2.4. Molecular identificationAll te

2.4. Molecular identification
All tested isolates were grown on PDA at 25 C. DNA extraction was performed following the CTAB protocol (Day and Shattock,1997). Polymerase chain reaction (PCR) assays were carried out with the universal primer pair ITS1/ITS4 (White et al., 1990). PCR reaction mix contained 20 ng DNA template, 1  PCR Master Mix (Fermentas, Vilnius, Lithuania) and 0.4 mM of each primer. Thirty five PCR cycles were performed for amplification (White et al., 1990). PCR products were separated in 1% agarose gel and amplified products were purified using mi-PCR Purification Kit (Metabion international AG, Germany) and sequenced in both directions using forward ITS1 and reverse ITS4 primers. Sequences were
assembled using Pregap4 from the Staden program package (Staden et al., 2000) and deposited in the NCBI GenBank under accession numbers given in Fig. 1. The obtained sequences were aligned with sequences of Trichoderma spp. isolates, already identified as reference (Kosanovi
c et al., 2013) by Clustal X (Thompson et al., 1997) in MEGA version 6 (Tamura et al., 2013). A phylogenetic tree was constructed by MEGA version 6, and analysed by the Maximum Parsimony method based on a close-neighbourinterchange algorithm (Nei and Kumar, 2000). Initial phylogenetic trees were obtained by searching level 5, through random addition of sequences (10 replicates). One of the eight most frugal trees is shown in Fig. 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 รหัสโมเลกุลแยกทดสอบทั้งหมดได้ปลูกบน PDA ที่ดีเอ็นเอ 25 ซี สกัดทำตามโพรโทคอล CTAB (วันและ Shattock, 1997) พอลิเมอเรส assays ปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) ได้ดำเนินการออกกับคู่พื้นสากล ITS1/ITS4 (สีขาวและ al., 1990) ส่วนผสมของปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 20 ng ดีเอ็นเอต้นแบบ 1 PCR หลัก (Fermentas วิลเนียส ลิทัวเนีย) และ 0.4 mM พื้นแต่ละ สามสิบห้า PCR วงจรได้ทำการขยาย (สีขาวและ al., 1990) มีแบ่งผลิตภัณฑ์ PCR ในเจ 1% agarose และผลิตภัณฑ์เอาต์ได้บริสุทธิ์โดยใช้ mi PCR ชุดฟอก (AG ประเทศ Metabion เยอรมนี) และเรียงลำดับใน ทั้งเส้นทางที่ใช้ส่ง ITS1 และกลับ ITS4 ไพรเมอร์ ลำดับรวบรวมโดยใช้ Pregap4 จากแพคเกจโปรแกรม Staden (Staden และ al., 2000) และฝากใน GenBank NCBI ภายใต้หมายเลขทะเบียนที่กำหนดให้ใน Fig. 1 ลำดับที่ได้รับไม่สอดคล้องกับลำดับของ Trichoderma โอล แล้วระบุเป็นการอ้างอิง (Kosanovi c et al., 2013) X Clustal (ทอมป์สันและ al., 1997) ในเมการุ่น 6 (Tamura et al., 2013) ต้นไม้ phylogenetic ถูกสร้าง โดยร็อครุ่น 6 และ analysed โดยวิธี Parsimony สูงสุดตามอัลกอริทึมการปิด neighbourinterchange (Nei และ Kumar, 2000) ต้นไม้ phylogenetic เริ่มต้นได้รับ โดยการค้นหาระดับ 5 ผ่านนี้สุ่มลำดับ (เหมือนกับ 10) ต้นไม้ประหยัดสุดแปดหนึ่งจะปรากฏใน Fig. 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 บัตรประจำตัวโมเลกุลสายพันธุ์ที่ผ่านการทดสอบทั้งหมดที่ปลูกบน PDA ที่ 25 องศาเซลเซียส
การสกัดดีเอ็นเอได้ดำเนินการดังต่อไปนี้โปรโตคอล CTAB (วันและ Shattock, 1997) ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (PCR) ตรวจได้ดำเนินการกับไพรเมอร์สากลคู่ ITS1 / ITS4 (สีขาว et al., 1990) ผสมปฏิกิริยา PCR ที่มีดีเอ็นเอแม่แบบ 20 นาโนกรัม 1? PCR โทผสม (Fermentas วิลนีอุลิทัวเนีย) และ 0.4 มิลลิของแต่ละไพรเมอร์ สามสิบห้ารอบ PCR ได้ดำเนินการสำหรับการขยาย (สีขาว et al., 1990) ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแยกออกใน 1% agarose เจลและผลิตภัณฑ์ขยายบริสุทธิ์โดยใช้ไมล์-PCR บริสุทธิ์ Kit (Metabion นานาชาติเอจี, เยอรมนี) และติดใจในทั้งสองทิศทางใช้ไปข้างหน้าและย้อนกลับ ITS1 ITS4 ไพรเมอร์ ลำดับที่ถูกประกอบโดยใช้ Pregap4 จากแพคเกจโปรแกรม Staden (Staden et al., 2000) และฝากไว้ใน NCBI GenBank ภายใต้หมายเลขภาคยานุวัติได้รับในรูป
1. ลำดับที่ได้มาสอดคล้องกับลำดับของเชื้อรา Trichoderma spp แยกระบุแล้วเป็นข้อมูลอ้างอิง (Kosanovi? ค et al., 2013) โดย Clustal X (ธ อมป์สัน et al., 1997) ในรุ่น MEGA 6 (ทามูระ et al., 2013) ต้นไม้สายวิวัฒนาการที่ถูกสร้างขึ้นโดยรุ่น MEGA 6 และวิเคราะห์โดยวิธีการประหยัดสูงสุดขึ้นอยู่กับขั้นตอนวิธีการใกล้ neighbourinterchange (Nei และมาร์, 2000) ต้นไม้เริ่มต้นที่ได้รับโดยการค้นหาระดับ 5 ผ่านการเพิ่มการสุ่มลำดับ (10 ซ้ำ) หนึ่งในแปดต้นไม้ประหยัดที่สุดคือการแสดงในรูป 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การแยกโมเลกุล
ทดสอบทั้งหมดที่ปลูกบน PDA ที่ 25  C . การสกัดดีเอ็นเอแสดงต่อไปนี้ ctab โพรโทคอล ( วันและ shattock , 1997 ) ปฏิกิริยาลูกโซ่ ( PCR ) วิธีทดลองกับสากล ไพรเมอร์คู่ its1 / its4 ( สีขาว et al . , 1990 ) ผสมปฏิกิริยา PCR ที่มีอยู่ 20 นาโนดีเอ็นเอแม่แบบ 1  PCR Master Mix ( fermentas , Vilnius ลิทัวเนีย ) และ 04 มม. ของแต่ละรองพื้น สามสิบห้า ) รอบแสดงสำหรับเด็ก ( สีขาว et al . , 1990 ) ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกแบ่งออกเป็นผลิตภัณฑ์เจล ( 1 ) และขยายเป็นบริสุทธิ์ใช้ชุดผลิต PCR มิ ( metabion International AG , Germany ) และลำดับเบสในทั้งสองทิศทาง ไปข้างหน้าและย้อนกลับ its4 its1 ใช้รองพื้น ลำดับถูก
ประกอบใช้ pregap4 จากแพคเกจโปรแกรม staden ( staden et al . , 2000 ) และฝากใน ncbi ภายใต้การครอบครองตัวเลขระบุขนาดในรูปที่ 1 โดยลำดับ ชิดกับลำดับของไอโซเลท เลท แล้วระบุว่าเป็นอ้างอิง ( kosanovi
C et al . , 2013 ) โดย clustal X ( Thompson et al . , 1997 ) ในรุ่นเมกะ 6 ( ทามูระ et al . , 2013 )phylogenetic ต้นไม้ถูกสร้างขึ้นโดยรุ่นเด่น 6 และวิเคราะห์โดยวิธีตามความตระหนี่สูงสุดขั้นตอนวิธี neighbourinterchange ปิด ( เนย และ คูมาร์ , 2000 ) ต้นไม้ ซึ่งเบื้องต้นได้ด้วยการค้นหาระดับ 5 ผ่านนอกจากสุ่มของลำดับ ( 10 นาที ) หนึ่งในแปดที่ประหยัดที่สุด ต้นไม้จะแสดงในรูปที่ 1