plates (Nunc, Roskilde, Denmark). I

plates (Nunc, Roskilde, Denmark). Individual peptides were
added to a final concentration of 20 g/ml per well and incubated
for 10 days at 37 ◦C, 5% CO2 in humidified air. RhIL-2
(Proleukin; Chiron, The Netherlands) 20 U/ml was added
on day 1. Cells were harvested on day 10, washed twice in
RPMI-1640 and resuspended in complete medium to a final
concentration of 1×106 cells/ml.
The IFN- ELISPOT assay was performed as described
previously [18] to quantify peptide-specific CTLs after in
vitro expansion. Briefly, 96-well ELISPOT plates (Multiscreen,
MAHAS4510; Millipore, Molsheim, France) were
coated overnight at 4 ◦C with 7.5 g/ml anti-human IFN-
 (M-700A, Endogen; Pierce Biotechnology, Rockford, IL,
USA). The plates were washed six times with sterile phosphate
buffered saline (PBS) to remove unbound coating
antibody. Cell suspensions were prepared and four to six
replicate wells were seeded with 105 cells per well. Peptides
were added in a final concentration of 10 g/ml. As
positive controls, cells were stimulated with 10 g/ml phytohaemaglutinin
(PHA) (Sigma-Aldrich, UK). Cells were
incubated with complete medium alone as negative control.
After incubation for 18–20 h at 37 ◦C and 5% CO2,
plates were washed with PBS containing 0.05% Tween-20.
Biotinylated antihuman IFN- (M-701B, Endogen; Pierce
Biotechnology, Rockford, IL, USA) was added at 0.75g/ml
and plates were incubated for 2 h at room temperature. After
incubation, plates were washed and incubated further for
1 h with streptavidin-conjugated peroxidase (Dako, Copenhagen,
Denmark) diluted 1:500 in PBS/1% BSA. Next, the
plates were washed as before and 200 l of substrate [30 mg
4-chloro-1-naphthol (057h8927, Sigma) dissolved in 10 ml
methanol, diluted in 50 ml triethanol-buffered H2O (T1377,
Sigma) at pH 7.5 and 25 l H2O2 30% (H1009, Sigma)] were
added to the wells. Finally, plates werewashed under running
tap water and dried at room temperature. IFN- spot-forming
cells (SFC) were enumerated using an ELISPOT reader (KS
ELISpot, Zeiss, Munich, Germany).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แผ่น (Nunc รอสกิลด์ เดนมาร์ก) เปปไทด์แต่ละตัวได้เพิ่มเพื่อความเข้มข้นสุดท้ายของ 20 กรัม/มิลลิลิตรต่อดี และได้รับการกก10 วันที่ 37 ◦C, 5% CO2 ในอากาศณอุณหภูมิ RhIL-2(Proleukin Chiron เนเธอร์แลนด์) เพิ่ม 20 U/mlในวันที่ 1 เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวในวันที่ 10 ล้างสองครั้งในRPMI 1640 และ resuspended ในกลางที่สมบูรณ์สุดท้ายความเข้มข้นของ 1 × 106 เซลล์/มล.ทำการทดสอบ IFN - ELISPOT ดังที่ก่อนหน้านี้ [18] เพื่อกำหนดปริมาณ CTLs เปปไทด์เฉพาะหลังในการขยายตัวของหลอดทดลอง สั้น ๆ 96 หลุม ELISPOT แผ่น (MultiscreenMAHAS4510 มิลลิพอร์ Molsheim ฝรั่งเศส) ได้เคลือบค้างคืนที่ 4 ◦C กับ 7.5 g/ml ต่อต้านมนุษย์ IFN-(M-700A, Endogen เทคโนโลยีชีวภาพ ร็อคฟอร์ด IL เจาะสหรัฐอเมริกา) แผ่นถูกล้างหกครั้ง ด้วยฟอสเฟตเป็นหมันน้ำเกลือบัฟเฟอร์ (PBS) การเอาผูกเคลือบแอนติบอดี สารแขวนลอยเซลล์วจัด และ 4-6บ่อ replicate ได้เตรียม 105 เซลล์ต่อ เปปไทด์เพิ่มในความเข้มข้นสุดท้ายของ 10 g / ml. เป็นควบคุมบวก เซลล์ที่ถูกกระตุ้น ด้วย phytohaemaglutinin 10 g/ml(ผา) (Sigma Aldrich สหราชอาณาจักร) เซลล์รับการกกกับสมบูรณ์ปานกลางเป็นตัวควบคุมค่าลบหลังจากบ่มสำหรับ h 18 – 20 ◦C และ 5% CO2, 37แผ่นถูกล้าง ด้วย PBS ที่ประกอบด้วย 0.05% โลก-20Biotinylated antihuman IFN- (ม 701B, Endogen เจาะเทคโนโลยีชีวภาพ ร็อคฟอร์ด IL สหรัฐอเมริกา) ถูกเพิ่มที่ 0.75 g/mlและแผ่นได้รับการกก 2 ชม.ที่อุณหภูมิห้อง หลังจากกกไข่ แผ่นถูกล้าง และรับการกกต่อไปh 1 กับผัน streptavidin ฮอส (Dako โคเปนเฮเกนเดนมาร์ก) เจือจาง 1: 500 ในบีเอสเอ PBS/1% ถัดไป การแผ่นถูกซัดเป็นก่อน และ 200 ลิตรของพื้นผิว [30 มิลลิกรัม4-chloro-1-naphthol (057h 8927, Sigma) ละลาย 10 mlเมทานอล เจือจางใน 50 ml H2O triethanol บัฟเฟอร์ (T1377ซิกม่า) ที่ pH 7.5 และ 25 l H2O2 30% (H1009, Sigma)] ได้ลงหลุม ในที่สุด แผ่น werewashed ภายใต้การทำงานแตะน้ำ และอบแห้งที่อุณหภูมิห้อง IFN-จุดขึ้นรูปเซลล์ (SFC) ได้ระบุการใช้การอ่าน ELISPOT (KSELISpot, Zeiss มิวนิก เยอรมนี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

แผ่น (Nunc, Roskilde, เดนมาร์ก) เปปไทด์ของแต่ละบุคคลได้รับการ
เพิ่มความเข้มข้นสุดท้ายของ 20 กรัม / มิลลิลิตรต่อกันและบ่ม
เป็นเวลา 10 วันที่ 37 ◦C, 5% CO2 ในอากาศความชื้น RhIL-2
(Proleukin; Chiron, เนเธอร์แลนด์) 20 U / ml ถูกเพิ่มเข้ามา
ในวันที่ 1 เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวในวันที่ 10 ล้างสองครั้งใน
RPMI-1640 และ resuspended ในสื่อที่สมบูรณ์เพื่อเป็นครั้งสุดท้าย
เข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร .
IFN-? ELISPOT ทดสอบได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้
ก่อนหน้านี้ [18] ปริมาณ CTLs เปปไทด์เฉพาะหลังจากที่ใน
หลอดทดลองการขยายตัว สั้น ๆ , 96 หลุมแผ่น ELISPOT (Multiscreen,
MAHAS4510; ค Molsheim, ฝรั่งเศส) ได้รับการ
เคลือบค้างคืนที่ 4 ◦C 7.5 g / ml IFN- ต่อต้านมนุษย์?
? (M-700A, Endogen; เพียร์ซเทคโนโลยีชีวภาพ, ฟอร์ด, อิลลินอยส์,
สหรัฐอเมริกา) แผ่นถูกล้างหกครั้งกับฟอสเฟตหมัน
บัฟเฟอร์น้ำเกลือ (PBS) เพื่อเอาสารเคลือบผิวที่ไม่ถูกผูก
แอนติบอดี เซลล์แขวนลอยได้จัดทำและ 4-6
หลุมทำซ้ำเมล็ด 105 เซลล์ต่อกัน เปปไทด์
ที่เพิ่มขึ้นในความเข้มข้นสุดท้ายของ 10? g / ml ในฐานะที่เป็น
ตัวควบคุมบวกเซลล์ถูกกระตุ้นด้วย 10? g / ml phytohaemaglutinin
(PHA) (Sigma-Aldrich สหราชอาณาจักร) เซลล์ที่ถูก
บ่มกับสื่อที่สมบูรณ์เพียงอย่างเดียวเป็นตัวควบคุมเชิงลบ.
หลังจากการบ่ม 18-20 ชั่วโมงที่ 37 ◦Cและ CO2 5%,
จานถูกล้างด้วยพีบีเอสที่มี 0.05% Tween-20.
ไบโอติน IFN- antihuman? (M-701B, Endogen; เพียร์ซ
เทคโนโลยีชีวภาพ, ฟอร์ด, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา) ถูกบันทึกอยู่ที่ 0.75 g / ml
และแผ่นถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจาก
บ่มแผ่นถูกล้างและบ่มต่อไปสำหรับ
1 ชั่วโมงกับเปอร์ออกซิเดสเต-ผัน (Dako, โคเปนเฮเกน,
เดนมาร์ก) เจือจาง 1: 500 ในพีบีเอส / 1% บีเอสเอ ถัดไป
จานถูกล้างเป็นมาก่อนและ 200? L ของพื้นผิว [30 มิลลิกรัม
4 chloro-1-naphthol (057h8927 ซิก) ละลายใน 10 มล.
เมทานอลเจือจางใน 50 มล triethanol บัฟเฟอร์ H2O (T1377,
Sigma) ที่ pH 7.5 และ 25? L H2O2 30% (H1009 ซิก)] ถูก
เพิ่มลงในหลุม ในที่สุดแผ่น werewashed ภายใต้การใช้
น้ำประปาและแห้งที่อุณหภูมิห้อง IFN-? จุดขึ้นรูป
เซลล์ (SFC) ถูกระบุโดยใช้เครื่องอ่าน ELISPOT (KS
ELISPOT, Zeiss, มิวนิค, เยอรมนี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

แผ่น ( ขณะนี้ , Roskilde , เดนมาร์ก ) เปปไทด์แต่ละคือเพิ่มความเข้มข้นสุดท้าย 20 g / ml และบ่มต่อ10 วัน ที่อุณหภูมิ 37 ◦ C คาร์บอนไดออกไซด์ 5% ใน humidified อากาศ rhil-2( proleukin ; Chiron , เนเธอร์แลนด์ ) 20 U / ml เป็นเพิ่มในวันที่ 1 เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวในวันที่ 10 , ล้างสองครั้งในrpmi-1640 resuspended ขนาดกลางและสมบูรณ์ ครั้งสุดท้ายเข้มข้น 1 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตรและ IFN - อีไลสปอท assay แสดงตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 18 ] ctls เปปไทด์ที่มีเฉพาะหลังจากที่ในการขยายหลอด สั้น ๆ , 96 ก็ ( multiscreen อีไลสปอท , แผ่นmahas4510 ; มิลลิ Molsheim , ฝรั่งเศส ) ,เคลือบค้างคืนที่ 4 ◦ C 7.5 g / ml ต่อต้านคนหนึ่ง( m-700a endogen ; แทง , เทคโนโลยีชีวภาพ , Rockford , IL ,สหรัฐอเมริกา ) จานถูกล้าง 6 ครั้งด้วยฟอสเฟตปลอดเชื้อในน้ำเกลือ ( PBS ) เอาเคลือบไม่ลุ่ยแอนติบอดี เซลล์แขวนลอยถูกเตรียมและสี่ถึงหกสร้างบ่อถูก seeded กับ 105 เซลล์ต่อดี เปปเพิ่มในความเข้มข้นสุดท้าย 10 กรัม / มล. เป็นการควบคุมบวก เซลล์ถูกกระตุ้นด้วย phytohaemaglutinin 10 กรัม / มิลลิลิตร( PHA ) ( ซิกม่า Aldrich , UK ) เซลล์คือแยกสมบูรณ์ปานกลางคนเดียวควบคุมลบหลังจากบ่มเป็นเวลา 18 – 20 ชั่วโมง 37 ◦ C และคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์จานถูกล้างด้วย pbs ประกอบด้วย 0.05% tween-20 .ไล IFN - ( m-701b ไช่มนุษย์ endogen ; แทง ,เทคโนโลยีชีวภาพ , Rockford , IL , USA ) ถูกเพิ่มเข้ามาใน 0.75g/mlและแผ่นถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากบ่ม , จานถูกล้างและบ่มต่างๆ1 ชั่วโมง กับ streptavidin และเปอร์ออกซิเดส ( ทางหนึ่ง , โคเปนเฮเกนเดนมาร์ก ) เจือจาง 1 : 500 ใน PBS / 1 % BSA . ต่อไปจานถูกล้างก่อน และ 200 ลิตร ( [ 30 มก.4-chloro-1-naphthol ( 057h8927 , Sigma ) ละลายใน 10 มล.เมทานอล เจือจางใน triethanol H2O ( t1377 50 มล. 2 ,Sigma ) ที่ pH 7.5 และ 25 ลิตร H2O2 30% ( h1009 , Sigma ) ]เพิ่มในเวลส์ ในที่สุด แผ่น werewashed ภายใต้วิ่งน้ำประปาและอบแห้งที่อุณหภูมิห้อง สร้าง IFN - จุดเซลล์ ( SFC ) ถูกระบุโดยใช้เครื่องอ่านอีไลสปอท ( เกาสงอีไลสปอท ไซซ์ มิวนิค , เยอรมัน )