Recovery of FOC from soilCulture me

Recovery of FOC from soil
Culture method. Banana roots were carefully
separated from the soil and lightly shaken to remove
loosely attached soil as bulk soil. The roots with rhizosphere soil were cut into pieces of about 20 mm.
Ten grams of bulk soil or the mixture of root pieces
and rhizosphere soil were separately placed in 90 mL
sterile distilled water, shaken for 30 min and then
kept for 10 min. The number of FOC CFU in the
bulk and rhizosphere soils was determined by serial
dilutions on Komada’s medium (Komada, 1975). The
strains belonging to F. oxysporumwere identified by
their morphological characteristics (Komada, 1975)
and counted.
Real-time polymerase chain reaction. DNA was
extracted from the bulk and rhizosphere soils using the
UltraClean soil DNA isolation kit (Mo Bio, USA) according to the manufacture’s instructions. The primers
reported by Lievens et al. (2005) were used for the
detection of pathogen. A 377-bp fragment of internal
transcribed spacer (ITS) region of FOC was amplified
and cloned in PMD 18-T vector. The concentration was
adjusted to the number of 1×10
11
ITS copies g
−1
,and
the standard was diluted step by step by 10-fold to obtain the standard curves. Real-time polymerase chain
reaction (PCR) amplifications were performed in a total volume of 50μLusingaSYBR@
Premix Ex Taq
TM
(Takara, China). The reaction mixtures contained a final concentration of 25μL SYBR
@
Premix Ex Taq
TM
,
1μL each primer (10μmol L−1
), 1μL ROX reference
dye II (50×), 2 μL template DNA and 20μL sterile
water. The thermal cycling conditions were: 95
◦
Cfor
30 s, followed by 40 cycles of 95
◦
C for 5 s, 60
◦
Cfor
34 s, and 72
◦
C for 15 s, and finally a dissociation stage
(95
◦
C for 15 s, 60
◦
C for 60 s, and 95
◦
C for 15 s).
The amplification results were analyzed with 7500 Fast
System SDS software (ABI, USA).
Determination of soil microbe populations
Microbial populations in the rhizosphere soil were
determined at 56 d after transplantation. The CFU
counts were made by serial dilutions of the rhizosphere
soil suspension on appropriate mediums: beef extract
medium for bacteria (beef extract 5 g, peptone 10
g, NaCl 5 g, H2O 1 000 mL, pH 7.2), Gause’s No. 1
medium for actinomycetes (amidulin 2 g, KNO3 0.1
g, K2HPO4 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.05 g, NaCl 0.05
g, FeSO4·7H2O 0.001 g, H2O 100 mL, pH 7.2), and
Martin’s rose bengal medium for fungi (KH2PO4 1g,
MgSO4·7H2O 0.5 g, peptone 5 g, glucose 10 g, H2O
1 000 mL, pH 7.0, 1% rose bengal solution 3.3 mL, and
1% streptomycin stock solution were added after sterilization) (Huanget al., 2006). Plates were incubated
in dark at 28
◦
C for fungi and 30
◦
C for bacteria and
actinomycetes. The populations of bacteria and actinomycetes were counted after 2–4 d and fungi after
5–7 d of incubation. Four replicates were used for each
treatment.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กู้คืน FOC จากดินวัฒนธรรมวิธีการ รากกล้วยได้อย่างรอบคอบแยกจากดิน และเขย่าเบา ๆ เพื่อเอาออกซึ่งแนบดินเป็นดินจำนวนมาก รากกับดินไรโซสเฟียร์ถูกตัดเป็นชิ้นประมาณ 20 มม.10 กรัมดินจำนวนมากหรือผสมรากหมากและแยกต่างหากไว้ดินไรโซสเฟียร์ใน 90 mLกอซกลั่นน้ำ เขย่าสำหรับ 30 นาทีแล้วเก็บไว้ 10 นาที จำนวน FOC CFU ในการดินเนื้อปูนจำนวนมากและไรโซสเฟียร์ถูกกำหนด โดยลำดับdilutions บนกลางของ Komada (Komada, 1975) ที่สายพันธุ์ของ oxysporumwere F. ระบุลักษณะสัณฐาน (Komada, 1975)และตรวจนับปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบเรียลไทม์ ดีเอ็นเอได้สกัดจากดินเนื้อปูนของไรโซสเฟียร์และจำนวนมากที่ใช้การดิน ultraClean ดีเอ็นเอแยกชุด (Mo ชีวภาพ สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำในการผลิต ไพรเมอร์ที่รายงาน โดย Lievens et al. (2005) ใช้สำหรับการตรวจการศึกษา ส่วน 377 bp ภายในมีขยายเป็นตัวเว้นวรรคทับ (ของ) แคว้น FOCและโคลนในเวกเตอร์ 18 T PMD มีความเข้มข้นปรับปรุงจำนวน 1 × 1011G ของสำเนา−1และมาตรฐานได้ยกเว้นขั้นตอนโดย 10-fold รับเส้นโค้งมาตรฐาน โซ่พอลิเมอเรสแบบเรียลไทม์amplifications (PCR) ปฏิกิริยาดำเนินในปริมาณรวมของ 50μLusingaSYBR แอทPremix Ex TaqTM(Takara จีน) น้ำยาผสมปฏิกิริยาประกอบด้วยความเข้มข้นสุดท้ายของ 25μL SYBR@Premix Ex TaqTM,1μL (10μmol L−1 แต่ละพื้น), 1μL ROX อ้างอิงสีย้อม II (50 ราย), ดีเอ็นเอแม่แบบ 2 μL และผ่านการฆ่าเชื้อ 20μLน้ำ เงื่อนไขการขี่จักรยานความร้อนถูก: 95◦Cfor30 s ตามรอบ 40 95◦C สำหรับ 5 s, 60◦Cfor34 s และ 72◦C 15 s และสุดท้ายขั้น dissociation(95◦C 15 s, 60◦C 60 s และ 95◦C 15 s)ขยายผลได้วิเคราะห์กับ 7500 อย่างรวดเร็วซอฟต์แวร์ระบบ SDS (ABI สหรัฐอเมริกา)กำหนดประชากร microbe ดินมีประชากรจุลินทรีย์ในดินไรโซสเฟียร์กำหนดที่ 56 d หลังจากปลูก การ CFUทำ โดย dilutions ประจำของไรโซสเฟียร์ตรวจนับดินการระงับใน mediums ที่เหมาะสม: เนื้อสารสกัดแบคทีเรีย (เนื้อแยก 5 กรัม peptone 10 ปานกลางg, g NaCl 5, H2O 1 000 mL, pH 7.2), หมายเลข 1 ของ Gauseขนาดกลางสำหรับ actinomycetes (amidulin 2 กรัม KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.05 g, NaCl 0.05กรัม FeSO4·7H2O 0.001 g, H2O 100 mL, pH 7.2), และมาร์ตินส์โรสเบงกอลปานกลางสำหรับเชื้อรา (KH2PO4 1gMgSO4·7H2O 0.5 g, peptone 5 กรัม น้ำตาลกลูโคส 10 กรัม H2O1 000 mL, pH 7.0 โซลูชันเบงกอล 1% กุหลาบ 3.3 mL และเพิ่ม streptomycin 1% หุ้นโซลูชั่นหลังจากฆ่าเชื้อ) (Huanget al., 2006) แผ่นที่ incubatedในความมืดที่ 28◦C สำหรับเชื้อราและ 30◦C สำหรับแบคทีเรีย และactinomycetes ประชากรของแบคทีเรียและ actinomycetes นับได้หลังจาก 2-4 d และเชื้อราหลังจากd 5 – 7 ของคณะทันตแพทยศาสตร์ เหมือนกับ 4 ใช้สำหรับแต่ละรักษา

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การฟื้นตัวของฟรีจากดินวิธีวัฒนธรรม รากกล้วยถูกอย่างรอบคอบแยกออกมาจากดินและเขย่าเบา ๆ เพื่อเอาดินที่ติดดินอย่างอิสระเป็นจำนวนมาก รากที่มีดินบริเวณรากถูกตัดเป็นชิ้นประมาณ 20 มม. สิบกรัมของดินเป็นกลุ่มหรือของผสมของชิ้นส่วนรากและดินบริเวณรากถูกวางไว้แยกต่างหากใน 90 มิลลิลิตรน้ำกลั่นหมันเขย่าเป็นเวลา30 นาทีแล้วเก็บไว้เป็นเวลา10 นาที จำนวน CFU ฟรีในจำนวนมากและดินบริเวณรากถูกกำหนดโดยอนุกรมเจือจางในสื่อของKomada (Komada, 1975) สายพันธุ์ที่เป็นของเอฟ oxysporumwere ระบุลักษณะทางสัณฐานวิทยาของพวกเขา(Komada, 1975) และนับ. ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์แบบ Real-time ดีเอ็นเอที่สกัดจากกลุ่มและดินบริเวณรากโดยใช้ชุดการแยกดีเอ็นเอดินultraclean (ไบโอโมสหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ไพรเมอร์รายงานโดย Lievens et al, (2005) ที่ใช้ในการตรวจสอบของเชื้อโรค ส่วน 377 bp ของภายในspacer คัดลอก (ITS) พื้นที่ของฟรีถูกขยายและโคลนในPMD 18-T เวกเตอร์ ความเข้มข้นได้รับการปรับให้จำนวน 1 × 10 11 สำเนา ITS กรัม-1 และมาตรฐานถูกเจือจางขั้นตอนโดยขั้นตอนโดย 10 เท่าเพื่อให้ได้เส้นโค้งมาตรฐาน เวลาจริงลูกโซ่โพลิเมอร์ปฏิกิริยา (PCR) เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการในปริมาณรวมของ50μLusingaSYBR @ พรีมิกซ์ Ex Taq TM (Takara, จีน) ปฏิกิริยาผสมที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ25μL SYBR @ พรีมิกซ์ Ex Taq TM, 1μLแต่ละไพรเมอร์ (10μmol L-1) 1μL ROX อ้างอิงย้อมครั้งที่สอง(50 ×) 2 ไมโครลิตรดีเอ็นเอแม่แบบที่ผ่านการฆ่าเชื้อและ20μLน้ำ เงื่อนไขการขี่จักรยานการระบายความร้อนได้ 95 ◦ Cfor 30 วินาทีตามด้วย 40 รอบ 95 ◦ C เป็นเวลา 5 วินาที, 60 ◦ Cfor 34 วินาทีและ 72 ◦ C เป็นเวลา 15 วินาทีและในที่สุดก็เป็นเวทีที่แยกออกจากกัน(95 ◦ C เป็นเวลา 15 วินาที 60 ◦ C เป็นเวลา 60 วินาทีและ 95 ◦ C เป็นเวลา 15 วินาที). ผลการใช้เครื่องขยายเสียงที่ได้มาวิเคราะห์กับ 7500 อย่างรวดเร็วระบบSDS ซอฟแวร์ (ABI สหรัฐอเมริกา). การกำหนดประชากรจุลินทรีย์ดินประชากรจุลินทรีย์ในดินบริเวณรากถูกกำหนดที่56 d หลังการปลูก CFU นับได้ทำโดยเจือจางอนุกรมของบริเวณรากระงับดินบนสื่อที่เหมาะสม: สารสกัดจากเนื้อกลางสำหรับแบคทีเรีย(เนื้อสารสกัดจาก 5 กรัม, เปปโตน 10 กรัมโซเดียมคลอไรด์ 5 กรัม, H2O 1 000 มิลลิลิตรมีค่า pH 7.2) Gause หมายเลข 1 ขนาดกลาง สำหรับ actinomycetes (amidulin 2 กรัม, KNO3 0.1 กรัม K2HPO4 0.05 กรัม MgSO4 · 7H2O 0.05 กรัมโซเดียมคลอไรด์ 0.05 กรัม FeSO4 · 7H2O 0.001 กรัม H2O ขนาด 100 มิลลิลิตรมีค่า pH 7.2) และมาร์ตินเพิ่มขึ้นปานกลางเบงกอลสำหรับเชื้อรา(KH2PO4 1g, MgSO4 · 7H2O 0.5 กรัม, เปปโตน 5 กรัมน้ำตาล 10 กรัม, H2O 1 000 มิลลิลิตรพีเอช 7.0, 1% เพิ่มขึ้นการแก้ปัญหาเบงกอล 3.3 มิลลิลิตรและวิธีการแก้ปัญหาหุ้นstreptomycin 1% ถูกเพิ่มเข้ามาหลังจากการฆ่าเชื้อ) (Huanget al., 2006) แผ่นถูกบ่มในที่มืดวันที่ 28 ◦ C เป็นเชื้อราและ 30 ◦ C เป็นเชื้อแบคทีเรียและactinomycetes ประชากรของเชื้อแบคทีเรียและ actinomycetes นับหลังจาก 2-4 วันและเชื้อราหลังจาก5-7 วันของการบ่ม สี่ถูกนำมาใช้ซ้ำสำหรับแต่ละการรักษา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การกู้คืนฟรีจากวิธีการเพาะดิน

รากกล้วยถูกรอบคอบ
แยกจากดิน และค่อย ๆเขย่าเอา
หลวมๆแนบดินเป็นดินขนาดใหญ่ รากกับดินบริเวณรากถูกตัดเป็นชิ้นประมาณ 20 mm .
10 กรัมของดินเป็นกลุ่ม หรือส่วนผสมของรากและดินบริเวณรากได้ถูกแยกชิ้น

อยู่ใน 90 มล. น้ำกลั่นปลอดเชื้อ , เขย่าเป็นเวลา 30 นาทีจากนั้น
เก็บไว้เป็นเวลา 10 นาทีจำนวนฟรีเซลล์ใน
ขนาดใหญ่และรากดินได้กำหนดอนุกรม
เจือจางในโคมาดะปานกลาง ( โคมาดะ , 1975 )
สายพันธุ์ของ F . oxysporumwere ระบุ
ของลักษณะ ( โคมาดะ , 1975 )

เวลานับได้ โดยปฏิกิริยาลูกโซ่จริงๆ ดีเอ็นเอที่สกัดจากรากเป็นกลุ่ม

และดินโดยใช้สะอาดปราศจากเชื้อโรคในดินชุดการสกัดดีเอ็นเอ ( โมไบโอ , USA ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ไพรเมอร์
รายงานโดย lievens et al . ( 2005 ) ใช้สำหรับ
การตรวจหาเชื้อโรค เป็นส่วนของภายใน
377 BP และ spacer ( ITS ) ของภูมิภาคฟรีถูกขยาย
และโคลนในเวกเตอร์ 18-t พีเ มดี . สมาธิคือ
ปรับจำนวน 1 × 10
11

− 1 กรัมของสำเนาและ

,มาตรฐานขั้นตอนโดยเจือจาง 10 เท่า เพื่อให้ได้ตามมาตรฐาน เวลาใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่ ( PCR ) amplifications
จริงได้ในปริมาณรวม 50 μ lusingasybr @


( พรีมิกซ์อดีตได้ดีและ Takara , จีน ) ปฏิกิริยาผสมบรรจุสุดท้ายความเข้มข้น 25 μฉัน SYBR
@
รวมอดีตได้ดี
TM
,
1 μ L แต่ละสีรองพื้น ( 10 μโมล L − 1
) 1 μ L Rox อ้างอิง
สี 2 ( 50 × )2 μผมแม่แบบดีเอ็นเอ และ 20 μผมเป็นหมัน
น้ำ เงื่อนไขการขี่จักรยานการระบายความร้อนได้ 95


◦ C เป็นเวลา 30 วินาที ตามด้วย 40 รอบ 95

b ◦ 5 s , 60


◦ C เป็นเวลา 34 , และ 72 ◦

C เป็นเวลา 15 วินาที และสุดท้าย ขั้นตอนการ◦


( 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 วินาที 60

b ◦ 60 , และ 95
◦
C 15 s )
( วิเคราะห์ผลด้วย 7 ระบบได้อย่างรวดเร็ว SDS ซอฟแวร์ ( ABI อเมริกา

)การกำหนดประชากรจุลินทรีย์ดิน
ประชากรจุลินทรีย์ในดินบริเวณรากถูก
มุ่งมั่นที่ 56 D หลังจากการย้ายปลูก ที่ถูกสร้างโดยต่อเนื่องนับโคโลนี

วิธีการรากดินสะเทือน ในสื่อที่เหมาะสม : สารสกัดจากเนื้อ
) แบคทีเรีย ( สารสกัดจากเนื้อ 5 กรัม 10
กรัม extract , เกลือ 5 กรัม , h2o 1 000 ml , pH 7.2 ) , กอส . 0
ขนาดกลางสำหรับแอคติโนมัยซีท ( amidulin 2 กรัมkno3 0.1
g k2hpo4 0.05 กรัม MgSO4 ใด้วย 7h2o 0.05 กรัมโซเดียมคลอไรด์ 0.05
g feso4 ด้วย 7h2o 0.001 กรัม , h2o 100 มิลลิลิตร pH 7.2 ) และมาร์ตินกุหลาบกลางเบงกอลสำหรับ

( kh2po4 1g รา , 7h2o 0.5 กรัม MgSO4 ใด้วยเปปโตน 5 กรัม น้ำตาล 10 กรัม , H2O
1 , 000 มิลลิลิตร pH 7.0 , 1% โรสเบงกอลโซลูชั่น 3.3 มล.
1 % และสเตร็ปโตมัยซินโซลูชั่นหุ้นเพิ่มหลังจากฆ่าเชื้อ ) ( huanget al . , 2006 ) จานถูกบ่ม
ที่ 28 ◦

ในที่มืดC

C 30 ◦เชื้อราและแบคทีเรียแอคติโนมัยและ
. ประชากรของแบคทีเรียและแอคติโนมัยซีส ( นับหลังจาก 2 – 4 D และเชื้อราหลังจาก
5 – 7 D ของการบ่ม สี่นาที ใช้สำหรับการรักษาแต่ละคน