Fifteen different assays were teste

Fifteen different assays were tested in this study :ﬁve genus-speciﬁc assays,three E.faecalis speciﬁc assays, three E. casseliﬂavus-speciﬁc assays, and four E. faecium speciﬁc assays (Table 1). Eleven assays were tested as conventional PCR assays,and four were tested as qPCR (TaqMan-based)assays(one genus speciﬁc, Entero1, and one for each of the enterococcal groups, Faecalis1, Casseli 1, and Faecium1). The Entero1 and Faecalis1 qPCR assays were developed and evaluated in previous studies (12, 17). To develop new enterococcal assays, a phylogenetic tree that included the 16S rRNA gene sequences from reference enterococcal strains (8) and environmental strains was generated using a neighbor-joining algorithm in ARB (18). Unique phylogenetic clades were identiﬁed (Fig. 1), and candidate primerswerethenchosentotargetthreemajorenvironmentalclades(E.faecalis, E. faecium, and E. casseliﬂavus) using the primer design algorithm in ARB(Table1).Additionally,16SrRNAgeneenterococcalsequenceswere used to design two group-speciﬁc qPCR assays using the Primer Express software(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)(Table1).Theassayswere optimized through the use of temperature gradients and were tested for their speciﬁcities and sensitivities against the reference bacterial strains andenvironmentalenterococcusisolatesdescribedabove.Theapplicabilities of the PCR and qPCR assays in environmental monitoring were also evaluated against the aforementioned set of water and fecal samples. For the conventional PCR assays, all water and fecal samples were tested as described previously (19), with the following modiﬁcations: 0.5 to1ng/lofDNAextractswasusedasatemplate,and10-folddilutionsof each DNA extract were used to test for PCR inhibition. The PCR assays were performed in 25 l using TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Bio, Inc.) in a Bio-RadTetrad2Peltierthermalcycler(Bio-Rad,Hercules,CA)underthe followingcyclingconditions:aninitialdenaturationstepat95°Cfor5min and 25 cycles of 1 min at 95°C, 1 min at optimum annealing temperature (Table 1), and 1 min at 72°C. The PCR products were visualized in 1.5% agarose gels using GelStar nucleic acid gel stain (Lonza, Rockland, ME). TheTaqManqPCRassayswereperformedin25-lreactionmixtures containing1TaqManuniversalPCRmastermixwithAmpEraseuracilN-glycosylase (Applied Biosystems, Foster City, CA), 0.2 g/l bovine serum albumin, 0.2 M (ﬁnal concentration) of each primer, and a 6-FAM (6-carboxyﬂuorescein)-labeled hydrolysis probe. The ampliﬁcation protocol involved an initial incubation step at 50°C for 2 min to activateuracil-N-glycosylase,followedby10minofincubationat95°Cto activate AmpliTaq Gold enzyme, and then 40 cycles of 95°C for 15 s and 60°C for 1 min. The qPCR assays were performed using a 7900 HT Fast real-time sequence detector (Applied Biosystems, Foster City, CA). All assayswereperformedintriplicateinMicroAmpOptical96-wellreaction plates with MicroAmp Optical Caps strips (Applied Biosystems, Foster City, CA). The PCR data were analyzed using ABI’s Sequence Detector software (version 2.2.2). Four independent standard curves for each qPCR assay were generated by plotting the threshold cycle (CT) values against the numbers of target copies corresponding to serially dilutedplasmid standards purchased from Integrated DNA Technologies (IDT; Coralville, Iowa). The target copy numbers (T) were estimated by the equation T [D/(PL 660)] 6.022 1023, where D (g/l) is plasmid DNA concentration and PL (in base pairs) is plasmid length. Each standard curve was generated from at least ﬁve 10-fold plasmid dilutions in triplicate. The percent ampliﬁcation efﬁciencies were calculated by the instrument manufacturer’s instructions (Applied Biosystems). Two notemplatecontrolsperPCRplatewereusedtocheckforcross-contamination.

Fifteen different assays were tested in this study :ﬁve genus-speciﬁc assays,three E.faecalis speciﬁc assays, three E. casseliﬂavus-speciﬁc assays, and four E. faecium speciﬁc assays (Table 1). Eleven assays were tested as conventional PCR assays,and four were tested as qPCR (TaqMan-based)assays(one genus speciﬁc, Entero1, and one for each of the enterococcal groups, Faecalis1, Casseli 1, and Faecium1). The Entero1 and Faecalis1 qPCR assays were developed and evaluated in previous studies (12, 17). To develop new enterococcal assays, a phylogenetic tree that included the 16S rRNA gene sequences from reference enterococcal strains (8) and environmental strains was generated using a neighbor-joining algorithm in ARB (18). Unique phylogenetic clades were identiﬁed (Fig. 1), and candidate primerswerethenchosentotargetthreemajorenvironmentalclades(E.faecalis, E. faecium, and E. casseliﬂavus) using the primer design algorithm in ARB(Table1).Additionally,16SrRNAgeneenterococcalsequenceswere used to design two group-speciﬁc qPCR assays using the Primer Express software(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)(Table1).Theassayswere optimized through the use of temperature gradients and were tested for their speciﬁcities and sensitivities against the reference bacterial strains andenvironmentalenterococcusisolatesdescribedabove.Theapplicabilities of the PCR and qPCR assays in environmental monitoring were also evaluated against the aforementioned set of water and fecal samples. For the conventional PCR assays, all water and fecal samples were tested as described previously (19), with the following modiﬁcations: 0.5 to1ng/lofDNAextractswasusedasatemplate,and10-folddilutionsof each DNA extract were used to test for PCR inhibition. The PCR assays were performed in 25 l using TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Bio, Inc.) in a Bio-RadTetrad2Peltierthermalcycler(Bio-Rad,Hercules,CA)underthe followingcyclingconditions:aninitialdenaturationstepat95°Cfor5min and 25 cycles of 1 min at 95°C, 1 min at optimum annealing temperature (Table 1), and 1 min at 72°C. The PCR products were visualized in 1.5% agarose gels using GelStar nucleic acid gel stain (Lonza, Rockland, ME). TheTaqManqPCRassayswereperformedin25-lreactionmixtures containing1TaqManuniversalPCRmastermixwithAmpEraseuracilN-glycosylase (Applied Biosystems, Foster City, CA), 0.2 g/l bovine serum albumin, 0.2 M (ﬁnal concentration) of each primer, and a 6-FAM (6-carboxyﬂuorescein)-labeled hydrolysis probe. The ampliﬁcation protocol involved an initial incubation step at 50°C for 2 min to activateuracil-N-glycosylase,followedby10minofincubationat95°Cto activate AmpliTaq Gold enzyme, and then 40 cycles of 95°C for 15 s and 60°C for 1 min. The qPCR assays were performed using a 7900 HT Fast real-time sequence detector (Applied Biosystems, Foster City, CA). All assayswereperformedintriplicateinMicroAmpOptical96-wellreaction plates with MicroAmp Optical Caps strips (Applied Biosystems, Foster City, CA). The PCR data were analyzed using ABI’s Sequence Detector software (version 2.2.2). Four independent standard curves for each qPCR assay were generated by plotting the threshold cycle (CT) values against the numbers of target copies corresponding to serially dilutedplasmid standards purchased from Integrated DNA Technologies (IDT; Coralville, Iowa). The target copy numbers (T) were estimated by the equation T  [D/(PL  660)]  6.022  1023, where D (g/l) is plasmid DNA concentration and PL (in base pairs) is plasmid length. Each standard curve was generated from at least ﬁve 10-fold plasmid dilutions in triplicate. The percent ampliﬁcation efﬁciencies were calculated by the instrument manufacturer’s instructions (Applied Biosystems). Two notemplatecontrolsperPCRplatewereusedtocheckforcross-contamination.

0/5000

จาก: -

เป็น: -

ผลลัพธ์ (ไทย) 1: [สำเนา]

คัดลอก!

ทดสอบ assays สิบห้าแตกต่างกันในการศึกษานี้: ด้านสกุล-speciﬁc assays, assays speciﬁc E.faecalis 3, assays E. casseliﬂavus-speciﬁc สาม และสี่ E. faecium speciﬁc assays (ตารางที่ 1) ทดสอบสิบเอ็ด assays เป็น assays PCR ธรรมดา และสี่ได้รับการทดสอบเป็น qPCR (ตาม TaqMan) assays (หนึ่งสกุล speciﬁc, Entero1 และหนึ่งสำหรับแต่ละกลุ่ม enterococcal, Faecalis1, Casseli 1 และ Faecium1) Assays qPCR Entero1 และ Faecalis1 ถูกพัฒนา และประเมินในการศึกษาก่อนหน้า (12, 17) การพัฒนาใหม่ enterococcal assays มีผลต้นไม้ที่รวมลำดับที่ยีน 16S rRNA จากสายพันธุ์ enterococcal อ้างอิง (8) และสร้างสายพันธุ์สิ่งแวดล้อมโดยใช้อัลกอริทึมที่เพื่อนบ้านเข้าร่วมใน ARB (18) เฉพาะทาง clades ได้ primerswerethenchosentotargetthreemajorenvironmentalclades, identiﬁed (รูปที่ 1) และผู้สมัคร (E.faecalis, E. faecium และ E. casseliﬂavus) โดยใช้อัลกอริทึมการออกแบบไพรเมอร์ใน ARB(Table1) นอกจากนี้ 16SrRNAgeneenterococcalsequenceswere assays qPCR speciﬁc กลุ่มสองที่ใช้ software(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)(Table1) Express ไพรเมอร์ออกแบบ Theassayswere ดีที่สุดผ่านการใช้การไล่ระดับสีอุณหภูมิ และทดสอบสำหรับ speciﬁcities และความไวกับการ andenvironmentalenterococcusisolatesdescribedabove แบคทีเรียสายพันธุ์อ้างอิง Theapplicabilities ของ assays PCR และ qPCR ในการตรวจสอบสิ่งแวดล้อมยังถูกประเมินกับชุดดังกล่าวของน้ำและตัวอย่างอุจจาระ สำหรับ assays PCR ทั่วไป ตัวอย่างอุจจาระและน้ำทั้งหมดได้รับการทดสอบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (19), กับ modiﬁcations ต่อไปนี้: 0.5 to1ng lofDNAextractswasusedasatemplate, and10-folddilutionsof แยกดีเอ็นเอแต่ละถูกใช้เพื่อทดสอบสำหรับการยับยั้ง PCR PCR assays ถูกดำเนินการใน 25 l ใช้ Ex Taq TaKaRa (TaKaRa ชีวภาพ Inc.) ในไบโอ-RadTetrad2Peltierthermalcycler(Bio-Rad,Hercules,CA) underthe followingcyclingconditions:aninitialdenaturationstepat95 ° Cfor5min และ 25 รอบ 1 นาทีที่ 95 ° C, 1 นาทีที่สูงสุดที่หลอมอุณหภูมิ (ตารางที่ 1), และ 1 นาทีที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแสดงเป็นภาพใน 1.5% agarose เจลโดยใช้สีย้อมเจลกรดนิวคลีอิก GelStar (Lonza รอคแลนด์ ME) TheTaqManqPCRassayswereperformedin25 lreactionmixtures containing1 TaqManuniversalPCRmastermixwithAmpEraseuracilN-glycosylase (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) 0.2 แยกวัว serum albumin, 0.2 M (พิจารณาความเข้มข้น) ของรองพื้นแต่ละ และแบบ 6-FAM (6 carboxyﬂuorescein) -ชื่อไฮโตรไลซ์รบ โพรโทคอล ampliﬁcation เกี่ยวข้องกับขั้นตอนการบ่มเริ่มต้นที่ 50° C เป็นเวลา 2 นาทีเพื่อ activateuracil-N-glycosylase, followedby10minofincubationat95 ° Cto เปิด AmpliTaq ทองเอนไซม์ และ 40 แล้วรอบของ 95 ° C สำหรับ 15 s และ 60° C เป็นเวลา 1 นาที QPCR assays ถูกดำเนินการโดยใช้เครื่อง 7900 เร็ว HT ลำดับแบบเรียลไทม์ตรวจจับ (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) แผ่น assayswereperformedintriplicateinMicroAmpOptical96 wellreaction ทั้งหมด มีแถบหมวกแสง MicroAmp (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) ข้อมูล PCR ได้วิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ตรวจจับลำดับของ ABI (เวอร์ชัน 2.2.2) สี่เส้นโค้งมาตรฐานอิสระสำหรับการทดสอบแต่ละ qPCR สร้างขึ้น โดยการพล็อตค่าวงจร (CT) ของเขตแดนกับหมายเลขที่สอดคล้องกับ serially dilutedplasmid มาตรฐานซื้อจากดีเอ็นเอเทคโนโลยี (IDT สำเนาเป้าหมาย Coralville ไอโอวา) หมายเลขสำเนาเป้าหมาย (T) ถูกประเมิน โดยสมการ T [D /(PL 660)] 6.022 1023 ที่ D (g / l) เป็น plasmid DNA ความเข้มข้น และ PL (ในฐานคู่) ยาว plasmid สร้างจากเส้นโค้งแต่ละมาตรฐานน้อยด้านเจือจาง 10-fold plasmid ลข้อ Efﬁciencies ampliﬁcation เปอร์เซ็นต์ถูกคำนวณ โดยการแนะนำของผู้ผลิตเครื่องมือ (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ) สอง notemplatecontrolsperPCRplatewereusedtocheckforcross ปนเปื้อน

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:[สำเนา]

คัดลอก!

สิบห้าการวิเคราะห์ที่แตกต่างกันได้รับการทดสอบในการศึกษานี้: FI ve สกุล-Fi speci ตรวจ C, สาม E.faecalis speci Fi C ตรวจสามอี casseli FL AVUS-Fi speci C ชุดตรวจและสี่ E. faecium speci ตรวจ Fi C (ตารางที่ 1) Eleven ตรวจได้มีการทดสอบการตรวจ PCR เป็นธรรมดาและสี่ได้รับการทดสอบเป็น qPCR (TaqMan-based) การวิเคราะห์ (หนึ่งประเภท speci Fi C, Entero1 และหนึ่งสำหรับแต่ละกลุ่ม enterococcal, Faecalis1, Casseli ที่ 1 และ Faecium1) ตรวจ Entero1 และ Faecalis1 qPCR ได้รับการพัฒนาและประเมินผลในการศึกษาก่อนหน้า (12, 17) การพัฒนาชุดตรวจ enterococcal ใหม่ต้นไม้สายวิวัฒนาการที่รวม 16S rRNA ลำดับยีนจากสายพันธุ์อ้างอิง enterococcal (8) และสายพันธุ์สิ่งแวดล้อมถูกสร้างขึ้นโดยใช้อัลกอริทึมเพื่อนบ้านเข้าใน ARB (18) clades สายวิวัฒนาการที่ไม่ซ้ำกันได้ระบุเอ็ด Fi (รูปที่ 1). และผู้สมัคร primerswerethenchosentotargetthreemajorenvironmentalclades (E.faecalis อี faecium และอี casseli FL AVUS) โดยใช้ขั้นตอนวิธีการออกแบบไพรเมอร์ใน ARB (Table1) .Additionally, 16SrRNAgeneenterococcalsequenceswere ใช้ในการออกแบบสอง Fi กลุ่ม speci C qPCR การตรวจโดยใช้ซอฟแวร์ไพรเมอร์เอ็กซ์เพรส (AppliedBiosystems, FosterCity, CA) (ตารางที่ 1) .Theassayswere ที่ดีที่สุดผ่านการใช้การไล่ระดับสีอุณหภูมิและได้รับการทดสอบสำหรับเมืองที่ระบุไว้ของพวกเขาและความเปราะบางกับการอ้างอิงแบคทีเรีย andenvironmentalenterococcusisolatesdescribedabove.Theapplicabilities ของ PCR และ qPCR ตรวจในการตรวจสอบสิ่งแวดล้อม นอกจากนี้ยังได้รับการประเมินกับชุดดังกล่าวของน้ำและอุจจาระตัวอย่าง สำหรับการตรวจ PCR ธรรมดาน้ำและอุจจาระทุกตัวอย่างมีการทดสอบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (19) กับไพเพอร์ Fi Modi ต่อไปนี้:? 0.5 to1ng / lofDNAextractswasusedasatemplate, and10-folddilutionsof แต่ละสารสกัดดีเอ็นเอถูกนำมาใช้ในการทดสอบการยับยั้ง PCR ตรวจ PCR ได้ดำเนินการใน 25 ลิตรใช้ Takara Ex Taq (Takara Bio, Inc) ใน Bio-RadTetrad2Peltierthermalcycler (Bio-Rad, Hercules, CA) สังกัด followingcyclingconditions: aninitialdenaturationstepat95 ° Cfor5min และ 25 รอบ 1 นาทีที่ 95 ° C , 1 นาทีที่อุณหภูมิการอบที่เหมาะสม (ตารางที่ 1) และ 1 นาทีที่ 72 ° C ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกมองเห็นใน 1.5% agarose เจลใช้ GelStar กรดนิวคลีอิกเจลคราบ (Lonza, ร็อกแลนด์, ME) TheTaqManqPCRassayswereperformedin25-? lreactionmixtures containing1? TaqManuniversalPCRmastermixwithAmpEraseuracilN-glycosylase (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย) 0.2? g /? L วัวซีรั่มอัลบูมิ 0.2? M (FI เข้มข้น NAL) ของแต่ละไพรเมอร์, และ 6 FAM (6-Carboxy FL uorescein) สอบสวนย่อยสลาย -labeled ampli โปรโตคอล Fi ไอออนบวกที่เกี่ยวข้องกับขั้นตอนการบ่มเริ่มต้นที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีเพื่อ activateuracil-N-glycosylase, followedby10minofincubationat95 ° CTO เปิดใช้งานเอนไซม์ AmpliTaq ทองแล้ว 40 รอบจาก 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที ตรวจ qPCR ถูกดำเนินการโดยใช้ HT 7900 จานด่วนแบบ real-time เครื่องตรวจจับลำดับ (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย) ทุกแผ่น assayswereperformedintriplicateinMicroAmpOptical96-wellreaction กับไมโครแอมป์ออปติคอล Caps แถบ (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย) ข้อมูลที่ได้มาวิเคราะห์ PCR โดยใช้ซอฟต์แวร์ตรวจจับลำดับของ ABI (เวอร์ชั่น 2.2.2) สี่เส้นโค้งมาตรฐานอิสระสำหรับแต่ละการทดสอบ qPCR ถูกสร้างขึ้นโดยการวางแผนวงจรเกณฑ์ (CT) ค่ากับตัวเลขของสำเนาเป้าหมายที่สอดคล้องกับมาตรฐาน dilutedplasmid ลำดับที่ซื้อมาจากแบบบูรณาการเทคโนโลยีดีเอ็นเอ (IDT; คอรัลวิลล์, ไอโอวา) ตัวเลขสำเนาเป้าหมาย (T) ได้รับการประเมินจากสมการที่ T? [D / (PL? 660)] 6.022? 1023 ที่ D (g /? L) คือความเข้มข้นของพลาสมิดดีเอ็นเอและ PL (ในฐานคู่) คือความยาวพลาสมิด แต่ละเส้นโค้งมาตรฐานถูกสร้างขึ้นจากอย่างน้อย Fi ได้เจือจางพลาสมิด 10 เท่าในเพิ่มขึ้นสามเท่า ร้อยละ ampli Fi ไอออนบวก EF Fi ciencies ถูกคำนวณตามคำแนะนำของผู้ผลิตเครื่องดนตรีของ (Applied Biosystems) สอง notemplatecontrolsperPCRplatewereusedtocheckforcross การปนเปื้อน

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:[สำเนา]

คัดลอก!

การแปล กรุณารอสักครู่..

ภาษาอื่น ๆ

การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.