An approximate 2.0 kb DNA frag- men

An approximate 2.0 kb DNA frag- ment of cry2Al1 from pTZ57R/T-cry2Al1 recombinant cloning vec- tor and 5.4 kb fragment of pET22b (+) were geleluted and purified using GeneJETTM Gel Extraction Kit
The full length sequence of cry2Al1 gene was then ligated with pET-22b vector to generate the recombinant construct pET22b-cry2Al1. The ligated product was transformed into E. coli BL21 (DE3) pLysS and the positive clones obtained by selection
medium (LB agar supplemented with ampicillin 50 lg/ml) were
further confirmed by PCR and restriction analysis. Transformants were cultured 12 h in LB medium with ampicillin (50 lg/ml) at
37 C. It was subcultured into fresh LB/ampicillin medium, grown several hours at 37 C to an OD590 = 0.4 and then induced using IPTG. Before harvesting, the cells were incubated for 6 h at 37 C. To analyze the induced protein, an equivalent of 1.0 ml of cells was resuspended in 0.1 ml of cracking buffer and heated at
100 C for 5 min immediately prior to loading a 20 ll aliquot of
sample onto an SDS-polyacrylamide gel (Laemmli, 1970) using
10% running and 4% stacking gel. The molecular mass of proteins was determined using higher range protein molecular weight marker (myosin rabbit muscle 205 kDa, phosphorylase b 97.4 kDa, bovine serum albumin 66 kDa, ovalbumin 43 kDa and carbonic anhydrase 29 kDa) obtained from GeNeiTM, Bangalore, India.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

มีประมาณ 2.0 kb DNA frag-ment ของ cry2Al1 จาก pTZ57R/T-cry2Al1 recombinant โคลนวี-tor และ 5.4 kb ส่วนของ pET22b (+) ได้ geleluted และใช้ชุด GeneJETTM เจลสกัดบริสุทธิ์ ลำดับแบบยาวของยีน cry2Al1 ถูกแล้วกเดี่ยวกับ 22b สัตว์เวกเตอร์เพื่อสร้างสร้าง recombinant pET22b-cry2Al1 ผลิตภัณฑ์ควบธีสซูส E. coli BL21 (DE3) pLysS และโคลนบวกได้ โดยเลือกมีขนาดกลาง (ปอนด์วุ้นเสริม ด้วยโกคอ 50 lg/ml)การ ยืนยัน โดยวิเคราะห์ PCR และข้อจำกัด Transformants ถูกล้างปานกลางปอนด์กับโกคอ (50 lg มิลลิลิตร) ที่ 12 hค. 37 มันคือ subcultured เป็นปานกลางปอนด์/โกคอสด โตหลายชั่วโมงที่ 37 C OD590 การ = 0.4 และเหนี่ยวนำ IPTG ใช้ ก่อนการเก็บเกี่ยว เซลล์ได้รับการกกที่ 37 c 6 h การวิเคราะห์โปรตีนเหนี่ยวนำ การเทียบเท่ากับ 1.0 ml ของเซลล์ resuspended ในกรอบบัฟเฟอร์ 0.1 มิลลิลิตร และความร้อนที่100 C 5 นาทีทันทีก่อนที่จะโหลดส่วนลงตัวจะเป็น 20 ของตัวอย่างลงในการตรวจสอบวิเคราะห์ SDS เจล (Laemmli, 1970) โดยใช้ใช้ 10% และ 4% ซ้อนเจล มวลโมเลกุลของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยใช้สูงช่วงโปรตีนน้ำหนักโมเลกุลเครื่องหมาย (ไมโอซินกระต่ายกล้าม 205 kDa, phosphorylase b 97.4 kDa วัว serum albumin 66 kDa, ovalbumin 43 kDa และสึกคาร์บอ anhydrase 29 kDa) ได้จาก GeNeiTM บังกาลอร์ อินเดีย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดีเอ็นเอประมาณ 2.0 KB frag- ment ของ cry2Al1 จาก pTZ57R / T-cry2Al1 recombinant โคลน Tor vec- และ 5.4 KB ส่วนของ pET22b (+) ถูก geleluted บริสุทธิ์โดยใช้เจลสกัด GeneJETTM Kit
ลำดับความยาวของ cry2Al1 ยีน ligated แล้วด้วย สำหรับผู้รักสัตว์ 22b เวกเตอร์เพื่อสร้าง recombinant สร้าง pET22b-cry2Al1 ผลิตภัณฑ์ ligated ก็กลายเป็นเชื้อ E. coli BL21 (DE3) pLysS และโคลนบวกได้โดยการเลือก
ปานกลาง (LB agar เสริมด้วย ampicillin 50 LG / มล.) ได้รับการ
ยืนยันต่อไปโดยวิธี PCR และการวิเคราะห์ข้อ จำกัด Transformants เลี้ยง 12 ชั่วโมงในสื่อ LB กับจิบูตี (50 LG / ml) ที่
37 องศาเซลเซียสมันถูกเลี้ยงเข้ากลางปอนด์ / ampicillin สดที่ปลูกเป็นเวลาหลายชั่วโมงที่ 37 C ไปยัง OD590 = 0.4 แล้วเหนี่ยวนำให้เกิดการใช้ IPTG ก่อนที่จะเก็บเกี่ยวเซลล์ที่ถูกบ่มเป็นเวลา 6 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในการวิเคราะห์โปรตีนเทพเทียบเท่า 1.0 มล. ของเซลล์ถูก resuspended ใน 0.1 มิลลิลิตรแตกกันชนและให้ความร้อนที่
100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีทันทีก่อนที่จะโหลด 20 LL หารของ
กลุ่มตัวอย่างที่เข้าสู่ระบบ SDS-polyacrylamide เจล (Laemmli 1970) โดย
10% ทำงานและเจลซ้อน 4% มวลโมเลกุลของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยใช้เครื่องหมายช่วงโปรตีนสูงน้ำหนักโมเลกุล (myosin กล้ามเนื้อกระต่าย 205 กิโลดาลตันโฟ B 97.4 กิโลดาลตัน, อัลบูมิวัวซีรั่ม 66 กิโลดาลตัน ovalbumin 43 กิโลดาลตันและ anhydrase คาร์บอ 29 กิโลดาลตัน) ที่ได้รับจาก GeNeiTM บังกาลอร์ประเทศอินเดีย