Materials and MethodsMicroorganisms

Materials and Methods
Microorganisms The kefiran-producing lactic acid bacterial
strains used in this study were Lactobacillus kefiranofaciens
JCM 6985 and JCM 7446, and Lactobacillus kefir JCM 5818
and KL-3. For co-cultures with lactic acid bacteria, Saccharomyces
cerevisiae IFO 0216, Candida kefyr IFO 10287 and Torulaspora
delbrueckii IFO 1626 were used as yeast strains isolated
from kefir grain.
Media and culture conditions Lactic acid bacteria were
cultivated usually at 30˚C in a modified MRS medium containing
5–10% lactose, 1% Polypepton (Nippon Seiyaku Co.,
Tokyo), 1% meat extract (Kyokuto Seiyaku Co., Tokyo), 0.5%
yeast extract (Oriental Yeast Co., Osaka), 0.5% sodium acetate,
0.2% ammonium citrate, 0.2% K2HPO4, 0.2% MgSO4
7H2O,
and 0.05% MnSO4
5H2O. The initial pH of the medium was
adjusted to 5.5 unless otherwise noted. The medium was sterilized
by autoclaving at 121˚C for 15 min. Lactic acid bacterial
and yeast cells were precultured statically at 30˚C in test tubes
containing 10 ml of the medium. The precultured cells were separated
by centrifugation at 17,000¥g for 10 min and then inoculated
into a fresh medium at an initial turbidity of about 0.5 at
660 nm.
Lactic acid bacteria were cultivated batchwise in 500 ml
screw-capped medium bottles or a bioreactor (TBR-2, Sakura
Seiki Co., Tokyo) with a working volume of 700 ml. Medium
bottles were used for selecting a high kefiran-producing strain,
and for examining the effects of basal culture conditions (carbon
source, initial pH, temperature, etc.) on cell growth and kefiran
production. When the bioreactor was used, the pH of the medium
was maintained at 5.5 by adding a 4 N-NaOH solution with a
peristaltic pump connected to a pH controller (FC-10, Tokyo
Rikakikai Co., Tokyo). Since the presence of yeast in kefir grains
results in the production of CO2 and ethanol, a mixed gas of N2
and CO2 at a volume ratio of 9:1 or 5:5 was sparged at 0.3 vvm
throughout the fermentation or/and 1 or 2% ethanol was added to
the medium described above to evaluate the effects on kefiran
production. The agitation rate was usually adjusted to 100 rpm.
Preparation and determination of kefiran Extracellular
kefiran was recovered from the culture supernatant and determined.
After centrifuging the culture broth at 17,000¥g for 10
min, kefiran in the supernatant obtained was precipitated by addition
of an equal volume of cold ethanol. The resulting precipitate
was collected by centrifugation at 17,000¥g for 10 min and dissolved
with distilled water in 10% volume of a corresponding
supernatant. The same procedure was repeated three times to
purify the polysaccharides. The amount of kefiran was measured
as total sugar according to the phenol-sulfuric acid method
(Dubois et al., 1956).
Other analytical methods The cell concentration was
determined by measuring the turbidity at 660 nm. The number of
bacterial and yeast cells was counted under a microscope using a
hemocytometer. The supernatant obtained by centrifugation as
described above was analyzed for determination of lactose, glucose,
galactose, sucrose, and lactic acid concentrations. Lactose,
glucose, galactose, and sucrose were determined by HPLC with
a Shim-Pack CLC-101C column and a refractive index detector
(RID-6A; both instruments from Shimadzu Seisakusho Co.,
Kyoto). Distilled water was used as the mobile phase at a flow
rate of 1.0 ml/min at 80˚C. Lactic acid concentration was measured
using an HPLC system for analysis of organic acids; the
system was equipped with a Shim-Pack SCR 102H column and
a conductivity detector (CCD-6A; both from Shimadzu Seisakusho
Co.). Three mM of Bis-Tris solution containing 3 mM ptoluenesulfuric
acid and 100 M EDTA was used as the mobile
phase at a flow rate of 0.8 ml/min at 40˚C.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการแบคทีเรียกรดแลคติกจุลินทรีย์การผลิต kefiranสายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษานี้ได้ kefiranofaciens แลคโตบาซิลลัสJCM 6985 และ JCM 7446 และแลคโตบาซิลลัส kefir JCM 5818และ KL-3 วัฒนธรรมร่วมกับกรดแลคติกแบคทีเรีย Saccharomycescerevisiae IFO 0216, Candida kefyr IFO 10287 และ Torulasporadelbrueckii IFO 1626 ถูกใช้เป็นยีสต์ที่แยกจากเมล็ด kefirสื่อและวัฒนธรรมสภาพแบคทีเรียกรดแลคติก็มักจะปลูกที่ 30˚C ในการแก้ไข MRS ขนาดกลางที่ประกอบด้วยแลคโตส 5-10%, 1% Polypepton (บริษัทนิปปอน Seiyakuโตเกียว), 1% เนื้อแยก (Kyokuto Seiyaku Co. โตเกียว), 0.5%สารสกัดจากยีสต์ (Oriental ยีสต์ Co. โอซาก้า), 0.5% โซเดียมอะซิเตทซิเตรทแอมโมเนีย 0.2%, 0.2% K2HPO4, 0.2% MgSO4 7H2Oและ 0.05% MnSO4 5H2O มีค่า pH เริ่มต้นของสื่อปรับเป็น 5.5 เว้นแต่ระบุ สื่อถูกผ่านการฆ่าเชื้อโดย autoclaving ที่ 121˚C สำหรับ 15 นาทีกรดแลคติกแบคทีเรียและเซลล์ยีสต์ได้ precultured คอนที่ 30˚C ในหลอดทดลองประกอบด้วย 10 มล.ของสื่อ Precultured เซลล์ที่แยกจากกันโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 17,000¥ g 10 นาทีแล้ว inoculatedเป็นสื่อที่มีความขุ่นเริ่มต้นของเกี่ยวกับ 0.5 ที่สด660 nmแบคทีเรียกรดแลคติถูกปลูก batchwise ใน 500 มล.ต่อยอดสกรูขวดขนาดกลางหรือถังปฏิกรณ์ชีวภาพ (TBR-2 ซากุระบริษัทเซอิคิ โตเกียว) ด้วยการทำเสียงของ 700 ml. ขนาดกลางใช้สำหรับเลือกผลิต kefiran เมื่อยสูง ขวดและตรวจสอบผลกระทบของวัฒนธรรมแรกเริ่มเงื่อนไข (คาร์บอนแหล่งที่มา ค่า pH เริ่มต้น อุณหภูมิ ฯลฯ) เซลล์เจริญเติบโตและ kefiranการผลิต เมื่อใช้ในถังปฏิกรณ์ชีวภาพ ค่า pH ของตัวกลางรักษาที่ 5.5 โดยการเพิ่มโซลูชัน N NaOH 4 มีการปั๊ม peristaltic เชื่อมต่อกับตัวควบคุมค่า pH (FC-10 โตเกียวRikakikai Co. โตเกียว) ตั้งแต่การปรากฏตัวของยีสต์ใน kefir ธัญพืชผลผลิตของ CO2 และเอทานอล ก๊าซผสมของ N2และ CO2 อัตราเสียง 9:1 หรือ 5:5 ถูก sparged ที่ 0.3 vvmตลอดการหมัก หรือ / เอทานอล 1 หรือ 2% ลงไปสื่ออธิบายไว้ข้างต้นในการประเมินผล kefiranการผลิต ราคาปั่นป่วนมักจะปรับปรุงถึง 100 รอบต่อนาทีเตรียมความพร้อมและความมุ่งมั่นของ kefiran Extracellularkefiran กู้คืนจาก supernatant วัฒนธรรม และกำหนดหลังจากเหวี่ยงน้ำวัฒนธรรมที่ 17,000¥ g 10นาที kefiran ใน supernatant ได้ถูกตกตะกอนนอกมีปริมาณเท่ากับเอทานอลเย็น ตะกอนเกิดขึ้นรวบรวม โดยหมุนเหวี่ยงที่ 17,000¥ g 10 นาที และละลายด้วยน้ำกลั่นในปริมาณ 10% ของสอดคล้องกันsupernatant กระบวนการเดียวกันซ้ำครั้ง 3 ครั้งให้บริสุทธิ์ไรด์ มีวัดจำนวน kefiranน้ำตาลรวมตามวิธีการกรดกำมะถันฟีนอล(Dubois และ al. 1956)วิธีวิเคราะห์อื่น ๆ ที่มีความเข้มข้นของเซลล์กำหนด โดยการวัดความขุ่นที่ 660 nm จำนวนแบคทีเรียและยีสต์เซลล์ถูกนับภายใต้กล้องจุลทรรศน์ใช้ในhemocytometer Supernatant ได้ โดยการหมุนเหวี่ยงเป็นอธิบายไว้ข้างต้นเป็นวิเคราะห์สำหรับการวัดปริมาณของแลคโตส กลูโคสกาแล็กโทส ซูโครส และกรดแลคติกความเข้มข้น แลคโตสกำหนด โดย HPLC กับกลูโคส กาแล็กโทส และซูโครสคอลัมน์ชุด Shim CLC 101C และเครื่องตรวจจับดัชนีหักเหของแสง(RID-6A ทั้งสองเครื่องจาก บริษัท Shimadzu นิสสันเกียวโต) ใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่การไหลของน้ำกลั่นอัตรา 1.0 มิลลิลิตร/นาทีที่ 80˚C มีวัดความเข้มข้นกรดแลคติกใช้ระบบ HPLC การวิเคราะห์กรดอินทรีย์ การระบบพร้อมกับ SCR Shim ชุด 102H คอลัมน์ และเครื่องตรวจจับการนำไฟฟ้า (CCD-6A ทั้งจากนิสสัน Shimadzuจำกัด) มม.ที่สามของทริสเรทติ้ง Bis ประกอบด้วย 3 มม. ptoluenesulfuricกรดและ 100 M EDTA ใช้เป็นมือถือระยะที่อัตราการไหล 0.8 มิลลิลิตร/นาทีที่ 40 ˚ c

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
จุลินทรีย์คีเฟอรันผลิตแลคติกแบคทีเรียกรด
สายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีแลคโตบาซิลลัส kefiranofaciens
JCM 6985 และ JCM 7446 และแลคโตบาซิลลัส kefir JCM 5818
และ KL-3 สำหรับ CO วัฒนธรรมกับแบคทีเรียกรดแลคติก Saccharomyces
cerevisiae IFO 0216, Candida kefyr IFO 10287 และ Torulaspora
delbrueckii IFO 1626 ถูกนำมาใช้เป็นสายพันธุ์ยีสต์ที่แยกได้
จากข้าว kefir.
สื่อและวัฒนธรรมเงื่อนไขแบคทีเรียกรดแลคติกที่ได้รับ
การปลูกฝังปกติจะอยู่ที่ 30 องศาเซลเซียสในการแก้ไข กลาง MRS ที่มี
แลคโต 5-10%, 1% Polypepton (Nippon Seiyaku Co. ,
โตเกียว), สารสกัดจากเนื้อสัตว์ 1% (Kyokuto Seiyaku Co. , โตเกียว), 0.5%
สารสกัดจากยีสต์ (Oriental ยีสต์ Co. , โอซาก้า), 0.5% โซเดียม อะซิเตท,
0.2% ซิเตรตแอมโมเนียม 0.2% K2HPO4 0.2% MgSO4? 7H2O,
และ 0.05% MnSO4? 5H2O ค่า pH เริ่มต้นของกลางที่ถูก
ปรับ 5.5 ยกเว้นที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น สื่อที่ได้รับการฆ่าเชื้อ
โดยการนึ่งฆ่าเชื้อที่121˚Cนาน 15 นาที กรดแลคติกแบคทีเรีย
และยีสต์เซลล์ถูก precultured แบบคงที่ที่ 30 องศาเซลเซียสในหลอดทดสอบ
บรรจุ 10 มล. ของกลาง เซลล์ precultured ถูกแยกออก
โดยการหมุนเหวี่ยงที่ 17,000 ¥กรัมเป็นเวลา 10 นาทีและจากนั้นเชื้อ
เป็นสื่อสดที่ขุ่นเริ่มต้นประมาณ 0.5 ที่
660 นาโนเมตร.
แบคทีเรียกรดแลคติกได้รับการปลูกฝัง batchwise ใน 500 มล.
ขวดขนาดกลางสกรูปกคลุมหรือถังหมัก ( TBR-2, ซากุระ
Seiki Co. , โตเกียว) มีปริมาณการทำงานของ 700 มล. กลาง
ขวดถูกนำมาใช้สำหรับการเลือกสายพันธุ์คีเฟอรันผลิตสูง
และการตรวจสอบผลกระทบของสภาพพื้นฐานวัฒนธรรม (คาร์บอน
แหล่ง pH เริ่มต้นอุณหภูมิ ฯลฯ ) ต่อการเจริญเติบโตของเซลล์และคีเฟอรัน
ผลิต เมื่อเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพที่ใช้ค่า pH ของกลาง
ได้รับการเก็บรักษาไว้ที่ 5.5 โดยการเพิ่มการแก้ปัญหา N-NaOH 4 กับ
ปั๊ม peristaltic เชื่อมต่อไปยังตัวควบคุมพีเอช (เอฟซี-10 โตเกียว
Rikakikai Co. , โตเกียว) ตั้งแต่การปรากฏตัวของยีสต์ใน kefir ธัญพืช
ผลในการผลิตของ CO2 และเอทานอลก๊าซผสมของ N2
และ CO2 ในอัตราส่วน 9: 1 หรือ 5: 5 ถูก sparged ที่ 0.3 VVM
ทั่วหมักและ / หรือ 1 หรือ 2 % เอทานอลถูกบันทึกอยู่ใน
สื่อที่อธิบายไว้ข้างต้นในการประเมินผลกระทบต่อคีเฟอรัน
ผลิต อัตราการกวนก็มักจะปรับถึง 100 รอบต่อนาที.
เตรียมความพร้อมและความมุ่งมั่นของนอกคีเฟอรัน
คีเฟอรันก็หายจากสารละลายวัฒนธรรมและความมุ่งมั่น.
หลังจากเหวี่ยงน้ำซุปวัฒนธรรมที่ 17,000 ¥กรัมเป็นเวลา 10
นาที, คีเฟอรันในสารละลายที่ได้รับการตกตะกอนโดยการเพิ่ม
ของ ปริมาณที่เท่ากันของเอทานอลเย็น ตะกอนที่เกิดขึ้น
ได้รับการเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 17,000 ¥กรัมเป็นเวลา 10 นาทีและละลาย
ด้วยน้ำกลั่นในปริมาณ 10% ของที่สอดคล้อง
ใส ขั้นตอนเดียวกันซ้ำสามครั้งเพื่อ
ชำระล้าง polysaccharides ปริมาณของคีเฟอรันที่ได้รับการวัด
เป็นน้ำตาลทั้งหมดเป็นไปตามฟีนอลซัลฟูริกกรดวิธี
(บัว et al., 1956).
วิธีการวิเคราะห์อื่น ๆ ความเข้มข้นของเซลล์ที่ถูก
กำหนดโดยการวัดความขุ่นที่ 660 นาโนเมตร จำนวนของ
เซลล์แบคทีเรียและยีสต์นับภายใต้กล้องจุลทรรศน์ใช้
hemocytometer สารละลายที่ได้จากการหมุนเหวี่ยงเป็น
อธิบายไว้ข้างต้นได้รับการวิเคราะห์หาปริมาณแลคโตสกลูโคส
กาแลคโตซูโครสและความเข้มข้นของกรดแลคติก แลคโตส
กลูโคสกาแลคโตและซูโครสถูกกำหนดโดยวิธี HPLC กับ
คอลัมน์ชิมแพ็ค CLC-101C และเครื่องตรวจจับดัชนีหักเห
(RID-6A; เครื่องมือทั้งจาก Shimadzu Seisakusho Co. ,
เกียวโต) น้ำกลั่นถูกใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่ในการไหล
อัตรา 1.0 มล. / นาทีที่ 80C ความเข้มข้นของกรดแลคติกที่ได้รับการวัด
โดยใช้ระบบ HPLC สำหรับการวิเคราะห์ของกรดอินทรีย์
ระบบพร้อมกับคอลัมน์ชิมแพ็ค SCR 102H และ
เครื่องตรวจจับการนำ (CCD-6A; ทั้งจาก Shimadzu Seisakusho
จำกัด ) สามมิลลิเมตร Bis-Tris วิธีการแก้ปัญหาที่มี 3 mm ptoluenesulfuric
กรดและ 100 M EDTA ถูกใช้เป็นมือถือ
เฟสที่อัตราการไหล 0.8 มล. / นาทีที่ 40C

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการจุลินทรีย์ผลิตกรดแลคติกแบคทีเรียคีเฟอแรนสายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษา คือ แลคโตบาซิลัส kefiranofaciensและ jcm 6985 jcm 7446 และ Lactobacillus kefir jcm 5818และ kl-3 . สำหรับ Co วัฒนธรรมด้วยแบคทีเรียกรดแลคติกและโดย Ifo 0216 Candida kefyr IFO และ 10287 torulasporadelbrueckii IFO ด้วยถูกใช้เป็นสายพันธุ์ยีสต์ที่แยกได้จากคีเฟอร์เกรนสื่อและวัฒนธรรมเงื่อนไขปริมาณเชื้อแลคติกแอซิดแบคทีเรียการปลูกมักจะอยู่ที่ 30 ˚ C ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีการแก้ไข .5 – 10% นม 1% polypepton ไซยากุ ( นิปปอน จำกัดโตเกียว ) 1 % สารสกัดจากเนื้อ ( kyokuto ไซยากุ Co . , โตเกียว ) , 0.5 เปอร์เซ็นต์สารสกัดจากยีสต์ ( yeast ตะวันออกจำกัด โอซาก้า ) , 0.5 % โซเดียมอะซีเตท0.2% แอมโมเนียมซิเตรท 0.2 % k2hpo4 mgso47h2o 0.2% ,และ 0.05 % mnso45h2o . พีเอชเริ่มต้นของอาหารปรับ 5.5 เว้นแต่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น สื่อถูกฆ่าเชื้อโดยอัตราส่วนโฟกัสที่ 121 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที ˚แลคติกแอซิดแบคทีเรียและเซลล์ยีสต์อยู่ด้วย˚ 1949 ที่ 30 องศาเซลเซียส ในหลอดทดลองบรรจุ 10 ml ของตัวกลาง การแยกเซลล์ ( 1949โดยการปั่นเหวี่ยงที่ 17 , 000 ¥กรัมเป็นเวลา 10 นาทีจากนั้นเชื้อเป็นสื่อที่สดมีความขุ่นเริ่มต้นประมาณ 0.5 ใน660 นาโนเมตรแบคทีเรียกรดแล็กติกปลูก batchwise 500 มล.สกรูฝาครอบขวดขนาดกลางหรือขนาด ( tbr-2 , ซากุระSeiki Co . , โตเกียว ) กับปริมาณการทำงานของขนาด 700 มล.ขวดที่ใช้สำหรับการเลือกสายพันธุ์สูง การผลิตคีเฟอแรน ,และสำหรับการตรวจสอบผลกระทบของเงื่อนไขวัฒนธรรมพื้นฐาน ( คาร์บอนแหล่งที่มา พีเอชเริ่มต้น อุณหภูมิ ฯลฯ ) ในการเจริญเติบโตของเซลล์และคีเฟอแรนการผลิต เมื่อเครื่องถูกใช้ พีเอชของกลางไว้ที่ 5.5 โดยการเพิ่มโซลูชั่น 4 n-naoh กับปั๊ม peristaltic เชื่อมต่อกับเครื่องควบคุมค่าพีเอช ( fc-10 โตเกียวrikakikai Co . , โตเกียว ) เนื่องจากการปรากฏตัวของยีสต์ใน kefir ธัญพืชผลลัพธ์ในการผลิต CO2 และ เอธานอล ก๊าซผสมของไนโตรเจนและ CO2 ที่ปริมาณอัตราส่วน 9 : 1 หรือ 5 : 5 คือ sparged ที่ 0.3 การให้ตลอดกระบวนการหมัก หรือ / และ เอทานอล 1 หรือ 2 % เพิ่มสื่อที่อธิบายไว้ข้างต้นเพื่อประเมินผลต่อคีเฟอแรนการผลิต อัตราการกวน 100 รอบต่อนาที คือการปรับมักจะ .การเตรียมการและการกำหนดและคีเฟอแรนคีเฟอแรนก็หายจากวัฒนธรรมน่านและมุ่งมั่นหลังจากสารวัฒนธรรมซุปที่ 17 , 000 ¥ G 10มินคีเฟอแรนที่นำโดยเติมได้มาตกตะกอนของปริมาณเท่ากันของเย็น เอทานอล เกิดตกตะกอนเก็บข้อมูลโดยการเหวี่ยงแยกที่ 17 , 000 ¥กรัมเป็นเวลา 10 นาทีและละลายด้วยน้ำกลั่นใน 10% ของปริมาณที่สอดคล้องกันน่าน . ขั้นตอนเดียวกันทำซ้ำ 3 ครั้งบริสุทธิ์โดย . จํานวนวัดคีเฟอแรนและน้ำตาลทั้งหมดตามวิธีฟีนอลเป็นกรดซัลฟูริก( บัว et al . , 1956 )วิธีการวิเคราะห์ความเข้มข้นเซลล์อื่น ๆกำหนดโดยการวัดความขุ่นที่ 660 นาโนเมตร หมายเลขของแบคทีเรียและยีสต์เซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้น.hemocytometer . และน่านได้โดยการเหวี่ยงแยกเป็นอธิบายไว้ข้างต้นเป็นข้อมูลสำหรับการหาปริมาณแลคโตส กลูโคสกาแลกโตส ซูโครส และกรดเข้มข้น แลคโตสกลูโคส กาแลกโทส และวิเคราะห์โดย HPLC กับน้ำตาลซูโครสคอลัมน์ ซิมแพ็ค clc-101c และตรวจจับดัชนีหักเห( rid-6a ทั้งสองชนิดจาก seisakusho Shimadzu Co . ,เกียวโต ) น้ำกลั่นที่ใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่ที่ไหลอัตรา 1.0 มิลลิลิตร / นาทีที่ 80 องศาเซลเซียส ความเข้มข้นของกรดแลคติก˚วัดโดยใช้ HPLC ระบบการวิเคราะห์กรดอินทรีย์ ;ระบบที่ถูกติดตั้ง ด้วย ซิมแพ็ค SCR 102h คอลัมน์มีการนำเครื่องตรวจจับ ( ccd-6a ; ทั้งจาก Shimadzu seisakushoบริษัท ) สามเดือนทวิ หรือสารละลายที่มี ptoluenesulfuric 3 มม.กรดและ 100 M EDTA ใช้เป็นมือถือระยะที่อัตราการ ไหลของ 0.8 มิลลิลิตร / นาทีที่ 40 ˚ C