2.4.Over-expressionandpurificationo

2.4.
Over-expression
and
purification
of
recombinant
Prx
The
recombinant
Prx
were
over-expressed
in
E.
coli
BL21
(DE3)
cells
in
the
presence
of
isopropyl-

-
d
-
thiogalactopyranoside
(IPTG).
Briefly,
E.
coli
BL21
(DE3)
starter
culture
containing
the
Prx
ORF
in
the
correct
orien-
tation
and
reading
frame
was
used
to
inoculate
LB
broth
supplemented
with
Ampicillin
(50

g
ml
−
1
)
and
the
cells
were
cultured
with
shaking
(250
rpm)
at
37
◦
C
until
an
OD
600
value
of
0.5
was
reached.
At
this
point,
protein
expres-
sion
was
induced
by
the
addition
of
0.5
mM
IPTG
and
the
cells
were
cultured
for
further
4
h
before
being
harvested
by
centrifugation.
The
resulting
cell
pellets
were
suspended
in
5
times
volume
of
0.02
M
Tris–HCl
buffer
(pH
9.0),
and
were
disrupted
at
4
◦
C
with
Ultrasonic
Cell
Disruptor
(Sonics
Materials,
Inc.,
USA).
The
cell
debris
was
removed
by
centrifugation
at
15,000
×
g
for
5
min
at
4
◦
C,
and
then
the
supernatant
(crude
extract)
was
used
for
further
Prx
enzymes
purification.
In
the
further
Prx
enzyme
purification,
the
supernatants
(crude
extracts)
were
supplemented
with
2.0
mol
l
−
1
(NH
4
)
2
SO
4
,
and
then
applied
on
phenyl
Sepharose
column
(2.0
×
10
cm)
equilibrated
with
Buffer
A
containing
2.0
mol
l
−
1
(NH
4
)
2
SO
4
+
0.02
mol
l
−
1
Tris–HCl
(pH
9.0).
After
washing
the
column
with
the
same
buffer,
the
active
fraction
was
eluted
with
decreasing
concen-
trations
of
(NH
4
)
2
SO
4
.
Fractions
containing
ZEN
degradation
activity
(10
ml)
were
then
loaded
onto
a
Sephadex
G-75
column
(2.0
cm
×
25
cm)
pre-equilibrated
with
0.02
mol
l
−
1
Tris–HCl
(pH
9.0),
and
the
column
was
eluted
by
the
same
buffer
at
a
flow
rate
of
0.5
ml
min
−
1
,
and
fractions
of
5
ml
were
collected
to
ana-
lyze
ZEN
degradation
activity.
In
addition,
protein
samples
were
run
on
12.5%
SDS-PAGE
with
a
protein
marker.
Gels
were
stained
using
0.05%
Coomassie
Blue
R-250,
followed
by
a
standard
de-
staining
procedure.
Protein
concentrations
were
determined
with
a
Bradford
protein
assay
with
bovine
serum
albumin
as
a
stan-
dard.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4แสดงออกมากเกินไปและทำให้บริสุทธิ์ของrecombinantPrxการrecombinantPrxมีแสดงมากเกินไปในEโคไลBL21(DE3)เซลล์ในการสถานะการออนไลน์ของisopropyl--d-thiogalactopyranoside(IPTG)สั้น ๆEโคไลBL21(DE3)สตาร์ทเตอร์วัฒนธรรมที่ประกอบด้วยการPrxORFในการถูกต้องorien-tationและอ่านเฟรมแก้ไขใช้ถึงปลูกฝีปอนด์น้ำซุปเสริมด้วยโกคอ(50กรัมมล.−1)และการเซลล์มีล้างด้วยสั่น(250รอบต่อนาที)ที่37◦CจนถึงมีOD600ค่าของ0.5แก้ไขถึงที่นี้จุดโปรตีนนิยมของเหล่า-sionแก้ไขเหนี่ยวนำให้เกิดโดยการนอกจากนี้ของ0.5มม.IPTGและการเซลล์มีล้างสำหรับเพิ่มเติม4ชมก่อนที่จะถูกการเก็บเกี่ยวโดยหมุนเหวี่ยงการส่งผลให้เซลล์เม็ดมีหยุดชั่วคราวใน5ครั้งระดับเสียงของ0.02มทริสเรทติ้ง – HClบัฟเฟอร์(pH9.0),และมีหยุดชะงักที่4◦Cด้วยอัลตราโซนิกเซลล์Disruptor(Sonicsวัสดุอิงค์สหรัฐอเมริกา)การเซลล์เศษแก้ไขเอาออกโดยหมุนเหวี่ยงที่15,000×กรัมสำหรับ5นาทีที่4◦Cและจากนั้นการsupernatant(น้ำมันดิบแยก)แก้ไขใช้สำหรับเพิ่มเติมPrxเอนไซม์บริสุทธิ์ในการเพิ่มเติมPrxเอนไซม์บริสุทธิ์การsupernatants(น้ำมันดิบสารสกัด)มีเสริมด้วย2.0กระทรวงแรงงานl−1(NH4)2ดังนั้น4,และจากนั้นนำไปใช้บนฟีนิลSepharoseคอลัมน์(2.0×10อีโมequilibratedด้วยบัฟเฟอร์Aที่ประกอบด้วย2.0กระทรวงแรงงานl−1(NH4)2ดังนั้น4+0.02กระทรวงแรงงานl−1ทริสเรทติ้ง – HCl(pH9.0)หลังจากซักผ้าการคอลัมน์ด้วยการเดียวกันบัฟเฟอร์การใช้งานอยู่เศษส่วนแก้ไขelutedด้วยลดลงconcen-trationsของ(NH4)2ดังนั้น4.เศษส่วนที่ประกอบด้วยเซนย่อยสลายกิจกรรม(10มล.)มีจากนั้นโหลดลงบนมีSephadexG-75คอลัมน์(2.0ซม.×25อีโมequilibrated ก่อนด้วย0.02กระทรวงแรงงานl−1ทริสเรทติ้ง – HCl(pH9.0),และการคอลัมน์แก้ไขelutedโดยการเดียวกันบัฟเฟอร์ที่มีกระแสราคาของ0.5มล.นาที−1,และเศษส่วนของ5มล.มีเก็บรวบรวมถึงเอเอ็นเอ-lyzeเซนย่อยสลายกิจกรรมในนอกจากนี้โปรตีนตัวอย่างมีเรียกใช้บน12.5%SDS-หน้าด้วยมีโปรตีนเครื่องหมายเจมีย้อมสีโดยใช้0.05%Coomassieสีฟ้าR-250ตามด้วยโดยมีมาตรฐานเดอ-ย้อมสีขั้นตอนนี้โปรตีนความเข้มข้นมีกำหนดด้วยมีแบรดฟอร์ดโปรตีนทดสอบด้วยวัวเซรั่มalbuminเป็นมีstan-dard

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4.
กว่าการแสดงออก
และ
การทำให้บริสุทธิ์
ของ
recombinant
PRX recombinant PRX ถูกมากกว่าที่แสดงในE. coli BL21 (DE3) เซลล์ในการปรากฏตัวของisopropyl- ? - D - thiogalactopyranoside . (IPTG) สั้น ๆ , E. coli BL21 (DE3) เริ่มต้นวัฒนธรรมที่มีPRX ORF ในถูกต้องorien- tation และอ่านกรอบถูกนำมาใช้ในการฉีดวัคซีนLB น้ำซุปเสริมกับAmpicillin (50 ? G มล. - 1 ) และเซลล์ที่ถูกเลี้ยงด้วยการเขย่า(250 รอบต่อนาที) ที่37 ◦ C จนกว่าOD 600 มูลค่าของ0.5 ได้รับถึง. ตอนนี้จุดโปรตีนแสดงออกไซออนถูกเหนี่ยวนำโดยนอกจากของ0.5 มิลลิIPTG และเซลล์มีการเพาะเลี้ยงสำหรับอีก4 ชั่วโมงก่อนที่จะถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง. ส่งผลให้เซลล์เม็ดถูกระงับใน5 ครั้งปริมาณของ0.02 M Tris-HCl บัฟเฟอร์(pH 9.0) และได้รับการหยุดชะงักที่4 ◦ C ด้วยอัลตราโซนิกมือถือDisruptor (Sonics วัสดุอิงค์สหรัฐอเมริกา). เซลล์เศษถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงที่15,000 × กรัมสำหรับ5 นาทีที่4 ◦ C , และแล้วใส(น้ำมันดิบExtract) ถูกนำมาใช้สำหรับการต่อไปPRX เอนไซม์บริสุทธิ์. ในเพิ่มเติมPRX เอนไซม์บริสุทธิ์supernatants (น้ำมันดิบสารสกัด) ถูกตบท้ายด้วย2.0 mol L - 1 (NH 4 ) 2 SO 4 , และจากนั้นนำไปใช้ในphenyl Sepharose คอลัมน์(2.0 × 10 ซม.) equilibrated กับบัฟเฟอร์มี2.0 mol L - 1 (NH 4 ) 2 SO 4 + 0.02 mol L - 1 Tris-HCl (pH . 9.0) หลังจากล้างคอลัมน์กับเดียวกันบัฟเฟอร์การใช้งานส่วนถูกชะกับการลดความเข้มข้นtrations ของ(NH 4 ) 2 SO 4 . เศษส่วนที่มีZEN ย่อยสลายกิจกรรม(10 มล.) ถูกแล้วโหลดลงบนSephadex G-75 คอลัมน์(2.0 ซม. × 25 ซม.) ก่อน equilibrated กับ0.02 mol L - 1 Tris-HCl (pH 9.0) และคอลัมน์ถูกชะโดยเดียวกันบัฟเฟอร์ที่ไหลอัตราของ0.5 มลนาที- 1 , และเศษส่วนของ5 มล. ถูกเก็บรวบรวมเพื่อana- lyze ZEN ย่อยสลาย. กิจกรรมในนอกจากนี้โปรตีนตัวอย่างที่ถูกเรียกใช้ใน12.5% SDS-PAGE กับโปรตีนเครื่องหมาย. เจลถูกย้อมสีโดยใช้0.05% Coomassie สีฟ้าR-250, ตามโดยมาตรฐานจากโรงงานย้อมสีขั้นตอน. โปรตีนความเข้มข้นที่ถูกกำหนดด้วยแบรดฟอโปรตีนทดสอบกับวัวซีรั่มอัลบูมิเป็นลี้ดาด