรวมถูกโหลดโดยตรงไปยังคอลัมน์เตรียม aptamer ความเกี่ยวข้อง และได้รับอนุญาตให้ผูกสำหรับ 2 h แล้วคอลัมน์ถูกล้างอย่างกว้างขวาง ด้วย PBS 0.1 M และโปรตีนคอลัมน์เก็บได้ eluted กับบัฟเฟอร์เกลือสูง (1.5 M NaCl ใน 10 มม.ตรี pH 7.0) หลังจาก desalting eluent โปรตีนรวมและยอดรวมของเนื้อหาถูกกำหนดโดยใช้ BCA และ ELISA คอน assays ตามลำดับ2.3. ผลของความเข้มข้นเกลือบนคอน A elutionเพื่อกำหนดความเข้มข้นเกลือสูงสุดสำหรับคอน A elution จากคอลัมน์ aptamer-ความสัมพันธ์พัฒนา chromatography, 1.5 mL เจ็ดหมุนคอลัมน์ ละแบก μL 500 ของสารละลาย agarose มีหาสิ่งอำนวยความสะดวกถูกโหลด ด้วย 0.25-2.0 คอน aptamer โซลูชั่น M NaCl ใน 10 มม.ตรี – HCl และ incubated ใน 10 นาทีด้วยการผสมอย่างต่อเนื่อง หลังจากนั้น โปรตีน eluted ถูกเก็บรวบรวม และการดูดซึมของ UV ที่ 280 nm ที่วัด2.4 หน้าองค์กรและคืนในตาตะวันตกหน้า SDS ยอดแตกต่างของโปรตีนจากการผลิตและการล้างผ่านจากคอลัมน์ความสัมพันธ์ aptamer ได้โหลด และ electrophoresed บน denaturing หน้า 12% เจมี visualized โดยย้อมสี Coomassie สำหรับคืนในเวสตา จำนวนเท่าของโปรตีนเหล่านี้ถูกแยก 12% SDS หน้าและ electroblotted ไป nitrocellulose เจล หลังจากบล็อกกับบีเอสเอ 5% เมมเบรนจะถูกพิสูจน์ ด้วยคอน A-แอนติบอดี (1:2000) และกลวงรองแอนติบอดี (1:5000) อย่างต่อเนื่อง แล้วพัฒนาโดยใช้สีย้อมเล็กน้อย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. การทดลอง
2.1 การเตรียมความพร้อมของเรซิน agarose aptamer-ฟังก์ชันaptamer ฟังก์ชันเรซิน agarose ได้มาจาก derivatizing N-hydroxysuccinimide (NHS) เปิดใช้งาน agaroses ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (เพียร์ซ, เทอร์โมวิทยาศาสตร์สหรัฐอเมริกา) สั้น ๆ , เรซิน agarose ใช้งานได้ถูกตั้งข้อหากับ aminated ต่อต้าน aptabody (5'-NH2-CGAGTAACGCTGTCTCTTCCGAATCGGGGGAAGGCGGAGGG-3) ในบัฟเฟอร์ผูกพัน (0.1 M พีบีเอสพีเอช 7.4) เพื่อให้ได้ 5 มิลลิ aptamer derivatized agarose ประสิทธิภาพของการมีเพศสัมพันธ์ในช่วง aptamer เรซิน agarose เปิดใช้งานที่คำนวณโดยใช้ค่าการดูดกลืนรังสียูวีของการแก้ปัญหา aptamer โหลดและล้างผ่าน กลุ่มเอสเตอร์ที่ใช้งาน-unreacted ใน agaroses ถูกดับ 1 กันชน M Tris (Tris-HCl, pH 9.0) ในการควบคุมพลุกพล่านฟังก์ชัน aptamer ฟรี agaroses Tris-ดับถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบการเก็บรักษาที่ไม่ aptameric ของคอน A. 2.2 โค aptamer-สัมพันธ์ที่ใกล้ชิดอาหาร10% ถูกจัดทำขึ้นโดยการแช่ผงบดละเอียดของเมล็ดถั่วแจ็คใน 10 มิลลิฟอสเฟตบัฟเฟอร์, 0.5 M NaCl สำหรับค้างคืนที่ 4 ° C ส่งผลให้อาหารที่ถูกกรองและ homogenate ได้ถูกปั่นในการเก็บรวบรวมใส แจ็คสารสกัดจากเมล็ดถั่วรวบรวมถูกโหลดโดยตรงกับเตรียมคอลัมน์ aptamer-สัมพันธ์ที่ใกล้ชิดและได้รับอนุญาตให้ผูกเป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นคอลัมน์ถูกล้างอย่างกว้างขวางกับ 0.1 M พีบีเอสและคอลัมน์สะสมโปรตีนที่ถูกชะด้วยบัฟเฟอร์เกลือสูง (1.5 M NaCl 10 มิลลิ Tris ค่า pH 7.0) หลังจาก desalting ชะโปรตีนรวมและรวมคอนเนื้อหาได้รับการพิจารณาโดยใช้เก็บกวาดและตรวจ ELISA ตามลำดับ. 2.3 ผลของความเข้มข้นของเกลือในคอนชะการตรวจสอบความเข้มข้นของเกลือที่เหมาะสมสำหรับการต่อต้านชะจากการพัฒนาคอลัมน์โครมา aptamer-ความสัมพันธ์เจ็ด 1.5 ml คอลัมน์หมุนแต่ละคนถือ 500 ไมโครลิตรของสารละลาย agarose มีการตรึง aptamer-Con คอมเพล็กซ์ถูกเต็มไปด้วย 0.25 -2.0 M โซลูชั่นโซเดียมคลอไรด์ใน 10 มิลลิ Tris-HCl และบ่มเป็นเวลา 10 นาทีด้วยการผสมอย่างต่อเนื่อง หลังจากนั้นเป็นต้นมาชะโปรตีนที่ถูกเก็บรวบรวมและการดูดซึมรังสียูวีที่ 280 นาโนเมตรวัด. 2.4 SDS หน้าและดวงตะวันสำหรับSDS หน้าจำนวนที่แตกต่างกันของโปรตีนจากภาระและล้างผ่านจากคอลัมน์ aptamer-ความสัมพันธ์ที่ถูกโหลดและ electrophoresed 12% denaturing หน้า เจลได้รับการมองเห็นโดยการย้อมสี Coomassie สำหรับดวงตะวัน, จำนวนเงินเทียบเท่าของโปรตีนเหล่านี้ถูกแยกออกจากกันในเจล 12% SDS หน้าและ electroblotted เพื่อ nitrocellulose หลังจากที่ปิดกั้นกับบีเอสเอ 5%, เมมเบรนได้รับการตรวจสอบกับ A-Con แอนติบอดี (1: 2000) และแอนติบอดีรองผัน (1: 5000) ในลักษณะที่ต่อเนื่องและการพัฒนาโดยใช้สีย้อมป้าย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . ทดลอง
2.1 . การเตรียม aptamer ที่มีเรซิน

, , aptamer ที่มีเรซิน โดยนำ derivatizing n-hydroxysuccinimide ( NHS ) ใช้งาน agaroses ตามขั้นตอนของผู้ผลิต ( เพียร์ซ , เทอร์โมวิทยาศาสตร์ , USA ) สั้น ๆเปิดใช้งานเรซิน , ถูกเรียกเก็บเงินกับ aminated โกง aptabody ( 5 ’ - ’ nh2-cgagtaacgctgtctcttccgaatcgggggaaggcggaggg-3 ) ในการจับบัฟเฟอร์ ( 0.1 M PBS pH 7.4 ) เพื่อให้ได้ aptamer 5 มม. derivatized โรส . ซึ่งประสิทธิภาพของ aptamer มากกว่างานเรซิน ( คำนวณโดยใช้ค่าการดูดกลืนแสงยูวีของโหลด aptamer โซลูชั่น และล้างผ่านเข้าสู่งาน ester กลุ่ม agaroses ถูกดับด้วยบัฟเฟอร์ต่อ 1 เมตร ( ทริส ) กรดไฮโดรคลอริก pH 9.0 ) ในการควบคุมรัฐบาล ที่มี aptamer บริษัทดับ agaroses ฟรีทดลองใช้ตรวจสอบไม่ aptameric ใน con A .

. . aptamer ขี้รังแค

10 % อาหารที่เตรียมโดยแช่เมล็ดถั่วบดละเอียด ผงของแจ็คในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 10 มิล , 0.5 โมลาร์สำหรับค้างคืนที่ 4 องศาผลคือกรองอาหาร และได้แยกเป็นระดับ เพื่อรวบรวมนำ . รวบรวมสารสกัดจากถั่วพร้าเมล็ดโหลดโดยตรงเพื่อเตรียม aptamer affinity คอลัมน์ และได้รับอนุญาตให้ผูกเป็นเวลา 2 ชั่วโมง แล้วคอลัมน์ล้างอย่างกว้างขวางกับ 0.1 M PBS และคอลัมน์สะสมโปรตีนมีตัวอย่างเกลือ ( NaCl ด้วยบัฟเฟอร์สูง 1.5 เมตรหรือ 10 มม. , pH 7.0 )หลังจาก desalting ส่วนตัวของโปรตีนทั้งหมดและรวม con เนื้อหาตัดสินใจใช้ BCA และ ELISA พบตามลำดับ

2.3 ผลของความเข้มข้นของเกลือต่อ Con A (

เพื่อตรวจสอบความเข้มข้นของเกลือที่ใช้โกงจากการพัฒนา aptamer ขี้รังแคคอลัมน์เจ็ด 1.5 ml ปั่นคอลัมน์แต่ละคนถือ 500 μลิตร ( น้ำมี aptamer ตรึงโกงเชิงซ้อนถูกโหลด ด้วย 0.25 – 2.0 M NaCl 10 มม. นอกจากนี้ โซลูชั่น ( HCl และบ่มเป็นเวลา 10 นาทีอย่างต่อเนื่อง ผสม หลังจากนั้น , การเก็บตัวอย่างโปรตีนและ UV absorption ที่ 280 nm วัด

2.4 . ซีหน้าและ Western blot

สำหรับซีหน้าแตกต่างของปริมาณโปรตีนจากโหลดและล้างผ่านจาก aptamer affinity คอลัมน์โหลด electrophoresed 12 % ี่หน้า เจลคือรับโดยเหล่านี้น่าจะเป็น staining สำหรับ Western blot , เทียบเท่าของโปรตีนเหล่านี้ถูกแยก 12 % SDS เจลหน้าและ electroblotted กับไนโตร . หลังจากการปิดกั้น 5% BSA , เยื่อแผ่นสามารถ กับคอน a-antibody ( 12000 ) และผลิตภัณฑ์ระดับแอนติบอดี ( 1:5000 ) ในลักษณะที่ต่อเนื่องและพัฒนาโดยใช้ป้ายสี