Confirmation of CNS Identity. A cru

Confirmation of CNS Identity. A crude DNA preparation was made for all isolates from milk and for a random selection of 4 isolates per environmental sample with dissimilar colony morphology and pigmentation. A few fresh colonies were suspended in 45 μL of sterile HPLC water plus 5 μL of lysostaphin (1 mg/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) and incubated at 37°C for 10 min. Next, 150 μL of Tris-HCl (0.1 M, pH 8.0) plus 5 μL of proteinase K (2.5 mg/mL; Promega Corporation, Madison, WI) were added, and the suspensions were incubated at 60°C for 10 min followed by 90°C for 5 min. Cell lysates were vortexed for 1 min, centrifuged at 14,000 × g for 1 min, and kept at −20°C until further use. To confirm the isolates as Staphylococcus species and to overrule S. aureus identity, a duplex PCR was performed. Two primer pairs described previously by Mason et al. (2001) were used, the first pair targeting the Staphylococcus genus-specific 16S rRNA gene (fragment of 791 bp) and the second primer pair targeting the S. aureus-specific clfA gene (fragment of 638 bp). The PCR was performed in a 25-μL reaction mixture containing 1 μL of cell lysate, 50 pmol of each primer (Eurogentec, San Diego, CA), 1 × PCR buffer II (Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.5 mM MgCl2, 0.1 mmol of each dNTP, and 1 U of AmpliTaq Polymerase (Applied Biosystems). Thermal cycling conditions were 1 min at 95°C, 30 cycles of 15 s at 95°C, 15 s annealing at 60°C, and 30 s elongation at 72°C, and a final elongation step at 72°C for 8 min. Fragments were analyzed by electrophoresis on 1.5% (wt/vol) agarose gels. In each executed PCR run, a positive S. aureus control (S. aureus ssp. aureus DSM 20231T), a positive CNS control (S. auricularis ATCC 33753T), and a negative control (water) were co-analyzed.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การยืนยันตัวตนของ CNS ทำการเตรียมดีเอ็นเอน้ำมัน สำหรับทั้งหมดที่แยกได้จากน้ำนม และการเลือกสุ่ม 4 แยกต่อตัวอย่างสิ่งแวดล้อมสัณฐานวิทยาของโคโลนี่ไม่เหมือนกับผิวคล้ำ อาณานิคมกี่สดถูกหยุดชั่วคราวใน μL 45 กอซ HPLC น้ำบวก 5 μL ของ lysostaphin (1 mg/mL Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) และ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ 10 นาที ถัดไป μL 150 ของทริสเรทติ้ง HCl (0.1 M ค่า pH 8.0) บวก μL 5 ของ proteinase K (2.5 mg/mL บริษัท Promega เมดิสัน WI) เพิ่ม และบริการมี incubated ที่ 60 ° C สำหรับ 10 นาทีตาม ด้วย 90 ° C สำหรับ 5 นาทีเซลล์ lysates ได้ vortexed ใน 1 นาที centrifuged ที่ 14000 × g ใน 1 นาที และเก็บไว้ที่ −20 ° C จนกระทั่งใช้ต่อไป แยกเป็นชนิด Staphylococcus ยืนยัน และยกเลิกรหัสประจำตัวหมอเทศข้างลาย S., PCR สองที่ดำเนินการ คู่รองพื้นสองที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Mason et al. (2001) ใช้ การกำหนดเป้าหมาย Staphylococcus เฉพาะสกุล 16S rRNA ยีนคู่แรก (ส่วนของ 791 bp) และคู่รองพื้นสองที่กำหนดเป้าหมายยีนเฉพาะหมอเทศข้างลาย clfA S. (ส่วนของ 638 bp) PCR มีดำเนินการในส่วนผสมปฏิกิริยา 25-μL ประกอบด้วย μL 1 ของเซลล์ lysate, 50 pmol แต่ละพื้น (Eurogentec, San Diego, CA) 1 การ PCR กันชน II (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA), 1.5 มม. MgCl2, 0.1 mmol dNTP แต่ละ และ 1 U ของ AmpliTaq พอลิเมอเรส (Biosystems ใช้) สภาพความร้อนขี่ได้ 1 นาทีที่ 95° C, 30 รอบ 15 s ที่ 95° C, 15 s การอบเหนียวที่ 60° C และ 30 s elongation ที่ 72° C และขั้นตอนสุดท้าย elongation ที่ 72° C สำหรับการกระจายตัวต่ำสุด 8 ได้วิเคราะห์ โดย electrophoresis บน agarose 1.5% (wt/vol) ในแต่ละปฏิบัติการ PCR รัน บวก S. หมอเทศข้างลายควบคุม (S. หมอเทศข้างลาย ssp. หมอเทศข้างลาย DSM 20231T), ตัวควบคุม CNS บวก (S. auricularis ATCC 33753T), และควบคุมค่าลบ (น้ำ) ได้ร่วมวิเคราะห์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ยืนยัน CNS เอกลักษณ์ เตรียมดีเอ็นเอน้ำมันดิบถูกสร้างขึ้นมาสำหรับทุกแยกได้จากนมและสำหรับการสุ่มเลือกจาก 4 แยกต่อตัวอย่างสิ่งแวดล้อมที่มีสัณฐานโลกที่แตกต่างกันและผิวคล้ำ อาณานิคมสดเพียงไม่กี่คนที่ลอยอยู่ใน 45 ไมโครลิตรน้ำ HPLC หมันบวก 5 ไมโครลิตรของ lysostaphin (1 mg / ml; Sigma-Aldrich, เซนต์หลุยส์) และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ถัดไป 150 ไมโครลิตรของ Tris-HCl (0.1 M, ค่า pH 8.0) บวก 5 ไมโครลิตรของโปร K (2.5 mg / ml; Promega คอร์ปอเรชั่น Madison, WI) ได้รับการเพิ่มและสารแขวนลอยบ่มที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีตาม 90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที lysates เซลล์ได้รับการ vortex เวลา 1 นาที, หมุนเหวี่ยงที่ 14,000 ×กรัมเป็นเวลา 1 นาทีและเก็บไว้ที่ -20 องศาเซลเซียสจนกว่าจะใช้งานต่อไป เพื่อยืนยันเชื้อเป็นสายพันธุ์เชื้อ Staphylococcus และจะลบล้างเอกลักษณ์ของเชื้อ S. aureus, PCR เพล็กซ์ที่ได้ดำเนินการ สองคู่ไพรเมอร์ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยเมสันและคณะ (2001) ถูกนำมาใช้คู่แรกการกำหนดเป้​​าหมายประเภทเฉพาะ 16S rRNA Staphylococcus ยีน (ส่วนของ 791 bp) และคู่ไพรเมอร์ที่สองการกำหนดเป้​​าหมาย S. aureus ยีนเฉพาะ clfA (ส่วนของ 638 bp) PCR ได้รับการดำเนินการในการผสมปฏิกิริยา 25 ไมโครลิตรมี 1 ไมโครลิตรของ lysate เซลล์ 50 pmol ของแต่ละไพร (Eurogentec, ซานดิเอโก), 1 ×บัฟเฟอร์ PCR II (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี้, CA) 1.5 มิลลิ MgCl2 0.1 mmol ของ dNTP ในแต่ละครั้งและ 1 U ของ AmpliTaq (Polymerase Applied Biosystems) เงื่อนไขการขี่จักรยานการระบายความร้อนเป็นเวลา 1 นาทีที่ 95 ° C, 30 รอบ 15 วินาทีที่ 95 ° C, 15 วินาทีการอบที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียสและ 30 วินาทีการยืดตัวที่ 72 ° C และขั้นตอนการยืดตัวสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 8 นาที . ชิ้นส่วนนำมาวิเคราะห์โดยกระแสไฟฟ้า 1.5% (น้ำหนัก / ปริมาตร) เจล agarose ในแต่ละดำเนินการ PCR วิ่งบวก S. aureus ควบคุม (เชื้อ S. aureus เอสเอส. aureus DSM 20231T) บวกการควบคุมระบบประสาทส่วนกลาง (เอส auricularis ATCC 33753T) และควบคุมเชิงลบ (น้ำ) ได้ร่วมวิเคราะห์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ของ คมช. ยืนยันตัวตน การเตรียมดีเอ็นเอหยาบทำทั้งหมดที่แยกได้จากน้ำนมและการสุ่มเลือกจาก 4 แยกกลุ่มตัวอย่างต่อสิ่งแวดล้อมกับสัณฐานโคโลนีแตกต่างกันและการย้อมสี เป็นอาณานิคมสดไม่กี่ถูกระงับใน 45 μผมเป็นหมันของ HPLC น้ำบวก 5 μ L ของไลโซ ตฟิน ( 1 mg / ml ; ซิกม่า Aldrich St . Louis , MO ) บ่มที่ 37 ° C 10 นาทีถัดไป150 μ L ของบริษัท ( 0.1 M HCl , pH 8.0 ) บวก 5 μ l โปร K ( 2.5 มก. / มล. ; promega Corporation , Madison , WI ) ถูกเพิ่มและสารแขวนลอยอุณหภูมิ 60 องศา C นาน 10 นาที ตามด้วย 90 ° C เป็นเวลา 5 นาที เซลล์ lysates เป็น vortexed เป็นเวลา 1 นาที ระดับที่ 10 ×กรัม ต่อ 1 นาที และ 20 ° C ถึง−เก็บไว้ใช้ต่อไป เพื่อยืนยันว่าเป็นเชื้อชนิด และเพื่อลบล้าง .( ตัวตน , Duplex PCR คือการ สองคู่ไพรเมอร์ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยเมสัน et al . ( 2001 ) ถูกใช้ไป คู่แรก เป้าหมายแบคทีเรียสกุลเฉพาะเบส 16S rRNA ยีน ( ส่วนของที่ BP ) และสองคู่คู่ลดลง S . aureus เฉพาะ clfa ยีน ( ส่วนของคุณ BP ) ร่วมแสดงใน 25 - μ L ปฏิกิริยาผสมที่ประกอบด้วย 1 μ l lysate เซลล์ ,50 pmol ของแต่ละสี ( eurogentec , San Diego , CA ) 1 × PCR buffer 2 ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ ( CA ) , 1.5 mm ชุด 0.1 มิลลิโมลของแต่ละ dntp และ 1 U ของ amplitaq Polymerase ( Applied Biosystems ) เงื่อนไขการขี่จักรยานการระบายความร้อนเป็น 1 นาทีที่ 95 องศา C 30 รอบ 15 s ที่ 95 องศา C , 15 วินาที annealing ที่ 60 ° C และ 30 S ยืดที่ 72 ° C , และสุดท้ายการก้าวที่ 72 ° C เป็นเวลา 8 นาทีชิ้นส่วนถูกวิเคราะห์โดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีสบน 1.5 เปอร์เซ็นต์ ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) , เจล ในการเรียกใช้แต่ละเทคนิคเชิงบวก , S . aureus ควบคุม ( S . aureus ssp . 20231t ( DSM ) การควบคุมระบบประสาทส่วนกลางบวก ( S . auricularis ATCC 33753t ) และควบคุม ( น้ำ ) ลบร่วมวิเคราะห์