EXAMPLES[0037] The การประดิษฐ์นี้ w

EXAMPLES
[0037] The การประดิษฐ์นี้ will be specifically described hereinbelow by
10 the Examples, without intending to limit the scope of the การประดิษฐ์นี้
to the following Examples.
[0038] Example 1 < Screening Using ความสามารถการเพิ่มจำนวน in Artificial
Intestinal Solution as Index >
Among the lactic acid bacteria owned by the present inventors, the
15 ความสามารถการเพิ่มจำนวน in an สารละลายลำไส้เทียม was evaluated for
about 480 strains which were mainly vegetable lactic acid bacteria (including JCM strains).
[0039] Concretely, first, each of the lactic acid bacteria was ถูกปลูกเชื้อ from
a glycerol stock to an MRS medium (Difco Laboratories) (10mL) in an
20 ปริมาณ of 1 v/v% each, and the bacterial cells were cultured at 35°C for
16 to 17 hours. Next, 0D660 of each culture medium (absorbance at
660 nrn) was measured with a spectrophotometer UV-1600 (Shimadzu Corporation), and a 100 µL solution prepared with the MRS medium so that 0D660 of each culture medium would be 10 was ถูกปลูกเชื้อ to an
25 สารละลายลำไส้เทียม (10mL) of the composition shown hereinbelow.

Thereafter, the bacterial cells were cultured at 37°C for 6 hours while
gently shaking, and OD660 was then measured to obtain a proliferation fold (0D660 after 6 hours/OD660 at inoculation). The representative screening results are shown in Table 3 and รูป 1.

< สารละลายลำไส้เทียม (pH 6.45) >
MRS Medium 9 mL
10 w/v% bile acid (Wako Pure Chemical 1 mL
Industries, Ltd.) solution
1 w/v% Pancreatin (from Porcine: SIGMA) 100 p,L
Here, the bile acid solution and the pancreatin solution, which were made sterile by treating the solution with a 0.22 gm filter (PVDF membrane, manufactured by Millipore), were used.
[Table 3]



Genera, สปีชีส์









Lactobacillus pentosus









Lactobacillus plantarum



Lactobacillus brevis




Lactobacillus
casei




Lactobacillus fertnenturn









Strain

TUA4337L
(การประดิษฐ์นี้)
JCM1558
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
JCM1149
16
17
18
19
JCM1059
20
21
22
23
24
JCM1134
25
26
27
28
29
30
JCM1173
31
32
33
34






Table 3
Proliferation Fold (times)
0D660 after 6 hours (0D660 after 6 hours/
01)660 at Inoculation
As a result, it can be seen that the proliferation folds are more likely
to be high in Lactobacillus pentosus and Lactobacillus plantarum, among which the Lactobacillus pentosus สายพันธุ์ TUA4337L has an especially high proliferation fold and excellent ความสามารถการเพิ่มจำนวน in the ทางเดินลำไส้.
5 [0042] Example 2 < Evaluation of in vivo ความสามารถการเพิ่มจำนวน in Intestinal
Tract >
Mice subjected to a high-fat diet ad libitum were ให้ with the สายพันธุ์ TUA4337L prepared as follows, and the number of bacteria excreted was quantified. Concretely, C57BL/6J mice (10-week old, male)
10 were ให้ in a single dose with about 1.0 x 109 lactic acid bacteria
cells (corresponding to 250 µL of bacterial cell suspension) at 10 o'clock in the morning (n=5), using the การให้ sample prepared as follows. < Preparation of การให้ Samples (Viable Bacteria-Containing Samples) >
15 [1] การปลูกเชื้อ สายพันธุ์ TUA4337L from a glycerol stock to an MRS
medium (30 mL) in an ปริมาณ of 1 v/v%;
[2] culturing bacterial cells (35°C, 20 hours);
[3] centrifuging the culture medium (8,000 rpm, 5 min) to remove the
ส่วนลอย, and suspending in 30 mL of PBS(-);
20 [4] centrifuging the suspension of [3] (8,000 rpm, 5 min) to remove the
ส่วนลอย, and re-suspending in 5 mL of PBS(-);
[5] counting the number of bacteria with a microscope; and
[6] dispensing a solution containing 20,000,000,000 cells to a 15 mL
centrifugation tube, centrifuging (8,000 rpm, 5 min) the solution to remove
25 ส่วนลอย, and thereafter suspending in 5 mL of a liquid feed (high-fat



19

diet 60 kcal %FAT: Research Diet) to prepare a bacterial cell suspension (liquid feed was prepared with PBS(-)).
[0043] Thereafter, all the stools of two-day portions were collected in 4
divided times (the afternoon of the day the test started, the morning and the
5 afternoon of the following day, and the morning of the day after the
following day), the number of bacteria for all the stools was quantified by the following method, and the rate of increase in สายพันธุ์ TUA4337L in the intestine in each of mice (the number of bacteria for all the stools/the
number of ให้ bacteria) was calculated. The results are shown in
10 Table 4.
< Method for Measuring the Number of Bacteria According to Real-Time PCR >
[1] adding 1 mL of PBS(-) to 100 mg of stools (wet weight basis), and then disrupting the stools with a spatula;
15 [2] collecting a 100 mg portion of the stools to an Eppendorf
tube (registered trademark), centrifuging (15,000 rpm, 5 min) the stools to
remove ส่วนลอย, and suspending the precipitation in 1 mL of PBS(-)
(the procedures of centrifuging to suspending being repeated twice);
[3] removing ส่วนลอย from the suspension of [2], and thereafter
20 extracting DNA from the suspension with a kit (QIAamp DNA Stool Mini
Kit: QIAGEN)
(the cell disruption being carried out by repeating the procedures three
times of adding 300 mg of glass beads (150 to 212 pm: SIGMA), 300 [IL of phenolichloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), and 900 µL of buffer ASL
25 (reagents in the kit) to the stools, centrifuging the mixture with MULTI-




20

BEADS SHOCKER MB-200 (YASUI KIKAI) at 3,000 rpm for 1 minute, and allowing to stand on ice for 1 minute); and
[4] quantifying the lactic acid bacteria in the contents of the ทางเดินลำไส้ according to real-time PCR under the conditions shown hereinbelow:
5 ((Conditions for Real-Time PCR))
(1) Ten microliters of SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio), 0.8 RI, of
each primer (10 pin, 0.4 !IL of ROX reference Dye II, 61IL of sterile water, and 2 tt,L of a DNA solution are mixed, to prepare a liquid reaction mixture for PCR. As primers, the following primers specifically detecting 16S
10 rDNA of Lactobacillus pentosus and Lactobacillus plantarum are used (the
16S rDNA sequences of Lactobacillus pentosus and Lactobacillus
plantarum being 100% identical).
primer 1: 5'-GCAAGTCGAACGAACTCTGGTATT-3'
(SEQ ID NO: 2)
15 primer 2: 5'-CGGACCATGCGGTCCAA-3' (SEQ ID NO: 3)
(2) PCR is performed with 7500 Real Time PCR System (Applied
Biosystems), ซึ่งประกอบรวมด้วย, subsequent to a treatment at 95°C for 30 seconds, carrying out a total of 60 cycles of reactions, โดยที่ one cycle consists of 95°C for 5 seconds and 60°C for 34 seconds. The copy number per one
20 gram of the contents of ทางเดินลำไส้ is obtained from the fluorescent
intensity obtained, a total ปริมาณ of contents of the ทางเดินลำไส้, and the dilution folds.
(3) Separately, the copy number of 16S rDNA per one cell is obtained, and the copy number is converted to the number of bacteria. Here, it is
25 confirmed in the mice not ให้ with the lactic acid bacteria that




21
both Lactobacillus pentosus and Lactobacillus plantarum are not detected according to the above real-time PCR.

[0044] [Table 4]
Table 4
Number of Bacteria of Increased Rate

Individual
TUA4337L in Stools
No .
(cells)
1 3.6 x 109
2 1.9 x 109
3 2.6 x 109
4 1.6 x 109
5 1.4 x 109
Mean 2.2 x 109

(Number of Bacteria per Entire Stools/
Number of Bacteria ให้)
3.6
1.9
2.6
1.6
1.4
2.2




5 [0045] Example 3 < Effects of การขัดขวาง Weight Gains >
C57BL/6J mice (8-week-old, male) were grouped into four groups of an ordinary diet group, a high-fat diet group, a high fat diet + viable
bacteria group, and a high-fat diet + dead bacteria group (n = 10 each), and each of the groups was continuously given with the diets as shown in the
10 following Table 5 for 32 days, and the body weights were measured daily
and a mean was calculated. The transition in the mean is shown in รูป 2.
Here, intergroup comparisons were conducted using a t-test with a

significant level of 0.05.

[0046] Concretely, as to diet, each group of Table 5 was given with each

15 solid feed ad libitum. The high-fat diet + viable bacteria group was
ให้ with an การให้ sample prepared in the same manner as in Example 2. The high-fat diet + dead bacteria group was ให้

with an การให้ sample prepared as follows so that the lactic acid
bacteria would be contained in an ปริมาณ of about 1,000,000,000 cells per day. On the other hand, the ordinary diet group was ให้ with 250 pL of PBS(-) not containing the lactic acid bacteria, and the high-fat
5 diet group was ให้ with 250 pL of a liquid feed not containing
the lactic acid bacteria.
[0047]
[Table 5]
Table 5

Diet
Group

Ordinary Diet Group
High-Fat Diet Group
High-Fat Diet +
Viable Bacteria Group
High-Fat Diet +
Dead Bacteria Group
* 10 kcal %FAT (Research Diet)
60 kcal %FAT (Research Diet)

Lactic Acid Bacteria Solid Diet
ให้
10 kcal %FAT -
60 kcal %FAT -
TUA4337L
60 kcal %FAT
Viable Bacteria
TUA4337L
60 kcal %FAT
Dead Bacteria



10 [0048] < Preparation of การให้ Samples (Dead Bacteria-Containing
Samples) >
[1] การปลูกเชื้อ สายพันธุ์ TUA4337L in an ปริมาณ of 1 v/v % from a
glycerol stock to an MRS medium (30 mL);
[2] culturing the bacterial cells (35°C for 20 hours);

15 [3] centrifuging the culture medium (8,000 rpm, 5 min) to remove
ส่วนลอย, and thereafter suspending in 30 mL of PBS(-);



23

[4] centrifuging the suspension of [3] (8,000 rpm, 5 min) to remove ส่วนลอย, and thereafter re-suspending in 5 mL of PBS(-);
[5] counting the number of bacteria with a microscope;
[6] dispensing a solution containing 20,000,000,000 cells to a 15 mL
5 centrifugation tube, centrifuging the solution (8,000 rpm, 5 min) to remove
ส่

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่าง[0037] การประดิษฐ์นี้จะมีโดยเฉพาะอธิบาย hereinbelow10 อย่าง โดยไม่ตั้งใจเพื่อจำกัดขอบเขตของการการประดิษฐ์นี้กับตัวอย่างต่อไปนี้ตัวอย่าง [0038] 1 < ตรวจคัดกรองการใช้ความสามารถการเพิ่มจำนวนในการประดิษฐ์แก้ปัญหาลำไส้เป็นดัชนี >ระหว่างแบคทีเรียกรดแลกติกที่เป็นเจ้าของนักประดิษฐ์ที่นำเสนอ การ15 ความสามารถการเพิ่มจำนวนในสารละลายลำไส้เทียมถูกประเมินประมาณ 480 strains ที่ถูกแบคทีเรียกรดแลกติกผักส่วนใหญ่ (รวมถึงสายพันธุ์ JCM)[0039] รูปธรรม แรก แต่ละของแบคทีเรียกรดแลกติกถูกถูกปลูกเชื้อจากหุ้นกลีเซอรตัวปานกลางนาง (Difco Laboratories) (10 มล.) ในการปริมาณ 20 ของ 1 v/v% และเซลล์แบคทีเรียมีอ่างที่ 35° C สำหรับ16-17 ชั่วโมง ถัดไป D 0 660 ของกลางแต่ละวัฒนธรรม (absorbance ที่660 nrn) ถูกวัด ด้วยเครื่องทดสอบกรดด่าง UV-1600 (บริษัท Shimadzu), และโซลูชัน 100 µL พร้อมสื่อนางที่ D 0 660 ของกลางแต่ละวัฒนธรรมจะ 10 ถูกถูกปลูกเชื้อเพื่อการสารละลายลำไส้เทียม 25 (10 มล.) ขององค์ประกอบที่แสดง hereinbelowหลังจากนั้น เซลล์แบคทีเรียมีอ่างที่ 37° C สำหรับ 6 ชั่วโมงในขณะที่แล้วเขย่าเบา ๆ และ OD660 ถูกวัดรับพับการงอก (0D 660 หลังชั่วโมง 6 OD660 ที่ inoculation) ผลการคัดกรองพนักงานที่แสดงในตาราง 3 และรูปที่ 1<สารละลายลำไส้เทียม (pH 6.45) >นางกลาง 9 mLกรดน้ำดี 10 w/v% (Wako เพียวเคมี 1 mLอุตสาหกรรม จำกัด) โซลูชั่น1 w/v% Pancreatin (จาก Porcine: ซิก) 100 p, Lที่นี่ โซลูชันกรดน้ำดีและ pancreatin solution ซึ่งได้ผ่านการฆ่าเชื้อ โดยรักษาโซลูชันด้วยตัวกรอง 0.22 กรัม (PVDF เมมเบรน ผลิต โดยมาก), ใช้[ตาราง 3]สกุล สปีชีส์Pentosus แลคโตบาซิลลัสPlantarum แลคโตบาซิลลัสเทนเซอร์แลคโตบาซิลลัสแลคโตบาซิลลัส caseiFertnenturn แลคโตบาซิลลัส ต้องใช้TUA4337L(การประดิษฐ์นี้) JCM1558123456789101112131415JCM114916171819JCM10592021222324JCM1134252627282930JCM117331323334 ตาราง 3แพร่หลายพับ (ครั้ง)0D 660 หลังจาก 6 ชั่วโมง (D 0 660 หลังจาก 6 ชั่วโมง /01) 660 ที่ Inoculationดัง ดังจะเห็นได้ว่า พับขยายตัวมีแนวโน้มจะสูง pentosus แลคโตบาซิลลัสและแลคโตบาซิลลัส plantarum ระหว่างสายพันธุ์ pentosus แลคโตบาซิลลัส TUA4337L มีการงอกสูงโดยเฉพาะอย่างยิ่งการพับ และความสามารถการเพิ่มจำนวนในทางเดินลำไส้ดี5 ตัวอย่าง [0042] 2 < ประเมินของความสามารถการเพิ่มจำนวนในลำไส้ในสัตว์ทดลองทางเดิน >หนูต้องการอาหารที่ไขมันสูง ad libitum ให้กับสายพันธุ์ TUA4337L เตรียมดัง และจำนวนของแบคทีเรีย excreted เป็น quantified รูปธรรม C57BL/6J หนู (10 - สัปดาห์เก่า ชาย)10 มีให้ในปริมาณเดียวกับประมาณ 1.0 x 109 แบคทีเรียกรดแลกติกเซลล์ (ที่สอดคล้องกับ µL 250 ของเซลล์แบคทีเรียระงับ) ที่ 10 โมงเช้า (n = 5), โดยใช้ตัวอย่างการให้ที่เตรียมไว้ดังนั้น <เตรียมตัวอย่างการให้ (ทำงานได้ประกอบด้วยแบคทีเรียตัวอย่าง) >15 [1] การปลูกเชื้อสายพันธุ์ TUA4337L จากหุ้นกลีเซอรไปเป็นนางขนาดกลาง (30 มล.) ในการปริมาณ 1 v/v%[2] culturing เซลล์แบคทีเรีย (35° C, 20 ชั่วโมง);[3] centrifuging สื่อวัฒนธรรม (8000 รอบต่อนาที 5 นาที) เพื่อเอาการส่วนลอย และระงับใน 30 mL ของ PBS(-)20 [4] centrifuging ทุเลา [3] (8000 รอบต่อนาที 5 นาที) เพื่อเอาการส่วนลอย และการระงับใน 5 mL ของ PBS(-)[5] นับจำนวนแบคทีเรีย ด้วยกล้องจุลทรรศน์ และ[6] มหาศาลโซลูชันประกอบด้วยเซลล์ 20,000,000,000 15 mLcentrifugation หลอด centrifuging โซลูชันการเอาออก (8000 รอบต่อนาที 5 นาที)25 ส่วนลอย และหลังจากนั้นระงับใน 5 mL ของน้ำยาอาหาร (ไขมันสูง 19อาหาร 60% กิโลแคลอรีไขมัน: วิจัยอาหาร) เพื่อเตรียมความพร้อมระงับเซลล์แบคทีเรีย (อาหารเหลวเตรียมไว้กับ PBS(-))[0043] Thereafter ทั้งหมดอุจจาระของสองวันบางส่วนถูกเก็บรวบรวมใน 4หารเวลา (ตอนเช้า ตอนบ่ายของวันที่เริ่มต้นการทดสอบและช่วงบ่าย 5 วันต่อไปนี้ และเช้าของวันหลังจากต่อวัน จำนวนแบคทีเรียในอุจจาระทั้งหมดถูก quantified โดยวิธีต่อไปนี้ และอัตราการเพิ่มขึ้นของสายพันธุ์ TUA4337L ในลำไส้ในของหนู (จำนวนแบคทีเรียในอุจจาระทั้งหมด/การ มีคำนวณจำนวนแบคทีเรียให้) ผลลัพธ์จะแสดงอยู่ใน10 ตาราง 4<วิธีการวัดจำนวนของแบคทีเรียตาม PCR จริง >[1] เพิ่ม 1 mL ของ PBS(-) 100 mg ของอุจจาระ (ข้อมูลพื้นฐานน้ำหนักเปียก), แล้ว อาจรบกวนการอุจจาระกับพาย15 [2] เก็บส่วน 100 มิลลิกรัมของอุจจาระมี Eppendorfหลอด (จดทะเบียนเครื่องหมายการค้า), centrifuging อุจจาระไป (15000 รอบต่อนาที 5 นาที)เอาส่วนลอย ระงับการฝนใน 1 mL ของ PBS(-)(การปฏิบัติงานของ centrifuging เพื่อระงับการซ้ำสองครั้ง);[3] เอาส่วนลอยจากการระงับ [2], และหลังจากนั้น20 แยกดีเอ็นเอจากการระงับกับชุด (QIAamp ดีเอ็นเอเก้าอี้ขนาดเล็กชุด: QIAGEN)(เซลล์ทรัพยการดำเนินการ โดยทำซ้ำขั้นตอน 3เวลาเพิ่ม 300 มก.ลูกปัดแก้ว (150-212 pm: ซิก), 300 [IL phenolichloroform/isoamyl แอลกอฮอล์ (25:24:1), และ 900 µL บัฟเฟอร์ ASL25 (reagents ในชุด) ไปอุจจาระ centrifuging ผสมกับมัลติ- 20ลูกปัด SHOCKER MB-200 (ตั้งแต่ KIKAI) ที่ 3000 rpm 1 นาที และอนุญาตให้ยืนบนน้ำแข็งใน 1 นาที); และ[4] quantifying แบคทีเรียกรดแลกติกในเนื้อหาของทางเดินลำไส้ตาม PCR จริงภายใต้เงื่อนไขที่แสดง hereinbelow:5 ((เงื่อนไขสำหรับ PCR แบบเรียลไทม์))(1) microliters สิบของ SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio), 0.8 RI ของแต่ละสีรองพื้น (10 pin, 0.4 อ้างอิง IL ROX ย้อม II, 61IL ฆ่าเชื้อน้ำ และ 2 tt, L ของโซลูชันที่ดีเอ็นเอผสม การเตรียมส่วนผสมของเหลวปฏิกิริยา PCR เป็นไพรเมอร์ ไพรเมอร์ที่ต่อไปนี้โดยเฉพาะตรวจ 16Sใช้ 10 rDNA pentosus แลคโตบาซิลลัสและแลคโตบาซิลลัส plantarum (16S rDNA ลำดับ pentosus แลคโตบาซิลลัสและแลคโตบาซิลลัสplantarum ได้ 100% เหมือนกัน)สีรองพื้น 1:5 ' - GCAAGTCGAACGAACTCTGGTATT - 3(เลขลำดับรหัส: 2)สีรองพื้น 15 2:5 ' - CGGACCATGCGGTCCAA - 3 (ลำดับ ID ไม่: 3)(2) มีดำเนินการ PCR มี 7500 Real Time PCR ระบบ (ประยุกต์Biosystems), ซึ่งประกอบรวมด้วย subsequent to บำบัดที่ 95 ° C เวลา 30 วินาที การดำเนินการทั้งหมด 60 รอบของปฏิกิริยา โดยที่วงจรหนึ่งประกอบด้วย 95 ° C 5 วินาที และ 60 ° C สำหรับวินาที สำเนาหมายเลขต่อหนึ่ง20 กรัมของเนื้อหาของทางเดินลำไส้ได้รับจากฟลูออเรสเซนต์ที่ความรุนแรงที่ได้รับ ปริมาณรวมของเนื้อหาทางเดินลำไส้ และพับเจือจาง(3) แยก รับจำนวนสำเนา 16S rDNA ต่อหนึ่งเซลล์ และสำเนาหมายเลขจะถูกแปลงเป็นจำนวนแบคทีเรีย นี่ เป็น25 ยืนยันในหนูให้ไม่ มีแบคทีเรียกรดแลกติกที่ 21pentosus แลคโตบาซิลลัสและแลคโตบาซิลลัส plantarum จะพบตาม PCR จริงข้างต้น[0044] [ตาราง 4]ตาราง 4จำนวนแบคทีเรียเพิ่มอัตรา แต่ละคนTUA4337L ในอุจจาระ ไม่ใช่(เซลล์)3.6 1 x 109 2 1.9 x 109 2.6 3 x 109 1.6 4 x 1091.4 5 x 109 หมายถึง 2.2 x 109 (จำนวนแบคทีเรียต่ออุจจาระทั้งหมด / จำนวนแบคทีเรียให้)3.61.92.61.61.42.2 5 [0045] ตัวอย่าง 3 <ผลกำไรน้ำหนักการขัดขวาง >หนู C57BL/6J (8 สัปดาห์อายุ ชาย) ถูกจัดเป็น 4 กลุ่มเป็นกลุ่มอาหารทั่วไป กลุ่มอาหารไขมันสูง อาหารไขมันสูง และทำงานได้ แบคทีเรีย กลุ่ม และอาหารไขมันสูง + กลุ่มแบคทีเรียตาย (n = 10 แต่ละ), และแต่ละกลุ่มอย่างต่อเนื่องให้กับอาหารมาก10 ต่อ 5 ตาราง 32 วัน และน้ำหนักร่างกายที่วัดทุกวันและค่าเฉลี่ยที่คำนวณ การเปลี่ยนแปลงในค่าเฉลี่ยจะแสดงในรูป 2ที่นี่ เปรียบเทียบ intergroup ได้ดำเนินการโดยใช้ t-ทดสอบด้วยการอย่างมีนัยสำคัญระดับ 0.05[0046] รูปธรรม เกี่ยวกับอาหาร ตาราง 5 กลุ่มแต่ละกลุ่มให้กับแต่ละ15 แข็งอาหาร ad libitum อาหารไขมันสูง + ได้แบคทีเรียกลุ่มให้กับตัวอย่างการให้เตรียมไว้ในลักษณะเดียวกันใน 2 ตัวอย่าง อาหารไขมันสูง + ตายให้มีกลุ่มแบคทีเรียมีตัวอย่างการให้การเตรียมดังนั้นกรดแลคติแบคทีเรียจะอยู่ในปริมาณของเซลล์ประมาณ 1,000,000,000 ต่อวัน บนมืออื่น ๆ กลุ่มอาหารธรรมดามีให้กับ 250 pL PBS(-) ไม่ประกอบด้วยแบคทีเรียกรดแลกติก และไขมันสูง5 อาหารกลุ่มให้กับ 250 pL ของน้ำยาเลี้ยงไม่ประกอบด้วยแบคทีเรียกรดแลกติก[0047][ตาราง 5]ตาราง 5อาหารกลุ่ม กลุ่มอาหารธรรมดา กลุ่มอาหารที่ไขมันสูงอาหารไขมันสูง +กลุ่มแบคทีเรียทำงานได้อาหารไขมันสูง + กลุ่มแบคทีเรียตาย* 10% กิโลแคลอรีไขมัน (วิจัยอาหาร)60% กิโลแคลอรีไขมัน (วิจัยอาหาร) อาหารแข็งของแบคทีเรียกรดแลกติกให้10% กิโลแคลอรีไขมัน-60% กิโลแคลอรีไขมัน-TUA4337L60% กิโลแคลอรีไขมันแบคทีเรียทำงานได้TUA4337L60% กิโลแคลอรีไขมันแบคทีเรียที่ตายแล้ว 10 [0048] < เตรียมตัวอย่างการให้ (ตายแบคทีเรียประกอบด้วยตัวอย่าง) >[1] การปลูกเชื้อสายพันธุ์ TUA4337L ในมีปริมาณ 1% v/v จากการกลีเซอรสต็อกขนาดกลางนาง (30 มล.);[2] culturing เซลล์แบคทีเรีย (35° C 20 ชั่วโมง);15 [3] centrifuging วัฒนธรรมสื่อ (8000 รอบต่อนาที 5 นาที) เอาส่วนลอย และหลังจากนั้นระงับใน 30 mL ของ PBS(-) 23[4] centrifuging ทุเลา [3] (8000 รอบต่อนาที 5 นาที) เพื่อลบส่วนลอย และหลังจากนั้นการระงับใน 5 mL ของ PBS(-)[5] นับจำนวนแบคทีเรีย ด้วยกล้องจุลทรรศน์[6] มหาศาลโซลูชันประกอบด้วยเซลล์ 20,000,000,000 15 mL5 centrifugation หลอด centrifuging โซลูชัน (8000 รอบต่อนาที 5 นาที) เอาส่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่าง
[0037] ในการประดิษฐ์นี้จะอธิบายเฉพาะ hereinbelow จาก
10 ตัวอย่างโดยไม่ตั้งใจที่จะ จำกัด
ขอบเขตของการประดิษฐ์นี้กับตัวอย่างต่อไปนี้.
[0038] ตัวอย่างที่ 1
<คัดกรองการใช้ความสามารถการเพิ่มจำนวนในการประดิษฐ์ลำไส้วิธีการแก้ปัญหาในขณะที่ดัชนี>
ท่ามกลางแบคทีเรียกรดแลคติกเป็นเจ้าของโดยนักประดิษฐ์ปัจจุบันที่
15
ความสามารถการเพิ่มจำนวนในสารละลายลำไส้เทียมได้รับการประเมินเกี่ยวกับ480 สายพันธุ์ซึ่งเป็นผักส่วนใหญ่แบคทีเรียกรดแลคติก (รวมถึงสายพันธุ์ JCM).
[0039] รูปธรรมครั้งแรกของแต่ละแบคทีเรียกรดแลคติกเป็นถูกปลูกเชื้อจากสต็อกกลีเซอรอลที่จะเป็นสื่อ MRS (Difco ห้องปฏิบัติการ) (10 มิลลิลิตรซึ่งหัวใจ) ใน 20 ปริมาณ 1 ปริมาตร / ปริมาตร% ในแต่ละครั้งและเซลล์แบคทีเรียได้รับการเพาะเลี้ยงที่ 35 องศาเซลเซียส สำหรับ16-17 ชั่วโมง ถัดไป 0D660 ของแต่ละสื่อวัฒนธรรม (การดูดกลืนแสงที่660 NRN) วัดกับ spectrophotometer UV-1600 (Shimadzu คอร์ปอเรชั่น) และเป็นทางออกที่ 100 ไมโครลิตรเตรียมกับสื่อ MRS เพื่อให้ 0D660 ของแต่ละสื่อวัฒนธรรมจะเป็น 10 ก็ถูกปลูกเชื้อ ไปยัง25 สารละลายลำไส้เทียม (10 มิลลิลิตรซึ่งหัวใจ) ขององค์ประกอบที่แสดง hereinbelow. หลังจากนั้นเซลล์แบคทีเรียเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 6 ชั่วโมงในขณะที่ค่อยๆสั่นและOD660 วัดแล้วจะได้รับการขยายเท่า (0D660 หลังจาก 6 ชั่วโมง / OD660 ที่ฉีดวัคซีน) การตรวจคัดกรองผลการตัวแทนที่แสดงในตารางที่ 3 และรูปที่ 1 <สารละลายลำไส้เทียม (pH 6.45)> MRS กลาง 9 มิลลิลิตร10 w / v% กรดน้ำดี (Wako บริสุทธิ์ทางเคมี 1 มิลลิลิตรอุตสาหกรรมจำกัด ) สารละลาย1 w / v% Pancreatin (จากสุกร: SIGMA) 100 พี, L นี่สารละลายกรดน้ำดีและวิธีการแก้ปัญหา Pancreatin ซึ่งถูกสร้างขึ้นผ่านการฆ่าเชื้อโดยการรักษาวิธีการแก้ปัญหาที่มี 0.22 กรัมกรอง (เมมเบรน PVDF ผลิตโดยค) ถูกนำมาใช้. [ตารางที่ 3 ] จำพวก, สปีชีส์Lactobacillus pentosus Lactobacillus plantarum Lactobacillus brevis Lactobacillus casei แลคโตบาซิลลัส 3 ขยายพับ (เท่า) 0D660 หลังจาก 6 ชั่วโมง (0D660 หลังจาก 6 ชั่วโมง / 01) 660 ที่การฉีดวัคซีนเป็นผลก็จะเห็นได้ว่าเท่างอกมีแนวโน้มที่จะสูงในกล้าเชื้อLactobacillus pentosus และ plantarum แลคโตบาซิลลัสหมู่ที่แลคโตบาซิลลัส pentosus สายพันธุ์ TUA4337L มีเท่างอกสูงโดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ดีเยี่ยมและความสามารถการเพิ่มจำนวนในทางเดินลำไส้. 5 [0042] ตัวอย่างที่ 2 <ประเมินในร่างกายความสามารถการเพิ่มจำนวนในลำไส้ทางเดิน> หนูยัดเยียดให้ไขมันสูง โฆษณาอาหารกินอย่างเต็มที่ให้ถูกกับสายพันธุ์ TUA4337L เตรียมดังต่อไปนี้และจำนวนของเชื้อแบคทีเรียที่ถูกขับออกมาวัด รูปธรรม C57BL / 6J หนู (10 สัปดาห์เก่าชาย) 10 ให้ได้ในครั้งเดียวที่มีประมาณ 1.0 x 109 แบคทีเรียกรดแลคติกเซลล์(ตรงกับ 250 ไมโครลิตรของการระงับเซลล์ของแบคทีเรีย) 10 โมงเช้า (n = 5) โดยใช้การจัดทำตัวอย่างให้ดังต่อไปนี้ <การเตรียมการให้ตัวอย่าง (ทำงานได้แบคทีเรียที่มีตัวอย่าง)> 15 [1] การปลูกเชื้อสายพันธุ์ TUA4337L จากสต็อกกลีเซอรอลไปยังนางกลาง(30 มิลลิลิตร) ในปริมาณ 1 ปริมาตร / ปริมาตร% [2] การเพาะเลี้ยง เซลล์แบคทีเรีย (35 ° C, 20 ชั่วโมง) [3] เหวี่ยงกลางวัฒนธรรม (8,000 รอบต่อนาที 5 นาที) เพื่อลบส่วนลอยและระงับใน30 มิลลิลิตรพีบีเอส (-); 20 [4] เหวี่ยงระงับการ [3] (8,000 รอบต่อนาที 5 นาที) เพื่อลบส่วนลอยและอีกครั้งในการระงับ5 มิลลิลิตรพีบีเอส (-); [5] นับจำนวนของแบคทีเรียด้วยกล้องจุลทรรศน์; และ[6] จ่ายสารละลายที่มี 20000000000 เซลล์ไปมิลลิลิตร 15 หลอดปั่นเหวี่ยง (8,000 รอบต่อนาที 5 นาที) การแก้ปัญหาที่จะลบ25 ส่วนลอยและหลังจากนั้นระงับใน 5 มิลลิลิตรของอาหารเหลว (ไขมันสูง19 อาหารที่ 60 กิโลแคลอรี% FAT: การวิจัยอาหาร) เพื่อเตรียมความพร้อมการระงับเซลล์ของแบคทีเรีย (ฟีของเหลวถูกจัดทำขึ้นกับพีบีเอส (-)). [0043] หลังจากนั้นทุกอุจจาระส่วนสองวันถูกเก็บไว้ใน 4 ครั้งแบ่งออก (ช่วงบ่ายของวันที่ การทดสอบเริ่มต้นตอนเช้าและ5 ช่วงบ่ายของวันรุ่งขึ้นและตอนเช้าของวันรุ่งขึ้นหลังจากที่วันรุ่งขึ้น) จำนวนแบคทีเรียสำหรับอุจจาระทั้งหมดที่ได้รับการวัดด้วยวิธีต่อไปนี้และอัตราการเพิ่มขึ้นในสายพันธุ์ TUA4337L ในลำไส้ในแต่ละหนู (จำนวนแบคทีเรียสำหรับอุจจาระทั้งหมด / จำนวนให้แบคทีเรีย) ที่คำนวณได้ ผลที่จะได้แสดงใน10 ตารางที่ 4 <วิธีการวัดจำนวนแบคทีเรียตาม PCR แบบ Real-Time> [1] เพิ่ม 1 มิลลิลิตรพีบีเอส (-) 100 mg ของอุจจาระ (น้ำหนักเปียก) และจากนั้นกระทบ อุจจาระด้วยไม้พาย; 15 [2] การจัดเก็บภาษีส่วน 100 มิลลิกรัมอุจจาระไปยัง Eppendorf หลอด (เครื่องหมายการค้าจดทะเบียน) เหวี่ยง (15,000 รอบต่อนาที 5 นาที) อุจจาระเพื่อลบส่วนลอยและระงับการเร่งรัดใน1 มิลลิลิตรพีบีเอส (-) (วิธีการเหวี่ยงที่จะระงับการถูกทำซ้ำครั้งที่สอง) [3] การลบส่วนลอยจากการหยุดชะงักของ [2] และหลังจากนั้น20 การสกัดดีเอ็นเอจากการระงับกับชุด (QIAamp ดีเอ็นเอสตูลมินิชุด: QIAGEN) ( การหยุดชะงักของเซลล์ที่มีการดำเนินการโดยการทำซ้ำขั้นตอนที่สามครั้งของการเพิ่ม300 mg ของลูกปัดแก้ว (150-212 น: SIGMA) 300 [IL ของ phenolichloroform / isoamyl เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ (25: 24: 1) และ 900 ไมโครลิตรของ buffer ASL 25 (น้ำยาอยู่ในชุด) เพื่ออุจจาระ, เหวี่ยงผสมกับ MULTI-20 ลูกปัดขนลุก MB-200 (Yasui Kikai) ที่ 3,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 1 นาทีและอนุญาตให้ยืนอยู่บนน้ำแข็งเป็นเวลา 1 นาที); และ[4] ปริมาณแบคทีเรียกรดแลคติกในเนื้อหาของทางเดินลำไส้ตาม PCR แบบ real-time ภายใต้เงื่อนไขที่แสดง hereinbelow: 5 ((เงื่อนไขการ PCR แบบ Real-Time)) (1) สิบ microliters ของ SYBR พรีมิกซ์ Ex Taq ครั้งที่สอง (Takara Bio) 0.8 RI ของแต่ละไพรเมอร์(10 pin, 0.4! IL อ้างอิง ROX ย้อมครั้งที่สอง 61IL น้ำหมันและ 2 tt, L ของการแก้ปัญหาดีเอ็นเอผสมเพื่อเตรียมความพร้อมผสมปฏิกิริยาเหลวสำหรับ PCR . ในฐานะที่เป็นไพรเมอร์ไพรเมอร์ต่อไปโดยเฉพาะการตรวจสอบ 16S 10 rDNA ของกล้าเชื้อ Lactobacillus pentosus และ Lactobacillus plantarum จะใช้ (คน16S rDNA ลำดับของกล้าเชื้อ Lactobacillus pentosus และ Lactobacillus plantarum เป็น 100% เหมือนกัน). ไพรเมอร์ที่ 1: 5'-GCAAGTCGAACGAACTCTGGTATT-3 '(ID SEQ NO: 2) ​​15 ไพรเมอร์ 2: 5'-CGGACCATGCGGTCCAA-3 (SEQ ID NO: 3) (2) วิธี PCR จะดำเนินการกับ 7500 Real Time PCR ระบบ (Applied Biosystems) ซึ่งประกอบรวมด้วยภายหลังการรักษาที่ 95 ° C เป็นเวลา 30 วินาทีการดำเนินการทั้งหมด 60 รอบของการเกิดปฏิกิริยาที่โดยที่หนึ่งรอบประกอบด้วย 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาทีและ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 34 วินาที จำนวนสำเนาต่อ20 กรัมของเนื้อหาของทางเดินลำไส้จะได้รับจากการเรืองแสงความเข้มได้รวมปริมาณของเนื้อหาของทางเดินลำไส้และเท่าเจือจาง. (3) แยกจำนวนสำเนาของ 16S rDNA ต่อ หนึ่งเซลล์จะได้รับและจำนวนสำเนาจะถูกแปลงเป็นจำนวนแบคทีเรีย ที่นี่ก็เป็นที่25 ได้รับการยืนยันในหนูไม่ได้ให้กับแบคทีเรียกรดแลคติกที่21 ทั้งสองกล้าเชื้อ Lactobacillus pentosus และ plantarum แลคโตบาซิลลัสจะไม่พบตามที่กล่าวข้างต้นแบบ real-time PCR. [0044] [ตารางที่ 4] ตารางที่ 4 จำนวนแบคทีเรียของที่เพิ่มขึ้น อัตราส่วนบุคคลTUA4337L ในสตูลไม่มี. (เซลล์) 1 3.6 x 109 2 1.9 x 109 3 2.6 x 109 4 1.6 x 109 5 1.4 x 109 เฉลี่ย 2.2 x 109 (จำนวนแบคทีเรียต่อสตูลทั้งหมด / จำนวนแบคทีเรียให้) 3.6 1.9 2.6 1.6 1.4 2.2 5 [0045] ตัวอย่างที่ 3 <ผลของการขัดขวางกําไรน้ำหนัก> C57BL / 6J หนู (8 สัปดาห์เก่าชาย) ถูกแบ่งออกเป็นสี่กลุ่มของกลุ่มอาหารธรรมดากลุ่มอาหารไขมันสูง, สูง อาหารที่มีไขมัน + ทำงานกลุ่มแบคทีเรียและอาหารไขมันสูง+ กลุ่มแบคทีเรียที่ตายแล้ว (n = 10) และแต่ละกลุ่มได้รับอย่างต่อเนื่องกับอาหารดังแสดงในตารางที่10 ต่อไปนี้ 5 สำหรับ 32 วันและร่างกาย น้ำหนักวัดในชีวิตประจำวันและค่าเฉลี่ยที่คำนวณได้ การเปลี่ยนแปลงในค่าเฉลี่ยที่มีการแสดงในรูปที่ 2 นี่คือการเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มได้ดำเนินการโดยใช้ t-test ที่มีระดับนัยสำคัญ0.05. [0046] รูปธรรมเช่นการรับประทานอาหารแต่ละกลุ่มของตารางที่ 5 ได้รับด้วยกัน15 อาหารที่เป็นของแข็ง กินอย่างเต็มที่ อาหารที่มีไขมันสูง + กลุ่มแบคทีเรียทำงานได้ก็ให้มีตัวอย่างการให้จัดทำในลักษณะเช่นเดียวกับในตัวอย่างที่2 อาหารที่มีไขมันสูง + กลุ่มแบคทีเรียที่ตายแล้วให้เป็นที่มีการให้ตัวอย่างดังต่อไปนี้จัดทำขึ้นเพื่อให้กรดแลคติกแบคทีเรียจะต้องมีอยู่ในปริมาณประมาณ 1,000,000,000 เซลล์ต่อวัน ในทางกลับกันกลุ่มอาหารที่เป็นสามัญให้กับ 250 PL ของพีบีเอส (-) ไม่ได้มีเชื้อแบคทีเรียกรดแลคติกและไขมันสูงในกลุ่มอาหารที่5 ให้เป็น 250 PL ของอาหารเหลวไม่ได้มีแบคทีเรียกรดแลคติก[0047] [ตารางที่ 5] ตารางที่ 5 อาหารกลุ่มสามัญอาหารกลุ่มที่มีไขมันสูงอาหารกลุ่มอาหารไขมันสูง+ กลุ่มแบคทีเรียทำงานได้อาหารไขมันสูง + แบคทีเรียตายกลุ่ม* 10 กิโลแคลอรี% FAT (การวิจัยอาหาร) 60 กิโลแคลอรี% FAT (การวิจัย อาหาร) แบคทีเรียกรดแลกติกแข็งอาหารให้10 กิโลแคลอรี% FAT - 60 กิโลแคลอรี% FAT - TUA4337L 60 กิโลแคลอรี% FAT แบคทีเรียทำงานได้TUA4337L 60 กิโลแคลอรี% FAT แบคทีเรียตาย10 [0048] <การเตรียมการให้ตัวอย่าง (ตายแบคทีเรียที่มีตัวอย่าง)> [1] การปลูกเชื้อสายพันธุ์ TUA4337L ในปริมาณ 1 ปริมาตร / ปริมาตร% จากหุ้นกลีเซอรอลที่จะเป็นสื่อMRS (30 มิลลิลิตร); [2] การเพาะเลี้ยงเซลล์แบคทีเรีย (35 ° C เป็นเวลา 20 ชั่วโมง); 15 [3 ] เหวี่ยงกลางวัฒนธรรม (8,000 รอบต่อนาที 5 นาที) เพื่อเอาส่วนลอยและหลังจากนั้นระงับใน30 มิลลิลิตรพีบีเอส (-); 23 [4] เหวี่ยงระงับการ [3] (8,000 รอบต่อนาที 5 นาที) เพื่อเอาส่วน ลอยและ re-ระงับหลังจากนั้นใน 5 มิลลิลิตรพีบีเอส (-); [5] นับจำนวนของแบคทีเรียด้วยกล้องจุลทรรศน์; [6] จ่ายสารละลายที่มี 20000000000 เซลล์ 15 มิลลิลิตร5 หลอดปั่นเหวี่ยงการแก้ปัญหา (8,000 รอบต่อนาที 5 นาที) เพื่อเอาส่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวอย่าง 0037
[ ] การประดิษฐ์นี้จะอธิบายโดยเฉพาะ hereinbelow
10 ตัวอย่าง โดยไม่มีเจตนาที่จะ จำกัด ขอบเขตของการประดิษฐ์นี้
ในตัวอย่างต่อไปนี้ .
[ 0038 ] ตัวอย่าง 1 < การใช้ความสามารถการเพิ่มจำนวน ) โซลูชั่นดัชนี >

ในลําไส้ของแบคทีเรียกรดแลคติกที่เป็นเจ้าของโดยนักประดิษฐ์ปัจจุบัน
15 ความสามารถการเพิ่มจำนวนในสารละลายลำไส้เทียมได้ทำการ
ประมาณ 480 ซึ่งส่วนใหญ่เป็นพืชสายพันธุ์แบคทีเรียที่ผลิตกรดแลกติก ( รวมทั้ง jcm สายพันธุ์ )
[ ขอบคุณ ] อย่างเป็นรูปธรรมครั้งแรก แต่ละของแบคทีเรียกรดแลคติก คือ ถูกปลูกเชื้อจาก
เป็นหุ้นเป็นกลีเซอรอลอาหารเลี้ยงเชื้อ MRS medium ( difco ห้องปฏิบัติการ ) ( 10 มล. ) ใน 20 ปริมาณ
1 v / v % แต่ละ , และเซลล์เพาะเลี้ยงแบคทีเรียที่ 35 ° C
16 ถึง 17 ชั่วโมง ต่อไป 0d660 ของแต่ละวัฒนธรรมปานกลาง ( ค่าการดูดกลืนแสงที่
660 nrn ) เป็นวัดที่มีความ uv-1600 ( Shimadzu Corporation )และ 100 µผมเตรียมสารละลายด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ MRS medium เพื่อให้ 0d660 ของแต่ละสื่อวัฒนธรรมจะเป็น 10 เป็นถูกปลูกเชื้อกับ
25 สารละลายลำไส้เทียม ( 10 ) ขององค์ประกอบที่แสดง hereinbelow

หลังจากนั้นเซลล์แบคทีเรียที่เพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศา C เป็นเวลา 6 ชั่วโมง ในขณะที่
ค่อยๆสั่นod660 วัดและจากนั้นได้รับการพับ ( 0d660 หลังจาก 6 ชั่วโมง / od660 ที่ได้รับ ) ตัวแทนคัดกรองผลลัพธ์จะแสดงในตารางที่ 3 และรูป 1 .

< สารละลายลำไส้เทียม ( pH 6.45 ) >
นางกลาง 9 ml
10 w / v % กรดน้ำดี ( Wako เพียว เคมี 1 ml
อุตสาหกรรม จำกัด ) โซลูชั่น
1 w / v % Pancreatin ( จากสุกร : Sigma ) 100 P , l
ที่นี่เลยน้ำดีสารละลายกรดและสารละลาย Pancreatin ซึ่งทำให้ปลอดเชื้อโดยการรักษาโซลูชั่นกับ 0.22 กรัม ( กรองเมมเบรน PVDF ผลิตโดยมิลลิ ) มาใช้ ตารางที่ 3
[ ]



สกุลสปีชีส์









Lactobacillus plantarum Lactobacillus pentosus



















Lactobacillus casei แล็กโตบาซิลลัสเบรวิส




แล็กโตบาซิลลัส fertnenturn



tua4337l








เมื่อย( การประดิษฐ์นี้ )
jcm1558
1
2
3
4
5
6
7
8
9


10 11 12 13 14 15






jcm1149 16 17 18 19 20 jcm1059






21 22 23 24 25 26



jcm1134 27 28 29 30






jcm1173 31 32 33 34
3







ตารางการพับ ( ครั้ง )
0d660 หลังจาก 6 ชั่วโมง ( 0d660 หลังจาก 6 ชั่วโมง /
-
( 01 ) ที่เป็นผล จะเห็นได้ว่า การพับมีแนวโน้ม
จะสูงใน Lactobacillus pentosus และ Lactobacillus plantarum Lactobacillus pentosus ในหมู่ที่ tua4337l สายพันธุ์มีพับงอกสูงโดยเฉพาะและที่ยอดเยี่ยมความสามารถการเพิ่มจำนวนในทางเดินลำไส้ .
5 [ 0042 ] ตัวอย่าง 2 < การประเมินโดยความสามารถการเพิ่มจำนวน intestinal ทางเดิน >

หนูต้องไขมันสูงอย่างเต็มที่ได้ให้กับสายพันธุ์ tua4337l เตรียมดังนี้ และจำนวนแบคทีเรียขับออกมาก็วัดได้ อย่างเป็นรูปธรรม c57bl / 6j , หนู ( 10 สัปดาห์เก่า ชาย )
10 ให้ในปริมาณเดียวกับประมาณ 1.0 x 109 เซลล์แบคทีเรียกรดแลคติก
( ตรงกับµ 250 ลิตรเซลล์แขวนลอยเชื้อแบคทีเรีย ) 10 โมงเช้า ( n = 5 )การใช้การให้ตัวอย่างที่เตรียมไว้ ดังนี้ < เตรียมตัวอย่างการให้ ( แบคทีเรียได้บรรจุตัวอย่าง ) >
15 [ 1 ] การปลูกเชื้อสายพันธุ์ tua4337l จากกลีเซอรอลหุ้นเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อ MRS medium
( 30 ml ) ในปริมาณ 1 % v / v ;
[ 2 ] การเพาะเลี้ยงเซลล์แบคทีเรีย ( 35 ° C 20 ชั่วโมง ) ;
[ 3 ] สารอาหารเพาะเชื้อ ( 8000 รอบต่อนาที 5 นาที ) เพื่อลบส่วนลอย
,พักงานใน 30 ml ของ PBS ( - ) ;
2 [ 4 ] สารระงับ [ 3 ] ( 8000 รอบต่อนาที 5 นาที ) เอา
ส่วนลอย และจะระงับใน 5 มิลลิลิตร PBS ( - ) ;
[ 5 ] การนับจำนวนแบคทีเรียด้วยกล้องจุลทรรศน์ และ
[ 6 ] 4 โซลูชั่นที่ประกอบด้วยเซลล์ 20000000000 15 ml
3 หลอด วรรณนา ( 8000 รอบต่อนาที 5 นาที ) วิธีการลบ
ส่วนลอย 25 ,และหลังจากนั้นระงับใน 5 มิลลิลิตรของอาหารเหลว ไขมันสูง





19 อาหาร 60 กิโลแคลอรีไขมันร้อยละ : วิจัยอาหาร ) ที่เตรียมจากเซลล์แขวนลอย ( อาหารน้ำพร้อมกับ PBS ( - ) ) .
[ 0043 ] หลังจากนั้นทั้งหมดส่วนการเก็บอุจจาระสอง 4
แบ่ง ครั้ง ( ช่วงบ่ายของวันเริ่มสอบ ตอนเช้า และบ่าย
5 วันดังต่อไปนี้และเช้าของวันหลังจากที่
ต่อไปนี้วัน ) จำนวนแบคทีเรียในอุจจาระทั้งหมดถูกวัดโดยวิธีต่อไปนี้ และอัตราการเพิ่มขึ้นของสายพันธุ์ tua4337l ในลำไส้ในแต่ละของหนู ( จำนวนแบคทีเรียในอุจจาระทั้งหมด /
จำนวนให้แบคทีเรีย ) คือการคำนวณ ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงใน 10 โต๊ะ

4< วิธีการวัดจำนวนของแบคทีเรียตามเวลาจริง ) >
[ 1 ] เพิ่ม 1 มิลลิลิตรของ PBS ( - ) 100 mg ของอุจจาระ ( น้ำหนักเปียก ) แล้วรบกวนตั่งด้วยไม้พาย ;
15 [ 2 ] รวบรวม 100 มก. ส่วนของอุจจาระเป็นหลอดเพนดอร์ฟ
( เครื่องหมายการค้าจดทะเบียน ) สาร ( 15 , 000 รอบต่อนาที 5 นาที )

เอาส่วนลอยอุจจาระ ,การพักงานการตกตะกอนใน 1 มิลลิลิตรของ PBS ( - )
( ขั้นตอนของสารที่จะระงับการทำซ้ำสองครั้ง ) ;
[ 3 ] เอาส่วนลอยจากการระงับ [ 2 ] และหลังจากนั้น
20 การสกัดดีเอ็นเอจากช่วงล่างกับชุด ( qiaamp ดีเอ็นเออุจจาระขนาดเล็กเพิ่ม

( ชุด ) เซลล์หยุดชะงักถูกดำเนินการโดยการทำซ้ำขั้นตอนที่ 3
ครั้งของการเพิ่ม 300 มิลลิกรัมของลูกปัดแก้ว ( 150 ถึง 212 PM : Sigma ) , 300 [ IL ของ phenolichloroform / แอลกอฮอล์ในปริมาณ ( 25:24:1 ) และ 900 µ L ของบัฟเฟอร์ ASL
25 ( สารเคมีในชุด ) กับอุจจาระ , สารผสมกับหลาย --




20

ลูกปัด เกอร์ mb-200 ( ยาสึอิ kikai ) ที่ 3 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 1 นาที และให้ยืนบนน้ำแข็ง 1 นาที )
; และ[ 4 ] ปริมาณแบคทีเรียกรดแลคติกในเนื้อหาของทางเดินลำไส้ตาม PCR แบบเรียลไทม์ ภายใต้เงื่อนไขที่แสดง hereinbelow :
5 ( ( เงื่อนไขสำหรับเวลาจริง ) ) )
( 1 ) 10 ตัวเลขของ SYBR รวมอดีตได้ดี II ( ทาคาระไบโอ ) , 0.8 ริ ของแต่ละคน ( 10
รองพื้นขา 0.4 ! อิลของ Rox อ้างอิงสี 2 61il น้ำหมันและ 2 เป็นต้น ผมของสารละลายดีเอ็นเอจะผสมเตรียมน้ำผสมปฏิกิริยา PCR เป็นไพรเมอร์ , รองพื้นโดยเฉพาะการต่อไปนี้ของ Lactobacillus pentosus (
10 ชนิดและใช้ ( Lactobacillus plantarum Lactobacillus pentosus
16S rDNA และลำดับของ Lactobacillus plantarum ถูก 100% เหมือนกัน

รองพื้น ) 1 : 5 ' - gcaagtcgaacgaactctggtatt-3 '
( seq id : 2 )
2 : 5 - 15 ไพรเมอร์ cggaccatgcggtccaa-3 ' ( seq id :
3 )( 2 ) PCR จะดำเนินการกับ 7 , 500 ระบบ Real Time PCR ( ประยุกต์
Biosystems ) ซึ่งประกอบรวมด้วยต่อมาเพื่อการรักษาที่ 95 องศา C นาน 30 วินาที มีทั้งหมด 60 รอบของปฏิกิริยา โดยที่หนึ่งรอบประกอบด้วย 95 องศา C เป็นเวลา 5 วินาที และ 60 ° C 34 วินาที คัดลอกหมายเลขต่อหนึ่ง
20 กรัม เนื้อหาของทางเดินลำไส้ได้รับจาก
เรืองแสง