Selection of and immune response to

Selection of and immune response to recombinant MHVA59
expressing the LCMV CD8
epitope gp33.


We have selected
a recombinant MHV-A59 (RA59) expressing a foreign
CD8
T-cell epitope, gp33, derived from the glycoprotein (or
G protein) of LCMV. The gp33 epitope is expressed as a
fusion protein, sandwiched between a 9-amino-acid fragment
of the MHV ORF4a protein (37) and the EGFP (4). A schematic
diagram of the genome of this virus (RA59-gfp/gp33) as
well as a previously described recombinant MHV-A59 expressing
the EGFP protein alone (RA59-gfp), is shown in Fig. 1. In
both genomes the nonessential gene 4 is replaced by the foreign
sequences. Selection of RA59-gfp was described previously
(5). RA59-gfp/gp33 was selected using techniques similar
to those used in the selection of RA59-gfp and is described in
the Materials and Methods. Briefly, recombination occurred
between fMHV and an RNA encoding, in place of gene 4, a
recombinant protein containing 9 amino acids from ORF4a
and 9 amino acids of gp33 fused in frame with the EGFP gene.
Such recombinants were selected and plaque purified on murine
L2 cells all as previously described (26) and were characterized
further.
Cells infected with these viruses were notably less fluorescent
than RA59-gfp, suggesting that the N-terminal addition to
the EGFP protein may interfere with its function. Alternatively
there may be less transcription or translation due to differences
near the intergenic sequences (5, 20). RA59-gfp/gp33 (log10
50% lethal dose [LD50]  5.6) displayed a similar level of
virulence to RA59-gfp (log10 LD50  5.5). As previously published
(5), RA59-gfp is somewhat attenuated relative to wildtype
recombinant RA59 (log10 LD50  4); thus, both EGFPexpressing
viruses display LD50 values approximately 10-fold
higher than those displayed by wild-type RA59.
We quantified the epitope-specific CD8
T-cell response to
RA59-gfp/gp33 in the spleen and in the CNS after both i.c. and
i.p. inoculation. Thus, 4-week-old B6 mice were inoculated
either i.c. or i.p. and animals were sacrificed at day 7 postinfection
(after i.c. inoculation) and on day 8 postinfection (after
i.p. inoculation), the peak of inflammation for each route.
Splenocytes were isolated from both sets of mice; CNS mononuclear
cells were isolated from only those mice inoculated by
the i.c. route. An intracellular IFN- assay was used to quantify
the percentage of CD8
T cells specific for the MHV spike
protein CD8
T-cell epitope S598 and for gp33 (19, 25). As
shown in Fig. 2, S598 and gp33 epitope-specific CD8
T cells
are detected in both the spleen and the CNS. Response in the
spleen is similar whether inoculation is carried out either i.c. or
i.p.; following i.c. infection, the levels of CD8
T cells specific
for both epitopes are higher in the CNS, the site of viral
replication, than in the spleen, as observed previously (3, 17).
Epitope-specific CD8
T cells confer protection against infection
with RA59-gfp/gp33. We wanted to determine the ability
of the CD8
T-cell response against a single epitope to
protect mice from MHV replication and disease. The strategy
was to carry out immunization with an rLm expressing gp33
(rLm-gp33) followed by challenge with RA59-gfp/gp33.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การคัดเลือกและการตอบสนองภูมิคุ้มกัน MHVA59 recombinant
แสดง LCMV CD8? gp33 epitope. เราได้เลือกตัดต่อพันธุกรรม MHV-A59 (RA59) แสดงต่างประเทศ CD8? epitope T-cell, gp33 มาจากไกลโคโปรตีน (หรือG โปรตีน) ของ LCMV gp33 epitope ที่จะแสดงเป็นโปรตีนฟิวชั่น, แซนวิชส่วน 9 กรดอะมิโนโปรตีนMHV ORF4a (37) และ EGFP (4) วงจรแผนภาพของจีโนมของไวรัสนี้ (RA59-GFP / gp33) เช่นเดียวกับก่อนหน้านี้ที่อธิบายrecombinant MHV-A59 แสดงโปรตีน EGFP เพียงอย่างเดียว (RA59-GFP) แสดงในรูป 1. ในทั้งจีโนมของยีนที่ไม่จำเป็น4 จะถูกแทนที่ด้วยต่างประเทศลำดับ การเลือก RA59-GFP ถูกอธิบายไว้ก่อนหน้า(5) RA59-GFP / gp33 ได้รับเลือกโดยใช้เทคนิคที่คล้ายกับที่ใช้ในการเลือกRA59-GFP และอธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการ สั้น ๆ , รวมตัวกันอีกที่เกิดขึ้นระหว่างfMHV และการเข้ารหัส RNA ในสถานที่ของยีนที่ 4 โปรตีนที่มี 9 กรดอะมิโนจาก ORF4a และ 9 กรดอะมิโนของ gp33 หลอมรวมอยู่ในกรอบที่มียีน EGFP. โคดังกล่าวได้รับการคัดเลือกและมอบโล่ประกาศเกียรติคุณให้บริสุทธิ์ในหมาL2 เซลล์ทั้งหมดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (26) และมีลักษณะต่อไป. เซลล์ติดเชื้อไวรัสเหล่านี้เป็นเรืองแสงโดดเด่นน้อยกว่า RA59-GFP บอกว่านอกจากนี้ N-terminal เพื่อโปรตีนEGFP อาจรบกวนการทำงานของ อีกทางเลือกหนึ่งอาจจะมีน้อยลงหรือถอดความแปลเนื่องจากความแตกต่างที่อยู่ใกล้ลำดับintergenic (5, 20) RA59-GFP / gp33 (log10 50% ยาตาย [LD50] 5.6) ที่แสดงระดับเดียวกันของความรุนแรงที่จะRA59-GFP (LD50 log10? 5.5) ในฐานะที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้(5), RA59-GFP เป็นญาติจางค่อนข้าง wildtype RA59 recombinant (LD50 log10 4); ดังนั้นทั้งสอง EGFPexpressing ไวรัสแสดงค่า LD50 ประมาณ 10 เท่าสูงกว่าแสดงเหล่านั้นโดยRA59 ป่าชนิด. เราวัด epitope เฉพาะ CD8 หรือไม่ การตอบสนองของ T-cell เพื่อRA59-GFP / gp33 ในม้ามและระบบประสาทส่วนกลางหลังจากที่ทั้งไอซีและทรัพย์สินทางปัญญา การฉีดวัคซีน ดังนั้น 4 สัปดาห์เก่าหนู B6 ถูกเชื้อทั้งไอซีหรือIP และสัตว์ที่ถูกเสียสละในวันที่ 7 postinfection (หลังจากการฉีดวัคซีนไอซี) และในวันที่ 8 postinfection (หลังจากการฉีดวัคซีนไอพี) ซึ่งเป็นจุดสูงสุดของการอักเสบสำหรับแต่ละเส้นทาง. Splenocytes ถูกแยก จากทั้งสองชุดของหนู; CNS โมโนนิวเคลียร์เซลล์ที่แยกได้จากผู้ที่เพียงหนูเชื้อโดยเส้นทางที่ไอซี IFN- เซลล์? ทดสอบได้ถูกใช้ในปริมาณร้อยละของ CD8 หรือไม่ ทีเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับเข็ม MHV โปรตีน CD8? epitope T-cell S598 และ gp33 (19, 25) ในฐานะที่แสดงในรูป 2, S598 และ gp33 epitope เฉพาะ CD8? ทีเซลล์มีการตรวจพบทั้งในม้ามและระบบประสาทส่วนกลาง การตอบสนองในม้ามที่คล้ายกันไม่ว่าจะเป็นการฉีดวัคซีนจะดำเนินการอย่างใดอย่างหนึ่งหรือไอซีไอพี; ต่อไปนี้การติดเชื้อไอซีระดับของ CD8 หรือไม่ ทีเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ epitopes ทั้งสองสูงขึ้นในระบบประสาทส่วนกลางเว็บไซต์ของไวรัสจำลองกว่าในม้ามเป็นที่สังเกตก่อนหน้านี้(3, 17). Epitope เฉพาะ CD8? ทีเซลล์หารือการป้องกันการติดเชื้อที่มี RA59-GFP / gp33 เราต้องการที่จะตรวจสอบความสามารถของ CD8? การตอบสนองของ T-cell epitope กับเดียวที่จะปกป้องหนูจากการจำลองแบบMHV และโรค กลยุทธ์ที่จะดำเนินการสร้างภูมิคุ้มกันที่มีอาร์แอลแสดง gp33 (อาร์แอล-gp33) ตามด้วยความท้าทายกับ RA59-GFP / gp33