The chromatin structure of genetica

The chromatin structure of genetically engineered mouse samples was assessed for the detection of changes caused by the insertion of transgenic DNA sequences into the host genome. These studies employed ChIP-seq methodology for high resolution, genome-wide mapping of DNA fragments associated with selected proteins followed by comparison of those maps between genetically matched transgenic and wild-type mice samples. The ChIP-seq process was initiated with induction of cross-linking between DNA and its associated proteins. Chromatin was then isolated, subjected to sonication for DNA fragmentation, and sheared chromatin was immunoprecipitated using antibodies against specific histones, specifically H3K4me3, H3K4me1, and H3K36me3. H3K4me3 is a hallmark of actively transcribed protein-coding promoters in eukaryotes; H3K4me1 marks active transcriptional enhancers; and H3K36me3, has been associated with the exons of actively transcribed genes [11]. Immunoprecipitated DNA samples were purified, ligated to sequencing adapters, and assayed using the Next Generation Genome Analyzer IIx sequencing platform (Illumina, CA). This step generated short sequence reads of the DNA fragments bound by the protein(s) of interest.

Initially, transgenic samples carrying native mouse elements were examined. Although the genomic location of the transgene was unknown, alignment of ChIP-seq data to the endogenous mouse genomic locations was expected. Specifically, an increase in the number of reads mapped to these known genomic locations should appear similar to a copy number variation (CNV) event. The native genomic positions for the mouse Myh6 promoter and Gnaq coding sequence transfected into GMO sample 2 (#012460) and the Tyro enhancer sequence, TyBS minigene, and Prm1 promoter transfected into GMO sample 3 (#017594) were investigated. The transgene injected into GMO sample 1 did not contain any endogenous mouse sequences and therefore no specific insertions for GMO sample 1 were evaluated at this stage. Qualitative examination of peaks at the endogenous mouse genomic regions for one representative wild-type sample and the three GMO mice is shown in Fig. 3. The four mouse endogenous genomic regions for the Myh6 ( Fig. 3A), Gnaq ( Fig. 3B), Tyr and TyBS (chr7 separated by ~12 kb) (Fig. 3C), and Prm1 ( Fig. 3D) genes are shown. A very broad set of peaks at the Myh6 region for all three antibodies tested can be seen when comparing GMO sample 2 to the wild-type and other GMO samples ( Fig. 3A). In contrast, GMO sample 2 showed a decrease in the number of peaks for the H3K36me3 antibody as well as a modest reduction in the number of peaks for the other two antibodies surrounding exons 4 and 5 of the Gnaq gene ( Fig. 3B). This may indicate an inactivation of the chromatin region surrounding both the endogenous and exogenous Gnaq sites therefore causing poor representation in the Chip-seq data. GMO sample 3 contains three native mouse gene sequences: the Tyr enhancer and TyBS minigene ( Fig. 3C) and the Prm1 promoter ( Fig. 3D). These regions show an increase in the amount of reads for the H3K4me1 and H3K36me3 antibodies when compared to the wild-type and other GMO samples.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โครงสร้างโครมาตินพันธุเมาส์อย่างถูกประเมินสำหรับตรวจหาการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากการแทรกของจำลองลำดับดีเอ็นเอในจีโนโฮสต์ การศึกษาเหล่านี้ใช้วิธีชิ seq สำหรับความละเอียดสูง การทำแผนที่จีโนมทั้งของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เกี่ยวข้องกับเลือกโปรตีนตามโดยการเปรียบเทียบของแผนที่ระหว่างหนูจำลอง และป่าชนิดพันธุกรรมตรงกันตัวอย่าง การชิพ-seq เริ่ม ด้วยเหนี่ยวนำเชื่อมโยงระหว่าง DNA และโปรตีนเกี่ยวข้อง โครมาตินแล้วแยก การ sonication สำหรับการกระจายตัวของดีเอ็นเอ และตัดโครมาตินคือ immunoprecipitated โดยใช้แอนติบอดีกับ histones เฉพาะ โดยเฉพาะ H3K4me3, H3K4me1 และ H3K36me3 H3K4me3 เป็นจุดเด่นของศัพท์อย่างแข็งขันก่อการเข้ารหัสโปรตีนใน eukaryotes H3K4me1 ทำเครื่องหมายงาน transcriptional เพิ่ม และ H3K36me3 มีการเชื่อมโยงกับ exons ของยีนทับขัน [11] Immunoprecipitated เอ็นได้บริสุทธิ์ ควบกับอะแดปเตอร์ sequencing และ assayed โดยใช้แพลตฟอร์มลำดับถัดไปสร้างกลุ่มวิเคราะห์ IIx (Illumina, CA) ขั้นตอนนี้สร้างลำดับสั้น ๆ อ่านของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ผูกไว้ โดย protein(s) น่าสนใจเริ่มแรก ตัวอย่างจำลองแบกองค์ประกอบดั้งเดิมเมาส์ถูก examined แม้ว่าตำแหน่งออกของ transgene ไม่รู้จัก การจัดตำแหน่งของข้อมูล seq ชิปที่ตำแหน่งเมาส์ภายนอกออกไปคาดว่า เฉพาะ การเพิ่มขึ้นของจำนวนแมปไปยังสถานเหล่านี้ออกรู้จักอ่านควรปรากฏคล้ายกับเหตุการณ์ผันแปร (CNV) หมายเลขสำเนา พื้นเมืองออกตำแหน่งสำหรับเมาส์ Myh6 โปรโมเตอร์ และลำดับการเขียนโค้ด Gnaq transfected เป็นตัวอย่างจีเอ็มโอ 2 (#012460) และสอบสวน Tyro เพิ่มลำดับ TyBS minigene และ Prm1 โปรโมเตอร์ transfected เป็นตัวอย่างจีเอ็มโอ 3 (#017594) Transgene ที่ฉีดเข้าไปในตัวอย่างจีเอ็มโอ 1 ไม่ประกอบด้วยเมาส์ภายนอกลำดับใด ๆ และดังนั้น ไม่มีการแทรกเฉพาะสำหรับตัวอย่างจีเอ็มโอ 1 ถูกประเมินในขั้นตอนนี้ การตรวจสอบยอดที่ภูมิภาคออกเมาส์ภายนอกตัวอย่างป่าชนิดแทนหนึ่งและสามหนูจีเอ็มโอเชิงคุณภาพจะแสดงใน สี่เมาส์ภายนอกภูมิภาคที่ออกสำหรับ Myh6 การ (รูปที่ 3A), Gnaq (รูปที่ 3B), Tyr และ TyBS (chr7 คั่น ด้วย ~ 12 kb) (มะเดื่อ 3C), และ Prm1 (รูป 3D) ยีนจะแสดง ยอดที่ภูมิภาค Myh6 สำหรับแอนติบอดีสามทั้งหมดทดสอบชุดกว้างมากสามารถมองเห็นเมื่อเปรียบเทียบพืชจีเอ็มโอตัวอย่าง 2 แบบธรรมชาติและตัวอย่างจีเอ็มโออื่น ๆ (รูปที่ 3A) ตรงกันข้าม ตัวอย่างจีเอ็มโอ 2 พบการลดลงของยอดสำหรับแอนติบอดี H3K36me3 เช่นเดียวกับการลดเจียมเนื้อเจียมตัวในจำนวนยอดสำหรับที่อื่นสองแอนตี้รอบ exons 4 และ 5 ของยีน Gnaq (รูปที่ 3B) นี่อาจแสดงยกเลิกการเรียกโครมาตินภูมิภาคโดยรอบทั้งภายนอก และจากภายนอก Gnaq ไซต์จึง ทำให้แทนไม่ดีข้อมูล seq ชิ ตัวอย่างจีเอ็มโอ 3 ประกอบด้วยสามลำดับยีนดั้งเดิมเมาส์: Tyr enhancer และ TyBS minigene (มะเดื่อ 3C) และโปรโมเตอร์ Prm1 (รูป 3D) ภูมิภาคเหล่านี้แสดงการเพิ่มจำนวนอ่านแอนติบอดี H3K4me1 และ H3K36me3 เมื่อเทียบกับป่าชนิดและตัวอย่างจีเอ็มโออื่น ๆ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โครงสร้างโครมาติของกลุ่มตัวอย่างเมาส์ดัดแปลงพันธุกรรมได้รับการประเมินสำหรับการตรวจสอบของการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากการแทรกของลำดับดีเอ็นเอยีนเข้าไปในจีโนมของโฮสต์ การศึกษาเหล่านี้มีงานทำวิธีชิป seq สำหรับความละเอียดสูง, การทำแผนที่จีโนมกว้างของดีเอ็นเอโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการเลือกใช้โดยเปรียบเทียบของแผนที่ระหว่างยีนพันธุกรรมและการจับคู่ชนิดป่าตัวอย่างหนู กระบวนการชิป seq ที่เริ่มต้นด้วยการชักนำของการเชื่อมโยงข้ามระหว่างดีเอ็นเอและโปรตีนที่เกี่ยวข้อง โครมาถูกแยกออกแล้วยัดเยียดให้ sonication สำหรับดีเอ็นเอและตัดโครมาถูก immunoprecipitated ใช้แอนติบอดีต่อ histones ที่เฉพาะเจาะจงเฉพาะ H3K4me3, H3K4me1 และ H3K36me3 H3K4me3 เป็นจุดเด่นของการถ่ายทอดอย่างแข็งขันก่อการโปรตีนเขียนโปรแกรมในยูคาริโอ; H3K4me1 เครื่องหมายเพิ่มการถอดรหัสการใช้งานอยู่ และ H3K36me3 ได้รับการเชื่อมโยงกับ exons ของยีนที่ถ่ายทอดอย่างแข็งขัน [11] Immunoprecipitated ตัวอย่างดีเอ็นเอบริสุทธิ์, ligated อะแดปเตอร์ลำดับและ assayed ใช้แพลตฟอร์มรุ่นถัดไปลำดับจีโนมวิเคราะห์ IIx (Illumina, CA) ขั้นตอนนี้สร้างลำดับสั้นอ่านของดีเอ็นเอผูกพันโดยโปรตีน (s) ที่น่าสนใจ.

ในขั้นต้นตัวอย่างยีนแบกองค์ประกอบเมาส์พื้นเมืองมีการตรวจสอบ แม้ว่าที่ตั้งของจีโนมของยีนเป็นที่รู้จักการจัดตำแหน่งของข้อมูลชิป seq ไปยังสถานที่เมาส์ภายนอกจีโนมที่คาดว่า โดยเฉพาะการเพิ่มขึ้นของจำนวนคนอ่านแมปไปยังสถานที่เหล่านี้เป็นที่รู้จักในจีโนมจะปรากฏคล้ายกับการเปลี่ยนแปลงจำนวนสำเนา (CNV) เหตุการณ์ ตำแหน่งจีโนมพื้นเมืองสำหรับเมาส์ Myh6 โปรโมเตอร์และการเข้ารหัสลำดับ Gnaq transfected กลุ่มตัวอย่างที่เป็นจีเอ็มโอ 2 (# 012460) และลำดับเพิ่มมือใหม่, TyBS minigene และ Prm1 ก่อการ transfected เข้าจีเอ็มโอตัวอย่าง 3 (# 017594) ได้รับการตรวจสอบ ยีนฉีดเข้าไปในจีเอ็มโอตัวอย่าง 1 ไม่ได้มีลำดับเมาส์ภายนอกใด ๆ และดังนั้นจึงไม่มีการแทรกที่เฉพาะเจาะจงสำหรับจีเอ็มโอตัวอย่าง 1 ได้รับการประเมินในขั้นตอนนี้ การตรวจสอบคุณภาพของยอดเขาที่เมาส์ภูมิภาคจีโนมภายนอกสำหรับตัวอย่างชนิดป่าตัวแทนหนึ่งและสามหนูจีเอ็มโอแสดงในรูป 3. สี่เมาส์ภูมิภาคจีโนมภายนอกสำหรับ Myh6 (รูป. 3A) Gnaq (รูป. 3B), เทอร์และ TyBS (chr7 แยกจากกันโดย ~ 12 KB) (รูป. 3C) และ Prm1 (รูป. 3D) มียีน แสดงให้เห็นว่า ชุดในวงกว้างมากของยอดเขาที่ภาค Myh6 สำหรับทั้งสามแอนติบอดีทดสอบสามารถมองเห็นได้เมื่อเปรียบเทียบจีเอ็มโอตัวอย่าง 2 ชนิดป่าและอื่น ๆ ตัวอย่างจีเอ็มโอ (รูป. 3A) ในทางตรงกันข้ามจีเอ็มโอตัวอย่างที่ 2 พบว่าลดลงในจำนวนของยอดสำหรับแอนติบอดี H3K36me3 เช่นเดียวกับการลดลงเล็กน้อยในจำนวนของยอดเขาอื่น ๆ สำหรับสองรอบแอนติบอดี exons ที่ 4 และ 5 ของยีน Gnaq (รูป. 3B) นี้อาจบ่งบอกถึงพลังของภูมิภาคโครมาติโดยรอบทั้งภายนอกและเว็บไซต์ Gnaq ภายนอกดังนั้นจึงก่อให้เกิดการแสดงที่น่าสงสารในข้อมูลชิป seq จีเอ็มโอตัวอย่าง 3 มีพื้นเมืองสามลำดับยีนเมาส์: เพิ่มการเทอร์และ TyBS minigene (รูปที่ 3C.) และผู้ก่อการ Prm1 (รูปแบบ 3 มิติ.) ภูมิภาคเหล่านี้แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นของจำนวนเงินของการอ่านสำหรับ H3K4me1 และ H3K36me3 แอนติบอดีเมื่อเทียบกับชนิดป่าและอื่น ๆ ตัวอย่างจีเอ็มโอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

พบโครงสร้างของพันธุกรรมวิศวกรรมเมาส์ตัวอย่างและการตรวจหาการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากการแทรกของดีเอ็นเอในจีโนมลำดับยีนต์ . การศึกษานี้ใช้ชิป seq โดยใช้ความละเอียดสูง genome-wide แผนที่ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เกี่ยวข้องกับโปรตีน ตามด้วยการเลือกที่แผนที่ ระหว่างพันธุกรรมและยีนของหนูตรงกับตัวอย่าง ชิป seq กระบวนการเริ่มต้นด้วยการชักนำให้เกิดการเชื่อมโยงระหว่าง DNA และโปรตีนที่เกี่ยวข้องของ พบแล้วแยกตาม sonication สำหรับการกระจายตัวของดีเอ็นเอ และตัดเป็น immunoprecipitated โครมาตินโดยใช้แอนติบอดีต่อเฉพาะ h3k4me3 h3k4me1 ฮิสโตน , โดยเฉพาะ , และ h3k36me3 . h3k4me3 คือจุดเด่นของงานและโปรตีนนะครับ โปรโมเตอร์ในยูแคริโอต ; h3k4me1 เครื่องหมายใช้งานลองเพิ่ม และ h3k36me3 ได้รับเกี่ยวข้องกับฆอย่างแข็งขันและยีน [ 11 ] immunoprecipitated ตัวอย่างดีเอ็นเอได้บริสุทธิ์ ผูกกับอะแดปเตอร์ sequencing และปริมาณการใช้เครื่องวิเคราะห์ลำดับจีโนม iix แพลตฟอร์มรุ่นถัดไป ( Illumina , CA ) ขั้นตอนนี้สร้างสั้นลำดับอ่านของดีเอ็นเอมัด โดยโปรตีน ( s ) ที่น่าสนใจเริ่ม ต้นโดยถือเมาส์พื้นเมืองเป็นองค์ประกอบการตรวจสอบ ถึงแม้ว่าตำแหน่งพันธุกรรมของยีนไม่รู้จักแนวของชิป seq ข้อมูลไปยังภายนอกเมาส์จีโนมที่ตั้งไว้ . โดยเฉพาะการเพิ่มจํานวนของคนอ่านที่แมปเหล่านี้รู้จักจีโนมที่ตั้งควรปรากฏคล้ายกับจำนวนสำเนาการเปลี่ยนแปลง ( cnv ) เหตุการณ์ พื้นเมืองที่มีตำแหน่งสำหรับเมาส์ myh6 โปรโมเตอร์และลำดับ transfected เป็น GMO ตัวอย่าง 2 นะครับ gnaq ( # 012460 ) และผู้มาใหม่เพิ่มลำดับ tybs minigene และโปรโมเตอร์ prm1 transfected เป็น GMO ตัวอย่างที่ 3 ( # 017594 ) คือ ที่ฉีดเข้าไปในยีนจีเอ็มโอตัวอย่าง 1 ไม่ได้มีใด ๆและดังนั้นจึงไม่เฉพาะเจาะจงภายในลำดับเมาส์ใหม่สำหรับจีเอ็มโอตัวอย่าง 1 ประเมินในขั้นตอนนี้ การตรวจสอบคุณภาพภายในของยอดเขาที่เมาส์จีโนมภูมิภาคสำหรับกลุ่มตัวอย่างของหนึ่งและสามจี หนูจะแสดงในรูปที่ 3 เมาส์สี่โครงสร้างจีโนมภูมิภาคสำหรับ myh6 ( รูปที่ 3 ) , gnaq ( รูปที่ 3B ) , tyr tybs ( chr7 และคั่นด้วย ~ 12 KB ) ( รูปที่ 3 ) และ prm1 ( ภาพ 3 มิติ ) ยีนที่แสดง ในวงกว้างมากตั้งยอดในเขต myh6 ทั้งหมดสามแอนติบอดีทดสอบ ที่สามารถเห็นได้เมื่อเปรียบเทียบกับตัวอย่างที่ 2 ของจีเอ็มโอจีเอ็มโออื่นๆและตัวอย่าง ( รูปที่ 3 ) ในทางตรงกันข้าม , GMO ตัวอย่าง 2 พบว่าลดลงในจํานวนยอดสำหรับแอนติบอดี h3k36me3 ตลอดจนลดเจียมเนื้อเจียมตัวในจํานวนยอดสำหรับสองคนที่มีแอนติบอดีโดยรอบที่ 4 และ 5 ของ gnaq ยีน ( รูปที่ 3B ) นี้อาจบ่งชี้ว่า การใช้งานของโซ่และพื้นที่รอบทั้งภายในภายนอก gnaq เว็บไซต์จึงก่อให้เกิดการยากจนในชิป seq ข้อมูล จีเอ็มโอตัวอย่างที่ 3 ประกอบด้วยสามพื้นเมืองเมาส์ยีน ลำดับ : เทียร์และ minigene tybs Enhancer ( รูปที่ 3 ) และ prm1 โปรโมเตอร์ ( รูปที่ 3 ) ภูมิภาคเหล่านี้แสดงการเพิ่มขึ้นของปริมาณและอ่านสำหรับ h3k4me1 h3k36me3 ) เมื่อเทียบกับยาตัวอย่างจีเอ็มโอและอื่น ๆ