Materials and methodsIsolate collec

Materials and methods
Isolate collection
Samples were collected from plants in commercial wheat fields naturally infected with Septoria tritici blotch across the state of Kansas during the 2004/05 growing season. All samples were collected in a two day period providing a snap shot of the population at a particular point in time. Samples were placed in paper coin envelopes, dried at room temperature, and stored at 4°C until evaluated.
Collections were made representing three different spatial scales: micro-plot, macro-plot, and statewide. Micro and macro-plot populations were collected in; Cloud, Ellis, and Marion counties. Micro-plots were 1-m2 quadrats established ~ 25 m from the edge of a field. All visible lesions within the micro-plot were sampled. Macro-plot samples were taken from the fields in which the micro-plots occurred. Fields varied in size by location but were > 10 ha. At least 60 isolates were obtained from each of the macro-plots with the average distance between isolate collection points of ~ 10 m. An additional 155 isolates was obtained from other randomly selected fields across the state of Kansas. The cultivar present in the Cloud county field was Tomahawk (highly susceptible to Septoria tritici blotch). The wheat cultivar in the fields from which all of the other samples were taken was unknown.
DNA isolation
Wheat leaves with Septoria tritici blotch lesions were placed on wet filter paper at room temperature (20-25°C) for 24 hours. A cirrus from a single pycnidium per lesion was transferred to a Petri dish containing one-fourth strength PDA (0.6% potato dextrose broth, 1.5% agar) and then streaked across the agar surface with a sterile, glass rod to separate individual spores. Plates were incubated for 2 days at room temperature. Colonies originating from a single spore were transferred to liquid YG medium (2% glucose, 0.5% yeast extract) and incubated at 20°C on an orbital shaker (180 rpm) for 5 to 10 days. Isolates did not grow uniformly either in speed or form, e.g. mycelia or budding spores, but all were consistent with in vitro cultures of known S. tritici isolates. The resulting cultures were concentrated by centrifugation and stored at -80°C until DNA extraction.
DNA was isolated by a cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) procedure as described by Murray and Thompson (22) modified by Kerényi et al. (13). Extracted DNA was resuspended in 50 to 100 μl of 1× Tris-EDTA buffer and stored at -20°C until used. DNA concentrations were determined by using an ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).
AFLP methodology
AFLPs were generated essentially using the method described by Vos et al. (32) as modified by Zeller et al. (35). DNA was digested to completion with EcoRI and MseI. Standard protocols (28) and manufacturers’ recommendations were followed in the use of all buffers and DNA modifying enzymes. Ten primer pair combinations were screened for optimal polymorphisms and three of these primer pairs were used to generate AFLPs for all isolates (Table 1). The selected primer pair combinations were; Eco+AC/Mse+CA, Eco+AC/Mse+CC, and Eco+AC/Mse+GG. The EcoRI primer used for the selective amplifications was end-labeled with γ33P-ATP, and the amplification products separated in denaturing 6%
2
polyacrylamide (Long Ranger, FMC Scientific, Rockland, ME) gels in 1× Tris-borate EDTA buffer. Gels were run at a constant power of 100 W using a Sequi-Gen GT sequencing cell (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA), dried, and exposed to autoradiography film (Classic Blue Sensitive, Molecular Technologies, St. Louis) for 2 days. A γ33P-labeled 100-bp molecular ladder was used to estimate band sizes on polyacrylamide gels.
All AFLP bands in the 100-1000 bp range were scored manually for presence or absence and data recorded in a binary matrix. Fragments with the same molecular size were assumed to be homologous. Bands that differed in size were treated as independent loci with two alleles (presence or absence). Occasionally, due to poor amplification, unclear bands were observed and subsequently scored as ambiguous in the ensuing population genetic analyses. In order to ensure the repeatability of the AFLP results, DNAs of four known isolates of M. graminicola were extracted and included in all the gels as described previously. Bands generated from these four isolates were also used as reference in determining homology.
Population genetic analyses
The CLUSTER procedure of SAS (SAS Institute, Cary, NC) using the Dice coefficient of similarity and the unweighted pair grouping by mathematical averages (UPGMA) subroutine of PAUP* version 4.10b (31) were used to identify AFLP haplotypes, and to determine genetic similarity among isolates. This analysis was conducted for populations from each of the three locations studied, as well as for the entire pool of isolates. Haplotypes were defined as isolates sharing ≥ 98% of the bands present. Samples were “clone censored” and only one representative of each haplotype was used in the remaining analyses.
The shareware program Popgene version 1.32 (Molecular Biology and Biotechnology Center, University of Alberta, Edmonton, Canada) was used to calculate the fixation index (GST) (23). The migration rate (Nm) [Nm = 0.5(1 - GST)/GST (16)], allele frequencies and genetic diversity within and between populations as described by Nei (23), and genetic identity among populations as described by Nei (24) were also calculated using Popgene. Data were analyzed using the haploid, dominant marker subroutines. Estimates of the fixation index (GST) and migration rate (Nm) were calculated for the complete set of loci and for a subset of loci in which the frequency of both alleles was ≥ 5%. This was to determine if rare alleles altered the analyses. Estimates of linkage disequilibrium were calculated with Popgene for the subset of loci in which the frequency of both alleles was ≥ 5%.
Results
Population structure and haplotype distribution
126 isolates of M. graminicola were recovered from the three micro-plots (Cloud: 43, Ellis: 40, and Marion: 43), 195 isolates from the three macro-plots (Cloud: 69, Ellis: 64, and Marion: 62), and 155 isolates from the rest of the state. There were 174 scorable AFLP markers, 168 of which were polymorphic in at least one population (Table 1). The average similarity of isolates from a micro-plot population was 58%, with a minimum similarity of 29%. Average similarities of isolates from the macro-plot and statewide populations were 62% and 57%, with minimum similarities of 30% and 25%, respectively.
Haplotype diversity was determined from these populations utilizing a pool of 174 loci, and haplotypes were defined as isolates that shared at least 98% UPGMA means similarity in AFLP banding pattern. Genotypic diversity was high (100%) in all populations, with all 476 isolates showing unique AFLP haplotypes. No identical haplotypes were found in any of the populations tested including the micro-plots (Table 2). Identical haplotypes only occurred if isolates were collected within the same lesion (data not shown).
3

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการแยกชุดตัวอย่างที่เก็บจากพืชในทางการค้าข้าวสาลีธรรมชาติติดเชื้อ Septoria tritici แผลทั่วรัฐแคนซัสระหว่างฤดูกาล 2004/05 เติบโต ตัวอย่างทั้งหมดถูกรวบรวมในรอบระยะเวลาสองวันให้ไก snap ของประชากรจุดหนึ่ง ๆ ในเวลา ตัวอย่างถูกเก็บไว้ในซองเหรียญกระดาษ อบแห้งที่อุณหภูมิห้อง และจัดเก็บที่ 4° C จนกว่าจะมีประเมินคอลเลกชันทำแทนสามระดับพื้นที่แตกต่างกัน: ไมโครพล็อต แมโครพล็อต และ statewide ไมโครและแผนแมประชากรถูกเก็บรวบรวมใน เขตเมฆ เอลลิส และทันสมัย ไมโครผืนได้ก่อตั้ง quadrats 1 m2 ~ 25 เมตรจากขอบของเขตข้อมูล ได้มองเห็นได้ทั้งหมดภายในไมโครพล็อตที่มีความ ตัวอย่างแมโครพล็อตที่ได้มาจากฟิลด์ไมโครผืนเกิดขึ้น ฟิลด์ขนาดโดยสถานที่แตกต่างกัน แต่ถูก > 10 ฮา น้อย 60 แยกได้รับจากผืนแมกับระยะห่างเฉลี่ยระหว่างจุดรวบรวมแยก ~ 10 เมตร 155 การเติมแยกได้ถูกรับจากเขตข้อมูลที่เลือกแบบสุ่มในรัฐแคนซัส โทมาฮอว์ก (สูงสามารถไวต่อได้กับแผล tritici Septoria) cultivar ในฟิลด์เขตเมฆได้ ไม่รู้จัก cultivar ข้าวสาลีในเขตข้อมูลซึ่งตัวอย่างทั้งหมดที่ถ่ายได้แยกดีเอ็นเอข้าวสาลีเหลือ Septoria tritici สกปรกได้ถูกวางไว้บนกระดาษกรองเปียกที่อุณหภูมิห้อง (20-25° C) 24 ชั่วโมง รัสจาก pycnidium เดียวต่อแผลถูกโอนย้ายไปจานเพาะเชื้อประกอบด้วยแรงหนึ่งส่วนสี่ PDA (ซุปขึ้นมันฝรั่ง 0.6%, 1.5% agar) และลายแล้ว ข้ามผิว agar กับร็อดแก้วผ่านการฆ่าเชื้อ แยกเพาะเฟิร์นแต่ละ แผ่นก็ incubated 2 วันที่อุณหภูมิห้อง อาณานิคมที่เกิดจากสปอร์เดียวถูกโอนย้ายไปกลาง YG เหลว (กลูโคส 2% สารสกัดจากยีสต์ 0.5%) และ incubated ที่ 20° C ในการเชคเกอร์ของวงโคจร (180 รอบต่อนาที) 5-10 วัน แยกได้ไม่เติบโตสม่ำเสมอเมื่อเทียบเคียง ในความเร็วสูงหรือแบบฟอร์ม เพาะเฟิร์นที่ mycelia หรือโตเช่น แต่ทั้งหมดก็สอดคล้องกับวัฒนธรรมการเพาะเลี้ยงของ S. รู้จักแยก tritici วัฒนธรรมผลลัพธ์เข้มข้น โดย centrifugation และเก็บไว้ที่-80 ° C จนสกัดดีเอ็นเอดีเอ็นเอแยกต่างหาก โดยขั้นตอน cetyltrimethylammonium โบรไมด์ (CTAB) ตามที่อธิบายไว้ โดยเมอร์เรย์และทอมป์สัน (22) แก้ไขโดย Kerényi et al. (13) แยกดีเอ็นเอ resuspended ใน μl 50-100 × 1 ทริสเรทติ้ง EDTA บัฟเฟอร์ และเก็บที่-20 ° C จนกว่าจะใช้ ความเข้มข้นของดีเอ็นเอถูกกำหนด โดยใช้เครื่องทดสอบกรดด่างเป็น ND-1000 (เทคโนโลยี NanoDrop วิลมิ เดอ)วิธี AFLPAFLPs มีสร้างหลักโดยใช้วิธีอธิบายโดย Vos et al. (32) แก้ไขโดย Zeller et al. (35) ดีเอ็นเอที่ต้องการเสร็จสมบูรณ์ด้วย EcoRI และ MseI โพรโทคอลมาตรฐาน (28) และคำแนะนำของผู้ผลิตก็ตามในการใช้ข้อมูลและปรับเปลี่ยนเอนไซม์ดีเอ็นเอทั้งหมด ชุดคู่รองพื้น 10 ถูกฉายสำหรับ polymorphisms เหมาะสมที่สุด และสามคู่พื้นเหล่านี้ถูกใช้เพื่อสร้าง AFLPs สำหรับทั้งหมดที่แยกได้ (ตารางที่ 1) ชุดคู่รองพื้นเลือกได้ สิ่งแวดล้อม + AC / Mse + CA, Eco + AC / Mse + CC และสิ่งแวดล้อม + AC / Mse + GG พื้น EcoRI ใช้สำหรับ amplifications ใช้เป็นป้ายสุดท้ายกับ γ33P ATP และผลิตภัณฑ์ขยายแยก denaturing 6%2เจ polyacrylamide (ยาว Ranger, FMC วิทยาศาสตร์ Rockland, ME) ใน 1 ×ทริสเรทติ้ง borate EDTA บัฟเฟอร์ เจถูกเรียกใช้ในพลังงานคงที่ 100 W ที่ใช้ GT Sequi Gen ลำดับเซลล์ (Bio Rad ห้องปฏิบัติการ Inc. เฮอร์คิวลิส แคลิฟอร์เนีย), แห้ง และสัมผัสกับฟิล์ม autoradiography (คลาสสิกสีฟ้าสำคัญ เทคโนโลยีระดับโมเลกุล St. Louis) 2 วัน ป้าย γ33P 100 bp โมเลกุลบันไดที่ใช้ประเมินขนาดวงบน polyacrylamide gelsแถบ AFLP ทั้งหมดใน 100-1000 bp ช่วงได้คะแนนด้วยตนเองสถานะ หรือการขาดงาน และข้อมูลที่บันทึกในเมทริกซ์ฐานสอง ชิ้นส่วน มีขนาดโมเลกุลเดียวกันได้ถือว่าเป็น homologous วงดนตรีที่แตกต่างขนาดได้รับการรักษาเป็น loci อิสระมี 2 alleles (หรือ) บางครั้ง เนื่องจากขยายดี วงชัดเจนสังเกต และทำคะแนนมาเป็นที่ชัดเจนในการวิเคราะห์การพันธุกรรมประชากรเพราะการ เพื่อให้การทำซ้ำในผล AFLP, DNAs ของสี่รู้จักแยกของ M. graminicola ถูกแยก และรวมอยู่ในเจทั้งหมดที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ วงดนตรีที่สร้างขึ้นจากแยกสี่เหล่านี้ก็ยังใช้อ้างอิงในการกำหนด homologyวิเคราะห์พันธุกรรมของประชากรขั้นตอนของคลัสเตอร์ของ SAS (SAS สถาบัน แครีแกรนต์ NC) โดยใช้สัมประสิทธิ์ลูกเต๋าคล้ายและคู่ unweighted ที่จัดกลุ่มค่าเฉลี่ยคณิตศาสตร์ (UPGMA) subroutine ของ PAUP * รุ่น 4.10b (31) ใช้ระบุ AFLP haplotypes และตรวจสอบความคล้ายคลึงกันทางพันธุกรรมระหว่างแยก วิเคราะห์นี้ถูกดำเนินการสำหรับประชากรจากสามสถานที่ศึกษา เป็นอย่างดีสำหรับสระว่ายน้ำทั้งหมดของแยก Haplotypes ถูกกำหนดเป็นแยกร่วม≥ 98% ของวงอยู่ ตัวอย่าง "โคลน censored" และแต่ละ haplotype เดียวถึงถูกใช้ในการวิเคราะห์เหลือโปรแกรม shareware Popgene รุ่น 1.32 (อณูชีววิทยาและเทคโนโลยีชีวภาพ ศูนย์มหาวิทยาลัยเบอร์ เอ็ดมันตัน แคนาดา) ถูกใช้ในการคำนวณดัชนีเบี (GST) (23) อัตราการย้าย (Nm) [Nm = 0.5(1-GST)/GST (16)], ความถี่ของ allele และความหลากหลายทางพันธุกรรมภายใน และ ระหว่างกลุ่มประชากรตามที่อธิบายไว้ โดย Nei (23), เอกลักษณ์ทางพันธุกรรมในประชากรตามที่อธิบายไว้ โดย Nei (24) ยังคำนวณได้โดยใช้ Popgene มีวิเคราะห์ข้อมูลใช้ subroutines haploid ตัวเครื่อง มีคำนวณประเมินดัชนีเบี (GST) และอัตราการโยกย้าย (Nm) สำหรับชุดสมบูรณ์ของ loci และ สำหรับชุดย่อยของ loci ที่ความถี่ของ alleles ทั้งถูก≥ 5% นี้คือการกำหนดถ้า alleles ยากวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลง มีคำนวณประเมิน disequilibrium เชื่อมโยงกับ Popgene สำหรับชุดย่อยของ loci ที่ความถี่ของ alleles ทั้งถูก≥ 5%ผลลัพธ์การกระจายประชากรโครงสร้างและ haplotypeแยก M. graminicola 126 ได้กู้คืนจากไมโครผืนสาม (เมฆ: 43 เอลลิส: 40 และมารี: 43), 195 แยกจากสามแมผืน (เมฆ: 69 เอลลิส: 64 และมารี: 62), และ 155 แยกจากส่วนเหลือของรัฐ มี 174 scorable AFLP เครื่องหมาย 168 ที่มี polymorphic ประชากรน้อย (ตารางที่ 1) เฉลี่ยเฉพาะแยกจากประชากรไมโครพล็อตได้ 58% มีความคล้ายคลึงกันต่ำสุด 29% เฉลี่ยความเหมือนของแยกจากแมโครพล็อตและประชากร statewide มี 62% และ 57% มีความคล้ายคลึงอย่างน้อย 30% และ 25% ตามลำดับกำหนด Haplotype ความหลากหลายจากประชากรเหล่านี้ใช้พู 174 loci และ haplotypes กำหนดไว้เป็นแยกที่ใช้ร่วมกันน้อย 98% UPGMA หมายถึง คล้ายใน AFLP แถบลวดลาย ความหลากหลายของจีโนไทป์ได้สูง (100%) ในกลุ่มประชากรทั้งหมด มีทั้งหมด 476 แยกแสดงเฉพาะ AFLP haplotypes Haplotypes ไม่เหมือนพบในประชากรการทดสอบรวมถึงไมโครผืน (ตาราง 2) Haplotypes เหมือนเกิดขึ้นถ้าแยกได้ถูกรวบรวมภายในแผลเดียวกัน (ข้อมูลไม่แสดง)3

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการแยกการเก็บรวบรวมเก็บตัวอย่างจากพืชในทุ่งข้าวสาลีในเชิงพาณิชย์ที่มีการติดเชื้อตามธรรมชาติSeptoria tritici ตุ่มทั่วทั้งรัฐแคนซัสในช่วงฤดูปลูก 2004/05 ตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บไว้ในระยะเวลาสองวันให้สแน็ปช็ของประชากรที่จุดโดยเฉพาะอย่างยิ่งในเวลาที่ ตัวอย่างถูกวางไว้ในซองจดหมายเหรียญกระดาษแห้งที่อุณหภูมิห้องและเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสจนการประเมิน. คอลเลกชันที่ถูกสร้างขึ้นเป็นตัวแทนของสามเกล็ดเชิงพื้นที่ที่แตกต่างกัน: ไมโครพล็อตมหภาคพล็อตและโจเซฟ ไมโครและประชากรมหภาคพล็อตถูกเก็บไว้ใน; เมฆเอลลิสและมณฑลแมเรียน Micro-แปลงเป็นกรอบ 1 m2 จัดตั้งขึ้น ~ 25 เมตรจากขอบของเขตข้อมูล แผลที่มองเห็นทั้งหมดในพล็อตขนาดเล็กได้รับการเก็บตัวอย่าง ตัวอย่างแมโครพล็อตที่ถูกนำมาจากสาขาซึ่งในแปลงขนาดเล็กที่เกิดขึ้น เขตข้อมูลที่แตกต่างกันในขนาดตามสถานที่ แต่> 10 ฮ่า อย่างน้อย 60 สายพันธุ์ที่ได้รับจากแต่ละแปลงแมโครที่มีระยะทางเฉลี่ยระหว่างจุดแยกของคอลเลกชัน ~ 10 เมตร เพิ่มอีก 155 สายพันธุ์ที่ได้รับจากสาขาอื่น ๆ สุ่มเลือกข้ามรัฐแคนซัส พันธุ์อยู่ในเขตเขตเมฆเป็น Tomahawk (สูงไวต่อการ Septoria tritici ตุ่ม) พันธุ์ข้าวสาลีในสาขาที่ทั้งหมดของตัวอย่างอื่น ๆ ที่ถูกนำมาเป็นที่รู้จัก. การแยกดีเอ็นเอข้าวสาลีใบที่มีรอยโรค Septoria tritici ตุ่มถูกวางไว้บนกระดาษกรองเปียกที่อุณหภูมิห้อง (20-25 ° C) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ขนจาก pycnidium เดียวต่อแผลถูกโอนไปยังจานเลี้ยงเชื้อที่มีความแข็งแรงหนึ่งในสี่ PDA (0.6% เดกซ์โทรสน้ำซุปมันฝรั่งวุ้น 1.5%) และจากนั้นลายบนพื้นผิววุ้นที่มีการฆ่าเชื้อ, ก้านแก้วจะแยกสปอร์ของแต่ละบุคคล แผ่นถูกบ่มเป็นเวลา 2 วันที่อุณหภูมิห้อง อาณานิคมที่มาจากสปอร์เดียวถูกย้ายไปของเหลวกลาง YG (กลูโคส 2%, สารสกัดจากยีสต์ 0.5%) และบ่มที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียสบนเครื่องปั่นโคจร (180 รอบต่อนาที) เป็นเวลา 5 ถึง 10 วัน แยกไม่ได้เติบโตอย่างสม่ำเสมอทั้งในความเร็วหรือรูปแบบเช่นเส้นใยหรือสปอร์รุ่น แต่ทั้งหมดมีความสอดคล้องกับวัฒนธรรมในหลอดทดลองที่รู้จักเอสไอโซเลท tritici วัฒนธรรมที่ส่งผลให้มีความเข้มข้นโดยการหมุนเหวี่ยงและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสจนถึงการสกัดดีเอ็นเอ. ดีเอ็นเอที่แยกได้โดย cetyltrimethylammonium โบรไมด์ (CTAB) ขั้นตอนตามที่อธิบายไว้โดยเมอร์เรและ ธ อมป์สัน (22) การแก้ไขโดย Kerenyi et al, (13) ดีเอ็นเอที่สกัดได้ resuspended ใน 50-100 ไมโครลิตร 1 ×บัฟเฟอร์ Tris-EDTA และเก็บไว้ที่ -20 ° C จนใช้ ความเข้มข้นของดีเอ็นเอได้รับการพิจารณาโดยใช้ spectrophotometer ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). วิธีการ AFLP AFLPs ถูกสร้างขึ้นเป็นหลักโดยใช้วิธีการอธิบายโดย Vos et al, (32) ในขณะที่การแก้ไขโดยเซลเลอร์และอัล (35) ดีเอ็นเอย่อยที่จะเสร็จสิ้นด้วย EcoRI และ MseI โปรโตคอลมาตรฐาน (28) และข้อเสนอแนะของผู้ผลิตที่ถูกใช้ในการใช้งานของบัฟเฟอร์และการปรับเปลี่ยนดีเอ็นเอเอนไซม์ สิบชุดคู่ไพรเมอร์ที่ได้รับการคัดกรองความหลากหลายที่ดีที่สุดและสามของคู่ไพรเมอร์เหล่านี้ถูกนำมาใช้ในการสร้าง AFLPs สำหรับทุกไอโซเลท (ตารางที่ 1) ชุดคู่ไพรเมอร์ที่เลือกได้; Eco + AC / Mse + CA, Eco + AC / Mse CC + และ Eco + AC / Mse + GG ไพรเมอร์ EcoRI ใช้สำหรับเครื่องขยายเสียงที่เลือกได้แบบ end-กำกับด้วยγ33P-เอทีพีและผลิตภัณฑ์ขยายแยก denaturing 6% 2 อะคริเลต (Long แรนเจอร์, เอฟเอ็มวิทยาศาสตร์ร็อกแลนด์, ME) เจลใน 1 ×บัฟเฟอร์ EDTA Tris-borate เจลได้รับการทำงานที่ต่อเนื่องของการใช้พลังงาน 100 วัตต์ใช้ที่จะปฏิบัติตาม Gen-GT เซลล์ลำดับ (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad, Inc ดาว CA) แห้งและสัมผัสกับภาพยนตร์ autoradiography (คลาสสิกสีฟ้าที่มีความสำคัญโมเลกุล Technologies, เซนต์หลุยส์ ) เป็นเวลา 2 วัน γ33Pติดฉลาก 100 bp บันไดโมเลกุลถูกนำมาใช้ในการประมาณการขนาดวงในเจลอะคริเลต. วงดนตรีทั้งหมด AFLP อยู่ในช่วง 100-1,000 bp ถูกยิงด้วยตนเองสำหรับการมีหรือไม่มีข้อมูลที่บันทึกไว้ในเมทริกซ์ไบนารี ชิ้นส่วนที่มีขนาดโมเลกุลเดียวกันได้รับการสันนิษฐานว่าจะเป็นคล้ายคลึงกัน วงดนตรีที่แตกต่างกันในขนาดที่ได้รับการรักษาตำแหน่งเป็นอิสระที่มีสองอัลลีล (มีหรือไม่มี) บางครั้งเนื่องจากการขยายยากจนวงดนตรีที่ไม่มีความชัดเจนถูกตั้งข้อสังเกตและให้คะแนนต่อมาเป็นที่คลุมเครือในประชากรที่ตามมาวิเคราะห์ลักษณะทางพันธุกรรม เพื่อให้แน่ใจว่าการทำซ้ำของผลการ AFLP ที่ DNAs สี่สายพันธุ์ที่รู้จักกันของเอ็ม graminicola ถูกสกัดและรวมอยู่ในเจลทั้งหมดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ วงดนตรีที่เกิดจากทั้งสี่สายพันธุ์นอกจากนี้ยังถูกนำมาใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงในการกำหนดที่คล้ายคลึงกัน. ประชากรทางพันธุกรรมการวิเคราะห์ขั้นตอนคลัสเตอร์ของ SAS (SAS Institute, แครี, NC) โดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์ลูกเต๋าของความคล้ายคลึงกันและการจัดกลุ่มคู่ชั่งโดยเฉลี่ยทางคณิตศาสตร์ (UPGMA) ย่อยของ PAUP * 4.10b รุ่น (31) ถูกนำมาใช้เพื่อระบุ haplotypes AFLP และเพื่อตรวจสอบความคล้ายคลึงกันทางพันธุกรรมของสายพันธุ์ การวิเคราะห์นี้ได้ดำเนินการสำหรับประชากรจากแต่ละสามสถานศึกษาเช่นเดียวกับสระว่ายน้ำทั้งของเชื้อ haplotypes ถูกกำหนดให้เป็นสายพันธุ์ที่ใช้ร่วมกัน≥ 98% ของวงดนตรีในปัจจุบัน ตัวอย่าง "โคลนเซ็นเซอร์" และมีเพียงหนึ่งตัวแทนของ haplotype แต่ละคนถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ที่เหลือ. โปรแกรมแชร์แว Popgene รุ่น 1.32 (อณูชีววิทยาและศูนย์เทคโนโลยีชีวภาพมหาวิทยาลัยอัลเบอร์ตาเอดมันตันแคนาดา) ถูกนำมาใช้ในการคำนวณดัชนีตรึง (GST ) (23) อัตราการย้ายถิ่น (นิวตันเมตร) [นิวตันเมตร = 0.5 (1 - จีเอสที) / GST (16)] ความถี่อัลลีลและความหลากหลายทางพันธุกรรมภายในและระหว่างประชากรตามที่อธิบาย Nei (23), และเอกลักษณ์ทางพันธุกรรมของประชากรตามที่อธิบาย Nei (24 ) จะถูกคำนวณยังมีการใช้ Popgene วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้เดี่ยว, ซับรูทีนเครื่องหมายที่โดดเด่น การประเมินดัชนีตรึง (GST) และอัตราการย้ายถิ่น (นิวตันเมตร) จะถูกคำนวณสำหรับชุดที่สมบูรณ์ของตำแหน่งและเป็นส่วนหนึ่งของตำแหน่งที่ความถี่ของอัลลีลทั้งเป็น≥ 5% นี่คือการตรวจสอบว่าอัลลีลที่หายากมีการเปลี่ยนแปลงการวิเคราะห์ การประเมินสมดุลการเชื่อมโยงจะถูกคำนวณกับ Popgene สำหรับย่อยของตำแหน่งที่ความถี่ของอัลลีลทั้งเป็น≥ 5%. ผลโครงสร้างประชากรและการกระจาย haplotype 126 ไอโซเลทเอ็ม graminicola หายจากสามแปลงไมโคร (Cloud: 43, เอลลิส: 40 และแมเรียน: 43) 195 แยกจากสามแปลงแมโคร (Cloud: 69 เอลลิส: 64 และแมเรียน: 62) และ 155 แยกจากส่วนที่เหลือของรัฐ มีอยู่ 174 scorable เครื่องหมาย AFLP 168 ซึ่งเป็น polymorphic อย่างน้อยหนึ่งประชากร (ตารางที่ 1) ความคล้ายคลึงกันของเชื้อเฉลี่ยจากประชากรไมโครพล็อตเป็น 58% ที่มีความคล้ายคลึงกันไม่ต่ำกว่า 29% ความคล้ายคลึงกันเฉลี่ยของเชื้อจากมหภาคพล็อตและประชากรโจเซฟเป็น 62% และ 57% โดยมีความคล้ายคลึงกันอย่างน้อย 30% และ 25% ตามลำดับ. haplotype หลากหลายถูกกำหนดจากประชากรเหล่านี้ใช้สระว่ายน้ำ 174 ตำแหน่งและ haplotypes ถูกกำหนดให้เป็น แยกที่ใช้ร่วมกันอย่างน้อย 98% UPGMA หมายถึงความคล้ายคลึงกันในรูปแบบแถบ AFLP ความหลากหลายทางพันธุกรรมสูง (100%) ในประชากรทั้งหมดที่มีทั้งหมด 476 แยกแสดง haplotypes AFLP ที่ไม่ซ้ำกัน ไม่มี haplotypes เหมือนที่พบในใด ๆ ของประชากรการทดสอบรวมทั้งแปลงขนาดเล็ก (ตารางที่ 2) haplotypes เหมือนกันเพียง แต่เกิดขึ้นถ้าสายพันธุ์ที่ถูกเก็บรวบรวมภายในแผลเหมือนกัน (ไม่ได้แสดงข้อมูล). 3

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการเก็บรวบรวมตัวอย่าง

แยกจากพืชในธรรมชาติติดเขตข้าวสาลีพาณิชย์ septoria tritici ตุ่มในรัฐแคนซัสใน 2004 / 05 มหาธาตุ ตัวอย่างทั้งหมดจะถูกเก็บในวันสองวัน ระยะเวลาให้ snap shot ของประชากรที่จุดใดในเวลา ตัวอย่างเหรียญอยู่ในซองกระดาษแห้งที่อุณหภูมิห้อง และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศา C จนกระทั่งประเมิน
คอลเลกชันาแทนสามระดับ พื้นที่ที่แตกต่างกัน : ไมโครพล็อต , พล็อต , แมโคร และมลรัฐ จุลภาคและมหภาคประชากรวางแผนเก็บตัว ; เมฆ เอลลิส และมาเรียน มณฑล ไมโคร 1-m2 แปลงเป็นตารางสี่เหลี่ยมขึ้น ~ 25 เมตร จากขอบสนาม มองเห็นรอยโรคภายในแปลงขนาดเล็กจำนวน .ตัวอย่างแผนมาโครถ่ายจากเขตข้อมูลที่แปลง Micro เกิดขึ้น สาขาที่แตกต่างกันในขนาดตั้งแต่ 10 ฮา อย่างน้อย 60 ไอโซเลทที่ได้จากแต่ละแห่งมาโครแปลงระยะทางเฉลี่ยระหว่างแยกจุดคอลเลกชันของ ~ 10 เมตร เพิ่มอีก 155 แยกได้จากการสุ่มเลือกเขตข้อมูลอื่น ๆในรัฐแคนซัสพันธุ์ปัจจุบันในมณฑลเมฆสนามโทมาฮอว์ก ( สูงเสี่ยงต่อการ septoria tritici ตุ่ม ) ข้าวสาลีที่ปลูกในเขต ซึ่งทั้งหมดของตัวอย่างอื่น ๆถูกไม่รู้จัก ข้าวสาลี การแยกดีเอ็นเอด้วย

ใบ septoria tritici รอยแผลไว้ให้เปียกกระดาษกรองที่อุณหภูมิห้อง ( 20-25 องศา C ) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงเป็นเสียงสวดจากเดียวพิกนีเดียมต่อการบาดเจ็บถูกส่งไปจานเพาะเชื้อที่มีหนึ่งในสี่แรง PDA ( 0.6% Potato Dextrose Broth , 1.5% วุ้น ) แล้ว ลายบนผิววุ้นกับหมัน , แท่งแก้วแยกสปอร์ของแต่ละบุคคล จานถูกบ่มเป็นเวลา 2 วัน ที่อุณหภูมิห้อง อาณานิคมที่เกิดจากสปอร์เดี่ยวโอนกลาง YG ของเหลว ( กลูโคส 2 % 0สารสกัดจากยีสต์ 5 % ) และบ่มที่อุณหภูมิ 20 ° C ในเครื่องปั่นโคจร ( 180 รอบต่อนาที ) สำหรับ 5 ถึง 10 วัน ไอโซเลตไม่เติบโตอย่างสม่ำเสมอทั้งในความเร็วหรือรูปแบบเช่นเส้นใยหรือสปอร์แตกหน่อ แต่ทั้งหมดที่สอดคล้องกับวัฒนธรรมของการ tritici รู้จักเอสของเชื้อ ส่งผลให้วัฒนธรรมมีความเข้มข้นโดยการเหวี่ยงแยกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ - 80 องศา C ถึงการสกัดดีเอ็นเอ .
ดีเอ็นเอที่แยกได้โดย cetyltrimethylammonium โบรไมด์ ( ctab ) ขั้นตอนอธิบายโดย เมอร์เรย์ และ ทอมป์สัน ( 22 ) แก้ไขโดย Ker éงี่ et al . ( 13 ) สกัดดีเอ็นเอ resuspended 50 ถึง 100 μ L 1 ×ทริส EDTA บัฟเฟอร์ และเก็บไว้ที่ - 20 ° C จนใช้ ดีเอ็นเอ ) ซึ่งใช้ nd-1000 Spectrophotometer ( เทคโนโลยี nanodrop Wilmington , DE )

เทคนิควิธีการaflps ถูกสร้างขึ้นเป็นหลักโดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้โดยคุณ et al . ( 32 ) แก้ไขโดยเซล et al . ( 35 ) ดีเอ็นเอย่อยให้สมบูรณ์ด้วย EcoRI และ msei . โปรโตคอลมาตรฐาน ( 28 ) และผู้ผลิตแนะนำดังนี้ในการใช้บัฟเฟอร์ทั้งหมด และใช้เอนไซม์ดีเอ็นเอสิบคู่ผสมรองพื้นจากพันธุ์ที่เหมาะสมและ 3 คู่ไพรเมอร์เหล่านี้ถูกใช้ในการสร้าง aflps ทุกสายพันธุ์ ( ตารางที่ 1 ) เลือกรองพื้นคู่ผสม คือ โค AC / MSE CA , Eco AC / MSE CC , และ Eco AC / MSE GG . ชิ้นส่วนที่ใช้สำหรับการเลือกรองพื้น amplifications คือจบข้อความด้วยγ 33p-atp และผลิตภัณฑ์โดยการเพิ่มแยกี่ %
2
6อะคริลาไมด์ ( ยาวเรนเจอร์ FMC ทางวิทยาศาสตร์ รอก ฉัน ) เจล 1 ×โดย EDTA บอเรตบัฟเฟอร์ เจลเป็นวิ่งที่พลังงานคงที่ 100 W ใช้ sequi Gen GT จัดลำดับเซลล์ ( ไบโอ ราด Laboratories , Inc , Hercules , CA ) , แห้ง , และสัมผัสกับเก้าอี้รับแขกภาพยนตร์คลาสสิก ( สีฟ้าอ่อน โมเลกุลเทคโนโลยี , St . Louis ) 2 วันเป็นγ 33p ติดป้าย 100 BP โมเลกุล บันไดก็ใช้ขนาดประมาณวง polyacrylamide เจล .
วงเอเอฟทั้งหมดในช่วง 100-1 , 000 เครื่อง BP คะแนนด้วยตนเองสำหรับการแสดงตนหรือขาด และบันทึกข้อมูลในแบบไบนารี ชิ้นส่วนที่มีขนาดโมเลกุลเดียวกันสมมติให้ฟังก์ชัน . เป็นวงดนตรีที่แตกต่างกันในขนาดและถือว่าเป็นรูปแบบอิสระกับสองอัลลีล ( การแสดงตนหรือขาด )บางครั้ง เนื่องจากการสื่อสารไม่ดี วงไม่ชัดเจน พบว่ามี 14 คะแนนที่คลุมเครือในต่อมาวิเคราะห์พันธุกรรมประชากร เพื่อให้แน่ใจว่าการเติบโตของเอเอฟสี่รู้จักผลจำเพาะเชื้อ M . graminicola สกัดและรวมอยู่ในเจลตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้วงดนตรีที่สร้างขึ้นจากทั้ง 4 ไอโซเลทสามารถใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงในการกำหนดลำดับ . วิเคราะห์พันธุกรรมประชากร

กลุ่มกระบวนการของ SAS ( SAS Institute , แครี่ , NC ) โดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์ความเหมือนและคู่ของลูกเต๋าถ่วงน้ำหนักการจัดกลุ่มโดยค่าเฉลี่ยทางคณิตศาสตร์ ( UPGMA ) subroutine ของ 4.10b รุ่นยาจก * ( 31 ) ถูกใช้เพื่อระบุเทคนิคผล ,และเพื่อตรวจสอบความเหมือนของพันธุกรรมของเชื้อ การวิเคราะห์นี้มีวัตถุประสงค์สำหรับประชากรจากแต่ละสามสถานศึกษา รวมทั้งทั้งสระของเชื้อ ผลการ≥แยกกำหนดเป็น 98% ของวงปัจจุบัน จำนวน " โคลน เซ็นเซอร์ " และเพียงหนึ่งตัวแทนของแต่ละพบถูกใช้ในการวิเคราะห์
ที่เหลือโปรแกรมแชร์แวร์ popgene รุ่น 1.32 ( ศูนย์เทคโนโลยีชีวภาพและชีววิทยาโมเลกุลมหาวิทยาลัย Alberta , Edmonton , แคนาดา ) ถูกใช้ในการคำนวณดัชนีการตรึง ( GST ) ( 23 ) อัตราการย้ายถิ่น ( nm ) [ nm = 0.5 ( 1 - GST ) / GST ( 16 ) ] , ความถี่และความหลากหลายทางพันธุกรรมภายในและระหว่างประชากร ตามที่อธิบายไว้โดยเนย ( 23 )และพันธุกรรมของตนในหมู่ประชากร ตามที่อธิบายไว้โดยเนย ( 24 ) ถูกคำนวณโดยใช้ popgene . วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้โครโมโซม , เด่นเครื่องหมายรูทีนย่อย . ประมาณการดัชนีการตรึง ( GST ) และอัตราการย้ายถิ่น ( nm ) ได้ให้ชุดสมบูรณ์ของรูปแบบและเป็นเซตย่อยของตำแหน่งที่ความถี่ของอัลลีลทั้งสองถูก≥ 5%นี้เพื่อกำหนดถ้าอัลลีลที่หายากการเปลี่ยนแปลงองค์ประกอบ ประมาณการของการเชื่อมโยงการเก็บน้ำได้ด้วย popgene สำหรับย่อยของตำแหน่งที่ความถี่ของอัลลีลทั้งสองถูก≥ 5% ผล


และการกระจายโครงสร้างประชากรพบ 126 จำนวนม. graminicola หายจากสามไมโครแปลง ( เมฆ : 43 , เอลลิส : 40 และแมเรียน : 43 )ที่แยกจากสามแปลงแมโคร ( เมฆ : 69 , เอลลิส : 64 และแมเรียน : 62 ) และ 155 แยกจากส่วนที่เหลือของรัฐ มีคน scorable AFLP markers , 168 ซึ่งมีจำนวนอย่างน้อยหนึ่งคน ( ตารางที่ 1 ) มีความคล้ายคลึงกันของสายพันธุ์จากประชากรแปลง Micro เป็น 58% มีความคล้ายคลึงกันอย่างน้อยร้อยละ 29ความคล้ายคลึงกันเฉลี่ยที่แยกได้จากประชากรทั่วแปลงแมโครและเป็น 62 และ 57% มีความคล้ายคลึงกันอย่างน้อย 30% และ 25% ตามลำดับ พิจารณาจากประชากร
ความหลากหลายพบเหล่านี้ใช้สระหรือสถานะและผลกำหนดเป็นไอโซเลทที่ใช้ร่วมกันอย่างน้อย 98% UPGMA หมายถึงความเหมือนในรูปแบบแถบ AFLP .ความหลากหลายทางพันธุกรรมสูง ( 100% ) ในประชากรทั้งหมดที่มีทั้งหมดแล้วแยกแสดงผลทดสอบที่ไม่ซ้ำกัน ไม่มีผลเหมือนกัน พบในใด ๆของประชากรทดสอบรวมทั้งแปลง Micro ( ตารางที่ 2 ) แฮปเหมือนกันถ้าแยกที่เกิดขึ้นเฉพาะในการเก็บรวบรวมภายในแผลเดียวกัน ( ข้อมูลไม่แสดง ) .
3