Personal Genome Machine platform (L

Personal Genome Machine platform (Life Technologies) at the DNA
sequencing facility of GenProbio srl (www.genprobio.com) according to
the protocol previously reported (Milani et al., 2013a, 2013b). Following
sequencing, the obtained individual sequence reads were filtered by
the PGM software to remove low quality and polyclonal sequences.
Sequences matching the PGM 3′ adaptor were also automatically
trimmed. All PGM quality-approved, trimmed and filtered data were
exported as sff files. The sff files were processed using QIIME
(Caporaso et al., 2010).Quality control retained sequenceswith a length
between 140 and 400 bp,withmean sequence quality score of N15, and
with truncation of a sequence at the first base if a low quality rolling 10
bp windowwas found. The presence of homopolymers of N7bp, and sequences
with mismatched primers were omitted. In order to calculate
downstream diversity measures (alpha and beta diversity indices,
Unifrac analysis), 16S rRNA Operational Taxonomic Units (OTUs) were
defined at ≥97% sequence homology. All reads were classified to the
lowest possible taxonomic rank using QIIME and a reference dataset
from the Ribosomal Database Project (Cole et al., 2009). OTUs were
assigned using uclust (Edgar, 2010). Furthermore, MEGAN analyses
allowed the classification of reads down to species level (Huson et al.,
2011). Similarities between samples were calculated by Weighted
uniFrac (Lozupone and Knight, 2005). The range of similarities is calculated
between the values 0 and 1.
2.6. RNA isolation
Total RNA was isolated using a previously described method
(Turroni et al., 2011a, 2011b, 2011c). Briefly, cell pellets/tissuematerials
were resuspended in 1 ml of QUIAZOL (Qiagen, UK) and placed in a
tube containing 0.8 g of glass beads (diameter, 106 μm; Sigma). The
cells were lysed by shaking the mix on a BioSpec homogenizer at 4 °C
for 2 min (maximum setting). The mixture was then centrifuged
at 12,000 rpm for 15 min, and the upper phase containing the
RNA-containing sample was recovered. The RNA sample was further
purified by phenol extraction and ethanol precipitation according to
an established method (Sambrook, in press). The quality of the RNA
was checked by analyzing the integrity of rRNA molecules by Experion
(BioRad) analysis.
2.7. Microarray, description, labeling and hybridizations
Microarray analysis was performed with an oligonucleotide array
based on the B. bifidum PRL2010 genome: a total of 45,220 oligonucleotide
probes of 60 bp in length were designed on 1707 ORFs
using eArray5.0 (Agilent Technologies). 5 Oligos were designed for
each gene on a 4 × 44 K Agilent Microarray chip (Agilent Technologies,
Santa Clara, CA, USA). Replicates were distributed on the chip at
random, non-adjacent positions. A set of 152 negative control probes
designed on phage and plant sequences were also included on the
chip. Reverse transcription and amplification of 500 ng of total RNA
was performed with ImProm-II™ Reverse Transcriptase (

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ส่วนบุคคลเครื่องกลุ่มแพลตฟอร์ม (ชีวิตเทคโนโลยี) ในดีเอ็นเอมีความ GenProbio srl (www.genprobio.com) ตามลำดับโพรโทคอลก่อนหน้านี้รายงาน (มิลานิ et al., 2013a, 2013b) ต่อไปนี้ลำดับเบส อ่านแต่ละลำดับได้รับถูกกรองโดยซอฟต์แวร์ PGM เอาลำดับ polyclonal และคุณภาพต่ำลำดับตรงกับอะแดปเตอร์ 3′ PGM แนะนำโดยอัตโนมัติตัด PGM ทั้งหมดคุณภาพอนุมัติ ถูกตัดออก และกรองข้อมูลได้ส่งออกเป็นแฟ้ม sff แฟ้ม sff ถูกประมวลผลโดยใช้ QIIME(Caporaso et al., 2010)ควบคุมคุณภาพสะสม sequenceswith ความยาวระหว่าง 140 และการ 400 bp คะแนนคุณภาพลำดับ withmean N15 และมีการตัดคำของลำดับที่ฐานแรกถ้าคุณภาพต่ำที่กลิ้ง 10พบ windowwas bp ของ homopolymers N7bp และลำดับด้วยไพรเมอร์ที่ไม่ตรงกันถูกข้ามไป เพื่อคำนวณมาตรการหลากหลายปลายน้ำ (อัลฟาและเบต้าหลากหลายดัชนีUnifrac วิเคราะห์), 16S rRNA อนุกรมวิธานหน่วยงาน (OTUs) ได้กำหนดที่ ≥97% ลำดับ homology อ่านทั้งหมดถูกจัดประเภทเพื่อการต่ำสุดอนุกรมวิธานอันดับโดยใช้ QIIME และการชุดข้อมูลอ้างอิงจากโครงการฐานข้อมูล Ribosomal (โคล et al., 2009) OTUs ได้กำหนดให้ใช้ uclust (Edgar, 2010) นอกจากนี้ เมแกนวิเคราะห์ได้จัดประเภทของการอ่านจนถึงระดับชนิด (Huson et al.,2011) มีคำนวณความคล้ายคลึงระหว่างตัวอย่าง โดย WeighteduniFrac (Lozupone และอัศวิน 2005) คำนวณช่วงของความเหมือนระหว่างค่า 0 และ 12.6 แยกอาร์เอ็นเออาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกโดยใช้วิธีการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้(Turroni et al., 2011a, 2011b ซี 2011) สั้น ๆ เซลล์ ขี้/tissuematerialsresuspended ใน 1 ml ของ QUIAZOL (Qiagen, UK) และวางไว้ในหลอดที่ประกอบด้วย g 0.8 ของลูกปัดแก้ว (เส้นผ่าศูนย์กลาง 106 μm ซิก) ที่เซลล์ถูก lysed โดยเขย่าผสมบน homogenizer BioSpec ที่ 4 ° Cใน 2 นาที (ค่าสูงสุด) ส่วนผสมถูก centrifuged แล้วที่ 12000 รอบต่อนาที 15 นาที และประกอบด้วยขั้นตอนด้านบนตัวอย่างที่ประกอบด้วยอาร์เอ็นเอถูกกู้คืน ตัวอย่างของอาร์เอ็นเอเพิ่มเติมบริสุทธิ์ โดยวางสกัดและเอทานอลฝนตามวิธีสร้างการ (Sambrook ในข่าว) คุณภาพของอาร์เอ็นเอมีการตรวจสอบ โดยการวิเคราะห์ความสมบูรณ์ของโมเลกุล rRNA โดย Experionวิเคราะห์ (BioRad)2.7. Microarray คำอธิบาย ติดฉลาก และ hybridizationsทำการวิเคราะห์ Microarray ด้วย oligonucleotideตามจีโนม bifidum เกิด PRL2010: จำนวน 45,220 oligonucleotideคลิปปากตะเข้ 60 bp ความยาวถูกออกแบบบน 1707 ORFsใช้ eArray5.0 (Agilent เทคโนโลยี) 5 Oligos ถูกออกแบบสำหรับแต่ละยีนบนชิปที่ K Agilent Microarray 4 × 44 (Agilent เทคโนโลยีซานตาคลารา CA, USA) เหมือนกับแจกจ่ายบนชิพที่ตำแหน่งสุ่ม ไม่ติดกัน ชุดของคลิปปากตะเข้ควบคุมลบ 152ออกแบบบน phage และโรงงาน ลำดับยังอยู่ชิ กลับ transcription และขยาย 500 ng ของอาร์เอ็นเอทั้งหมดทำ ด้วย(ImProm II ™กลับ Transcriptase

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เครื่องจีโนมส่วนบุคคลแพลตฟอร์ม (ไลฟ์เทคโนโลยีส์) ที่ดีเอ็นเอ
ของสิ่งอำนวยความสะดวกลำดับ SRL GenProbio (www.genprobio.com) ตาม
โปรโตคอลที่รายงานก่อนหน้านี้ (มิลานิ et al., 2013a, 2013b) ต่อไปนี้
ลำดับลำดับของแต่ละบุคคลได้อ่านถูกกรองโดย
ซอฟต์แวร์ PGM เพื่อลบที่มีคุณภาพต่ำและลำดับโพลี.
ลำดับการจับคู่อะแดปเตอร์ PGM 3 'ก็ยังโดยอัตโนมัติ
ตัด ทั้งหมด PGM ที่มีคุณภาพได้รับการอนุมัติตัดและกรองข้อมูลที่ถูก
ส่งออกเป็นไฟล์ SFF ไฟล์ SFF ถูกประมวลผลโดยใช้ QIIME
(Caporaso et al., 2010) การควบคุม .Quality สะสม sequenceswith ความยาว
ระหว่าง 140 และ 400 bp คะแนนคุณภาพลำดับ withmean ของ N15 และ
ด้วยการตัดของลำดับที่ฐานแรกถ้ากลิ้งที่มีคุณภาพต่ำ 10
bp windowwas พบ การปรากฏตัวของ homopolymers ของ N7bp และลำดับ
ด้วยไพรเมอร์ที่ไม่ตรงกันถูกมองข้าม ในการคำนวณ
มาตรการหลากหลายปลายน้ำ (อัลฟาและดัชนีความหลากหลายเบต้า
วิเคราะห์ Unifrac) 16S rRNA หน่วยอนุกรมวิธานการดำเนินงาน (Otus) ถูก
กำหนดไว้ที่ลำดับที่คล้ายคลึงกัน≥97% อ่านทั้งหมดจะถูกจัด
อันดับการจัดหมวดหมู่ที่ต่ำที่สุดโดยใช้ QIIME และชุดข้อมูลที่อ้างอิง
จากฐานข้อมูลโครงการไรโบโซม (โคล et al., 2009) Otus ถูก
มอบหมายโดยใช้ uclust (เอ็ดการ์, 2010) นอกจาก MEGAN วิเคราะห์
ได้รับอนุญาตให้จัดหมวดหมู่ของคนอ่านลงไปถึงระดับสายพันธุ์ (Huson et al.,
2011) ความคล้ายคลึงกันระหว่างกลุ่มตัวอย่างจะถูกคำนวณโดยถ่วงน้ำหนัก
uniFrac (Lozupone และอัศวิน 2005) ช่วงของความคล้ายคลึงกันมีการคำนวณ
ระหว่างค่า 0 และ 1.
2.6 แยก RNA
RNA ทั้งหมดถูกแยกออกโดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้า
(Turroni et al., 2011a, 2011b, 2011c) สั้น ๆ เม็ดเซลล์ / tissuematerials
ถูก resuspended ใน 1 มิลลิลิตรของ QUIAZOL (Qiagen สหราชอาณาจักร) และวางไว้ใน
ท่อที่มี 0.8 กรัมของลูกปัดแก้ว (เส้นผ่าศูนย์กลาง 106 ไมครอน; Sigma)
เซลล์ถูก lysed โดยการเขย่าผสมในโฮโมจีไน BioSpec ที่ 4 ° C
เป็นเวลา 2 นาที (สูงสุดการตั้งค่า) ส่วนผสมที่ถูกปั่นแล้ว
ที่ 12,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาทีและขั้นตอนบนมี
ตัวอย่าง RNA ที่มีก็หาย ตัวอย่าง RNA ถูกเพิ่มเติม
บริสุทธิ์โดยการสกัดฟีนอลและเอทานอลตกตะกอนตาม
วิธีการที่จัดตั้งขึ้น (Sambrook ในกด) คุณภาพของ RNA
ถูกตรวจสอบโดยการวิเคราะห์ความสมบูรณ์ของโมเลกุล rRNA โดย Experion
(BioRad) การวิเคราะห์.
2.7 Microarray คำอธิบายการติดฉลากและ hybridizations
วิเคราะห์ Microarray ได้ดำเนินการกับอาร์เรย์ oligonucleotide
ขึ้นอยู่กับจีโนมบี bifidum PRL2010: รวม 45,220 oligonucleotide
probes 60 bp ยาวได้รับการออกแบบใน 1707 ORFs
ใช้ eArray5.0 (Agilent Technologies) 5 oligos ได้รับการออกแบบสำหรับ
การแสดงออกของยีนใน 4 × 44 K Agilent ชิป Microarray (Agilent Technologies,
ซานตาคลารา, CA, USA) ซ้ำมีการกระจายบนชิปที่
สุ่มตำแหน่งไม่ติด ชุดของ 152 probes ควบคุมเชิงลบ
ออกแบบบนทำลายจุลินทรีย์และพืชลำดับถูกรวมอยู่ใน
ชิป ถอดความย้อนกลับและการขยายของ 500 เส้นทางของอาร์เอ็นเอทั้งหมด
ได้ดำเนินการกับ Improm-II ™ transcriptase ปลายทาง (

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ส่วนตัวเครื่องโดยแพลตฟอร์มเทคโนโลยีชีวิต ) ที่จัดลำดับดีเอ็นเอ
สถานที่ของ genprobio เป็นต้น ( www.genprobio . com ) ตามพิธีสารรายงานก่อนหน้านี้

( milani et al . , ที่มีมากกว่า 2013b , ) ต่อไปนี้
จัดลำดับ วิเคราะห์แต่ละลำดับอ่านถูกกรองโดย
PGM ซอฟต์แวร์ที่จะลบคุณภาพต่ำและโพลี
ดังนี้ลำดับการจับคู่ PGM 3 อะแดปเตอร์ยังได้รับโดยอัตโนมัติ
ตัด ทั้งหมด PGM คุณภาพการอนุมัติตัดและกรองข้อมูล
ส่งออกเป็นไฟล์ไอที . ไฟล์ประมวลผลการใช้ไอทีเป็น qiime
( caporaso et al . , 2010 ) และ การควบคุมคุณภาพ สะสม sequenceswith ความยาว
ระหว่าง 140 และ 400 BP , withmean ลำดับคุณภาพของคะแนน 15 และ
กับการตัดของลําดับที่ฐานแรก ถ้าคุณภาพต่ำกลิ้ง 10
BP windowwas พบ การปรากฏตัวของโฮโมพอลิเมอร์ของ n7bp และลำดับ
กับดีเอ็นเอไม่ตรงกันถูกเว้นไว้ เพื่อคำนวณค่า
มาตรการความหลากหลายปลายน้ำ ( อัลฟาและเบต้าค่าดัชนีความหลากหลาย unifrac , การวิเคราะห์ 16S rRNA
) ทางหน่วยปฏิบัติการ ( ใน )
นิยามที่≥ 97% เป็นลำดับ .ทั้งหมดอ่านแบ่งไปใช้ qiime อนุกรมวิธานอันดับต่ำสุดที่เป็นไปได้

และอ้างอิงข้อมูลจากฐานข้อมูลไรโบโซม ( โคล et al . , 2009 ) ในการ uclust ( เอ็ดการ์ได้รับมอบหมาย )
, 2010 ) นอกจากนี้ เมแกน วิเคราะห์
อนุญาตการจำแนกสายพันธุ์ระดับ ( อ่านลงฮูสัน et al . ,
2011 ) ความคล้ายคลึงกันระหว่างจำนวนที่คำนวณโดยถ่วงน้ำหนักและ unifrac
( lozupone อัศวิน2005 ) ช่วงของความคล้ายคลึงกันเป็นค่าระหว่างค่า 0 และ 1
.
2.6
รวมแยก RNA อาร์เอ็นเอแยกโดยใช้วิธีการที่อธิบายก่อนหน้านี้
( turroni et al . , 2011a 2011b 2011c , , ) สั้น ๆ , เซลล์เม็ด / tissuematerials
ถูก resuspended ใน 1 มิลลิลิตร quiazol ( QIAGEN , UK ) และอยู่ในหลอดบรรจุ
0.8 กรัมของลูกปัดแก้ว ( เส้นผ่าศูนย์กลาง , 106 μ M ; Sigma )
เซลล์มี lysed โดยการเขย่าผสมในเครื่องปั่น biospec 4 ° C
2 นาที ( การตั้งค่าสูงสุด ) ส่วนผสมก็ระดับ
ที่ 12 , 000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาที และบนเฟสที่มี
RNA ที่มีตัวอย่างหาย ยีนตัวอย่างเพิ่มเติม
บริสุทธิ์ โดยการสกัดฟีนอลและเอทานอล ตามด้วย

วิธีการสร้าง ( sambrook ในกด ) คุณภาพของอาร์เอ็นเอ
ถูกตรวจสอบ โดยวิเคราะห์ความสมบูรณ์ของ rRNA โมเลกุล โดย experion
( biorad ) การวิเคราะห์ .
2.7 . microarray , รายละเอียด , การติดฉลากและการวิเคราะห์ hybridizations
microarray แสดงด้วย ซึ่งเรย์
ตามพ. bifidum prl2010 จีโนม : รวม 45220 ซึ่ง
) ของความดันเลือด 60 ความยาวออกแบบใน 1707 orfs
ใช้ earray5.0 ( Agilent Technologies )5 โอลิโกสถูกออกแบบสำหรับ
แต่ละยีนบน 4 × 44 k Agilent microarray ชิป ( Agilent Technologies ,
ซานตาคลารา แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา ) แบบกระจายอยู่ในชิปที่
สุ่มไม่ติดกันตำแหน่ง ชุดของ 152 ลบควบคุม )
ออกแบบเฟจและลำดับพืชนอกจากนี้ยังรวมกับ
ชิป ถอดความย้อนกลับและเพิ่มปริมาณ 500 นาโน
อาร์เอ็นเอทั้งหมดคือการ™ reverse transcriptase ( improm II