Materials and MethodsThai native si

Materials and Methods
Thai native silkworm pupaes
The five varieties of the Thai native silkworm pupaes (Keawsakol, Nangnoi Si Sa Ket,
Somrong, Nangleung, and Noneruesee) were collected during May-July 2007 and May-July 2008
from Queen Sirikit Sericulture Center, Nakhon Rachasima and udonThani in Thailand.
Preparation of oils from the Thai native silkworm pupae
The five varieties of the Thai native silkworms were boiled at 100ºC until floating above the
water level. Then the water was drained, and the worms were roasted until reaching 8% of moisture.
After that, the dried pupae were ground to powder. Oils from the powder were Soxhlet extracted
using a Soxhlet apparatus (Doneanu et al., 1997; Khobkol et al., 2002) and maceration extracted
using petroleum ether as a solvent (Nipha et al., 1997; Doneanu et al., 1997). For the soxhlet method,
the dried pupae powder was boiled with petroleum ether at the ratio of 100 g of the powder to 300 ml
of the solvent for 18 h in a Soxhlet apparatus. The extracted oils were filtered and the solvent was
evaporated by a rotary vacuum evaporator at 40°C. For the maceration methods, the powder was
added into the petroleum ether at the ratio of 100 g of the powder to 750 ml of the solvent. Then, the
mixture was blended for 3 min and shaken at the speed of 200 rpm, 10ºC for 5 days. The extracted
oils were filtered and the solvent was evaporated by a rotary vacuum evaporator at 40ºC. The oil
samples were kept at 4ºC until use.
Determination of linoleic acid content
Linoleic acid (>99%) standard was obtained from Sigma-Aldrich (Chemie GmbH, Steinheim).
Dissolve oils sample (1g) of free fatty acids in methanol and neutralize with the KOH solution.
Evaporate the mixture under nitrogen. Add to the residue 0.1 ml of 2mM 18-crown-6 in acetonitrile
and 0.1 ml 4-bromophenacyl bromide. Heat the mixture at 80 oC for 15 min in mixing gently several
times. Cool the vial. Then, the samples were determined by HPLC (Luna® C18 to micron 250x4.0 nm
Phenomenex USA Column, LC1200 UV/VIS Detector and LC1100 HPLC pump) with the 90%(v/v)
acetonitrile and 10%(v/v) of 0.1%(w/v) Trifluoroacetic acid, injection volume 10 μl, flow rate 1 ml/min
with the UV detector at 210 nm. The linoleic acid contents were calculated by comparing with the
standard linoleic acid (Sigma, Co., St. Louis, USA).
Determination of fatty acids
Fatty acid methyl esters (Aldrich, England) standard solution mixture was used. The extracted
oils were converted to methyl ester in usual manner by refluxing with methanolic sodium hydroxide
solution, boron trifluoride reagent and n-heptane (Official Methods of Analysis, 1997). The fatty acid
composition of the esterified oil was characterized and quantified using Varian Vista 3400 CX gas
chromatograph as described above.HP-INNOWAX (30m ×0.25mm) was used. The initial column
temperature was 210 oC and final temperature was 250 oC. The detector temperature was 300 C.
Hydrogen and air flows were 30 and 300 mL/min, respectively. Sample (0.5 mL of oil solutions1:10 in
hexane) Data were calculated using the normalized peak area percentages of fatty acids.
Free radical scavenging assay
Oil samples at 12.5,25,50,100 and 200 mg/ml and the standard antioxidants : vitamin C ,
vitamin E ,BHT and linoleic acid in the mixture of 95%(v/v) ethanol and 10%(v/v) DMSO (1:1) were
assayed for free radical scavenging activity by the DPPH method (Jung, B. K. et al., 2006). 100 μl of
samples or standards, 25 μl of 2mg/ml DPPH in 95% ethanol and 25 μl of 95%(v/v) ethanol were
mixed in 96-well microplates and incubated at room temperature (25C) for 30 min. The absorbance
was measured at 515 nm. The percentages of DPPH radical scavenging activity were calculated
according to the following equation: % DPPH radical scavenging activity = [A – B] x 100
A
where A is the absorbance of the control reaction (containing all reagents except the test
samples), and B is the absorbance of the test samples. Sample concentrations providing 50%
scavenging activity (SC50) was calculated from the graph plotted between free radical scavenging
inhibition percentages and the sample concentrations.
Tyrosinase inhibition assay
Oil samples at 200, 100, 50, 25 and 12.5 mg/ml and the standard antioxidants: vitamin C and
kojic acid were mixed with 5% (v/v) DMSO and assayed by the modified dopachrome method using
tyrosine as a substrate as previously described (Long et al., 2000). Briefly, 40 l of samples or
standards, 40 l of 0.1 mg/ml L-tyrosine, 50 l of 0.1 mg/ml mushroom tyrosinase and 80 l of 0.1M
phosphate buffer were added in 96-well microplates. The 5% (v/v) DMSO solution was used as a
negative control. The mixture was incubated at 37C for 60 min. Before and after incubation, the
amount of dopachrome produced in the reaction mixture was measured at 450 nm. The experiment
was done in triplicate. The percentages of tyrosinase inhibition were calculated according to the
following equation: % inhibition activity = [(A-B) - (C-D)] x 100
(A-B)
where A is the absorbance of the blank after incubation, B is the absorbance of the blank
before incubation, C is the absorbance of the sample after incubation, and D is the absorbance of the
sample before incubation. Sample concentrations providing 50% inhibition (IC50) were calculated
from the graph plotted between tyrosinase inhibition activity percentages and the concentrations

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการไหมไทยพื้นเมือง pupaesพันธุ์ pupaes ไหมไทยพื้นเมือง (Keawsakol, Nangnoi ศรีสะเกษ 5สำโรง Nangleung และ Noneruesee) ได้รวบรวมในช่วงพฤษภาคม 2007 กรกฎาคมพฤษภาคมกรกฏา 2008 คมจาก ศูนย์สิริกิติ์ Sericulture ดิ่ว และอุดรธานีในประเทศไทยเตรียมน้ำมัน pupae ไหมไทยพื้นเมืองพันธุ์ silkworms ภาษาไทย 5 ถูกต้มที่ 100ºC จนลอยอยู่เหนือใบระดับน้ำ น้ำไม่ระบายออก และหนอนถูกย่างจนถึง 8% ของความชื้นหลังจากนั้น pupae แห้งถูกพื้นดินผง น้ำมันผงถูกสกัด Soxhletใช้เครื่อง Soxhlet (Doneanu และ al., 1997 Khobkol และ al., 2002) และ maceration สกัดใช้ปิโตรเลียมอีเทอร์เป็นตัวทำละลาย (นิภาและ al., 1997 Doneanu และ al., 1997) สำหรับวิธี soxhletผงแห้ง pupae ถูกต้ม ด้วยปิโตรเลียมอีเทอร์ในอัตราส่วน 100 กรัมของผงไป 300 มล.ของตัวทำละลายสำหรับ h 18 ในเครื่อง Soxhlet มีกรองแยกน้ำมัน และตัวทำละลายมีหายไป โดยที่ evaporator สิวโรตารี่ที่ 40 องศาเซลเซียส สำหรับวิธี maceration ผงได้เพิ่มเข้าไปในอีเทอร์ปิโตรเลียมในอัตราส่วน 100 กรัมของผงไป 750 มิลลิลิตรของตัวทำละลาย นั้นส่วนผสมสำหรับ 3 นาทีผสม และเขย่าที่ความเร็ว 200 รอบต่อนาที 10ºC 5 วัน การแยกมีกรองน้ำมัน และตัวทำละลายไม่หายไป โดยที่ evaporator สิวโรตารี่ที่ 40 องศาเซลเซียส น้ำมันตัวอย่างถูกเก็บไว้ที่ 4ºC จนกว่าจะใช้กำหนดเนื้อหากรด linoleicกรด linoleic (> 99%) มาตรฐานได้รับจากซิก-Aldrich (Chemie GmbH, Steinheim)ละลายน้ำมันตัวอย่าง (1g) ของกรดไขมันอิสระในเมทานอล และแก้ ด้วยโซลูชั่นเกาะระเหยผสมภายใต้ไนโตรเจน เพิ่ม 0.1 มล. 2 มม. 18-คราวน์-6 ใน acetonitrile สารตกค้างและโบรไมด์ 0.1 มล. 4-bromophenacyl ความร้อนที่ 80 องศาเซลเซียสสำหรับ 15 นาทีในการผสมเบา ๆ หลายส่วนผสมครั้ง เย็นคอนแทค แล้ว ตัวอย่างถูกกำหนด โดย HPLC (Luna ® C18 เพื่อ nm 250x4.0 ไมครอนปั๊ม Phenomenex สหรัฐอเมริกา เครื่องตรวจ จับ UV/VIS LC1200 และ LC1100 HPLC) กับ 90%(v/v)acetonitrile และ 10%(v/v) 0.1%(w/v) Trifluoroacetic กรด กระแส μl ปริมาณ 10 ฉีด 1 ml/min อัตราด้วยเครื่องตรวจจับ UV ที่ 210 nm เนื้อหากรด linoleic ถูกคำนวณ โดยการเปรียบเทียบกับการกรด linoleic มาตรฐาน (ซิกมา บริษัท St. Louis สหรัฐอเมริกา)เรื่องของกรดไขมันใช้สารละลายมาตรฐานกรดไขมัน methyl esters (Aldrich อังกฤษ) ส่วนผสม การแยกน้ำมันถูกแปลงเป็นเอส methyl ในตามปกติ โดย refluxing มี methanolic โซเดียมไฮดรอกไซด์โซลูชั่น รีเอเจนต์ trifluoride โบรอน และ n-heptane (ทางวิธีการของการวิเคราะห์ 1997) กรดไขมันองค์ประกอบของน้ำมัน esterified ถูกลักษณะ และ quantified ใช้แก๊ส CX 3400 Vista แล้วแต่กำหนดchromatograph ที่อธิบายข้างต้น HP INNOWAX (30m × 0.25 มม.) ใช้ คอลัมน์เริ่มต้นอุณหภูมิ 210 องศาเซลเซียส และอุณหภูมิสุดท้ายเป็น 250 oC. เครื่องตรวจจับอุณหภูมิได้ 300 Cไฮโดรเจนและอากาศไหลได้ 300 mL/min และ 30 ตามลำดับ ตัวอย่าง (0.5 mL ของ solutions1:10 น้ำมันในเฮกเซน) ข้อมูลถูกคำนวณโดยใช้เปอร์เซ็นต์ที่ตั้งมาตรฐานสูงสุดของกรดไขมันอนุมูลอิสระ scavenging assayตัวอย่างที่ 12.5,25,50,100 และ 200 mg/ml และสารต้านอนุมูลอิสระมาตรฐานน้ำมัน: วิตามิน Cบาท วิตามินอี และกรด linoleic ในส่วนผสมของเอทานอ 95%(v/v) และ 10%(v/v) DMSO (1:1) ได้assayed scavenging กิจกรรมรุนแรงฟรี โดยวิธี DPPH (Jung, B. คุณ et al., 2006) Μl 100 ของตัวอย่างหรือมาตรฐาน μl 25 ของ 2mg/ml DPPH ใน 95% เอทานอลและ μl 25 ของ 95%(v/v) เอทานอลได้ผสมดี 96 microplates และ incubated ใน 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (25C) Absorbance ที่มีวัดที่ 515 nm มีคำนวณเปอร์เซ็นต์ของ DPPH รุนแรง scavenging กิจกรรมตามสมการต่อไปนี้: %กิจกรรม DPPH scavenging รุนแรง = [A-B] x 100Aเป็น absorbance ของควบคุมปฏิกิริยา (reagents ทั้งหมดยกเว้นการทดสอบประกอบด้วยตัวอย่าง), และบี absorbance ของตัวอย่างทดสอบ ความเข้มข้นของตัวอย่างที่ให้ 50%scavenging กิจกรรม (SC50) ถูกคำนวณจากกราฟที่พล็อตระหว่างอนุมูลอิสระ scavengingเปอร์เซ็นต์การยับยั้งและความเข้มข้นอย่างทดสอบการยับยั้ง tyrosinaseตัวอย่างที่ 200, 100, 50, 25 และ 12.5 mg/ml และสารต้านอนุมูลอิสระมาตรฐานน้ำมัน: วิตามินซี และkojic กรดผสมกับ 5% (v/v) DMSO และ assayed โดยใช้วิธี dopachrome แก้ไขtyrosine เป็นพื้นผิวเป็นก่อนหน้านี้อธิบาย (ยาวและ al., 2000) ตัวอย่างสั้น ๆ 40 l หรือมาตรฐาน l 40 ของ 0.1 mg/ml L tyrosine, l 50 ของ tyrosinase เห็ด 0.1 mg/ml และ l 80 0.1 เมตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ถูกเพิ่มใน microplates 96-ดี ใช้โซลูชัน DMSO 5% (v/v) เป็นการควบคุมค่าลบ ส่วนผสมคือ incubated ที่ 37C ใน 60 นาที ก่อน และ หลังการ บ่ม การจำนวนผลิตส่วนผสมปฏิกิริยา dopachrome ถูกวัดที่ 450 nm ทดลองภายใน triplicate มีคำนวณเปอร์เซ็นต์การยับยั้ง tyrosinase ตามสมการต่อไปนี้: %ยับยั้งกิจกรรม = [(A-B) - (C-D)] x 100(A-B)absorbance ของว่างเปล่าหลังจากฟักตัว A, B คือ absorbance ของว่างเปล่าก่อนคณะทันตแพทยศาสตร์ C absorbance ของตัวอย่างหลังจากคณะทันตแพทยศาสตร์ และ D absorbance ของตัวอย่างก่อนที่จะฟักตัว มีคำนวณความเข้มข้นของตัวอย่างให้ยับยั้งการ 50% (IC50)จากกราฟที่พล็อตระหว่าง tyrosinase ยับยั้งกิจกรรมเปอร์เซ็นต์และความเข้มข้นที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการไหมพื้นเมือง pupaes ห้าพันธุ์ของ pupaes ไหมพื้นเมืองไทย (Keawsakol, แน่งน้อยศรีสะเกษสำโรง, Nangleung และ Noneruesee) ถูกเก็บในช่วงเดือนพฤษภาคมถึงเดือนกรกฎาคมปี 2007 และเดือนพฤษภาคมถึงกรกฎาคม 2008 จากสมเด็จพระราชินีสิริกิติ์หม่อนไหมศูนย์จังหวัด นครราชสีมาและอุดรธานีในประเทศไทย. เตรียมของน้ำมันจากดักแด้ไหมพื้นเมืองห้าพันธุ์ของหนอนไหมพื้นเมืองของไทยถูกต้มที่100ºCจนลอยข้างต้นระดับน้ำ จากนั้นน้ำได้ระบายและเวิร์มที่ถูกคั่วจนกว่าจะถึง 8% ของความชื้น. หลังจากนั้น pupae แห้งมาบดเป็นผง น้ำมันจากผงเป็นวิธีการสกัดแบบสกัดโดยใช้เครื่องมือวิธีการสกัดแบบ (Doneanu et al, 1997;.. Khobkol, et al, 2002) และยุ่ยสกัดโดยใช้ปิโตรเลียมอีเทอร์เป็นตัวทำละลาย (นิภา, et al, 1997;.. Doneanu, et al, 1997) . สำหรับวิธีการวิธีการสกัดแบบ, ผงดักแด้แห้งต้มกับปิโตรเลียมอีเทอร์ในอัตราส่วน 100 กรัมของผง 300 มิลลิลิตรของตัวทำละลายเป็นเวลา18 ชั่วโมงในเครื่องมือวิธีการสกัดแบบ น้ำมันสกัดถูกกรองและตัวทำละลายที่ถูกระเหยด้วยเครื่องระเหยแบบหมุนสูญญากาศที่ 40 ° C สำหรับวิธีการยุ่ยผงที่ถูกเพิ่มเข้าไปในอีเธอร์ปิโตรเลียมในอัตรา 100 กรัมของผง 750 มล. ของตัวทำละลาย จากนั้นส่วนผสมที่ถูกผสมเป็นเวลา 3 นาทีและเขย่าที่ความเร็ว 200 รอบต่อนาทีของที่ 10 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วัน ที่สกัดน้ำมันถูกกรองและตัวทำละลายที่ระเหยได้โดยสูญญากาศเครื่องระเหยแบบหมุนที่40ºC น้ำมันตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ที่4ºCจนถึงการใช้งาน. การหาปริมาณกรดไลโนเลอิกกรดไลโนเลอิ (> 99%) มาตรฐานที่ได้รับจาก Sigma-Aldrich (Chemie GmbH, Steinheim). ละลายตัวอย่างน้ำมัน (1 กรัม) ของกรดไขมันอิสระในเมทานอลและต่อต้าน ด้วยโซลูชั่น KOH. ระเหยผสมภายใต้ไนโตรเจน เพิ่มไปยังตกค้าง 0.1 มิลลิลิตร 2mm 18 มงกุฎ-6 ใน acetonitrile และ 0.1 มล. 4 bromophenacyl โบรไมด์ ส่วนผสมความร้อนที่ 80 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีในการผสมเบา ๆ หลายครั้ง ที่น่าสนใจขวด จากนั้นกลุ่มตัวอย่างที่ถูกกำหนดโดยวิธี HPLC (Luna® C18 เพื่อไมครอน 250x4.0 นาโนเมตรPhenomenex สหรัฐอเมริกาคอลัมน์ LC1200 UV / VIS ตรวจจับและ LC1100 ปั๊ม HPLC) กับ 90% (v / v) acetonitrile และ 10% (v / v) 0.1% (w / v) กรด TRIFLUOROACETIC ปริมาณการฉีด 10 ไมโครลิตรอัตราการไหล 1 มิลลิลิตร / นาทีกับเครื่องตรวจจับรังสียูวีที่210 นาโนเมตร เนื้อหากรดไลโนเลอิกถูกคำนวณโดยการเปรียบเทียบกับกรดไลโนเลอิกมาตรฐาน (ซิกม่า จำกัด เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา). การกำหนดของกรดไขมันไขมันเมทิลเอสเตอร์ของกรด (ดิช, อังกฤษ) ผสมสารละลายมาตรฐานที่ใช้ ที่สกัดน้ำมันเปลี่ยนเมทิลเอสเตอร์ในลักษณะปกติโดยกรดที่มีโซเดียมไฮดรอกไซเมทานอลการแก้ปัญหาสารโบรอนtrifluoride และ n-heptane (Official วิธีการวิเคราะห์, 1997) กรดไขมันองค์ประกอบของน้ำมัน esterified ก็มีลักษณะและปริมาณการใช้ Varian Vista 3400 CX ก๊าซ chromatograph ตามที่อธิบายไว้ above.HP-INNOWAX (30m × 0.25mm) ถูกนำมาใช้ คอลัมน์เริ่มต้นที่อุณหภูมิ 210 องศาเซลเซียสเป็นอุณหภูมิและสุดท้ายคือ 250 องศาเซลเซียส เครื่องตรวจจับอุณหภูมิ 300 C. ไฮโดรเจนและกระแสอากาศ 30 และ 300 มิลลิลิตร / นาทีตามลำดับ ตัวอย่าง (0.5 มิลลิลิตรน้ำมัน solutions1: 10 ในเฮกเซน) ข้อมูลคำนวณโดยใช้อัตราร้อยละพื้นที่สูงสุดปกติของกรดไขมัน. ฟรีทดสอบการต้านอนุมูลตัวอย่างน้ำมันที่ 12.5,25,50,100 และ 200 mg / ml และสารต้านอนุมูลอิสระมาตรฐาน: วิตามินซี วิตามินอีบาทและกรดไลโนเลอิกในส่วนผสม 95% (v / v) เอทานอล 10% (v / v) DMSO (1: 1) ได้รับassayed สำหรับต้านอนุมูลอิสระโดยวิธี DPPH (จุง BK et al, ., 2006) 100 ไมโครลิตรของตัวอย่างหรือมาตรฐาน25 ไมโครลิตรของ 2mg / ml DPPH ในเอทานอล 95% และ 25 ไมโครลิตร 95% (v / v) เอทานอลได้รับการผสมใน96 หลุม microplates และบ่มที่อุณหภูมิห้อง (25C) เป็นเวลา 30 นาที . การดูดกลืนแสงวัดที่ 515 นาโนเมตร ร้อยละของกิจกรรมต้านอนุมูล DPPH ถูกคำนวณตามสมการต่อไปนี้:% ต้านอนุมูลอิสระ DPPH = [A - B] x 100 ที่เป็นการดูดกลืนแสงของการเกิดปฏิกิริยาควบคุม (ที่มีสารเคมีทั้งหมดยกเว้นการทดสอบตัวอย่าง) และ B คือการดูดกลืนแสงของตัวอย่างทดสอบ ความเข้มข้นของตัวอย่างให้ 50% ต้าน (SC50) ที่คำนวณได้จากกราฟพล็อตระหว่างขับอนุมูลอิสระเปอร์เซ็นต์การยับยั้งและความเข้มข้นของตัวอย่าง. ทดสอบการยับยั้ง Tyrosinase ตัวอย่างน้ำมันที่ 200, 100, 50, 25 และ 12.5 mg / ml และสารต้านอนุมูลอิสระมาตรฐาน: วิตามินซีและกรดโคจิกถูกผสมกับ5% (v / v) DMSO และ assayed โดยวิธี dopachrome ปรับเปลี่ยนโดยใช้ไทโรซีนเป็นสารตั้งต้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(Long et al., 2000) สั้น ๆ , 40 lของตัวอย่างหรือมาตรฐาน40 l 0.1 mg / ml L-tyrosine 50 l 0.1 mg / ไทโรซิเนเห็ดมล. และ 80 lของ 0.1M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ถูกเพิ่มเข้ามาใน 96 หลุม microplates 5% (v / v) การแก้ปัญหา DMSO ใช้เป็นที่ควบคุมเชิงลบ ส่วนผสมที่ถูกบ่มที่37C 60 นาที ก่อนและหลังการบ่มที่ปริมาณของ dopachrome ผลิตในผสมปฏิกิริยาวัดที่ 450 นาโนเมตร การทดลองได้ทำในเพิ่มขึ้นสามเท่า เปอร์เซ็นต์การยับยั้งไทโรซิเนถูกคำนวณตามสมการต่อไปนี้: กิจกรรมการยับยั้ง% = [(AB) - (CD)] x 100 (AB) ซึ่งเป็นการดูดกลืนแสงของว่างหลังจากการบ่ม, B คือการดูดกลืนแสงของว่างก่อนบ่ม C มีการดูดกลืนแสงของกลุ่มตัวอย่างหลังจากการบ่มและ D เป็นการดูดกลืนแสงของตัวอย่างก่อนการบ่ม ความเข้มข้นของตัวอย่างให้ยับยั้ง 50% (IC50) จะถูกคำนวณจากพล็อตกราฟระหว่างร้อยละฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์tyrosinase และความเข้มข้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ pupaes

ไทยไหมพื้นเมืองห้าพันธุ์ของคนไทย pupaes ( keawsakol ไหมพื้นเมืองพันธุ์นางน้อยศรีสะเกษ ,
สำโรง nangleung , และ noneruesee ) ได้รวบรวมในช่วงเดือนพฤษภาคม กรกฎาคม 2007 และกรกฎาคม 2008
จากศูนย์หม่อนไหมฯ ราชินี นครราชสีมา และอุดรธานี ประเทศไทย .
การเตรียมน้ำมันจาก ดักแด้หนอนไหมพื้นเมือง
ภาษาไทยห้าพันธุ์ของหนอนไหมพื้นเมืองมาต้มที่ 100 º C จนลอยอยู่เหนือ
ระดับน้ำ แล้วน้ำระบาย และหนอนที่ถูกย่างจนไปถึง 8 % ความชื้น
หลังจากนั้น ดักแด้แห้งดินผง น้ำมันจากเนื้อผงถูกสกัดโดยใช้เครื่องมือ 1
1 ( doneanu et al . , 1997 ; khobkol et al . , 2002 ) และระยะเวลาสกัด
โดยใช้ปิโตรเลียมอีเทอร์เป็นตัวทำละลาย ( nipha et al . , 1997 ; doneanu et al . , 1997 ) สำหรับวิธี Soxhlet
ดักแด้แห้ง , ผงต้มกับปิโตรเลียมอีเทอร์ในอัตราส่วน 100 กรัมของผง 300 ml
ของตัวทำละลาย 18 H ใน 1 เครื่อง สกัดน้ํามันถูกกรองและระเหยตัวทำละลายคือ
โดยระเหยแบบสุญญากาศ ที่อุณหภูมิ 40 องศา ให้ยุ่ยวิธีการ , ผง
เพิ่มลงในปิโตรเลียมอีเธอร์ ในอัตราส่วน 100 กรัมของผง 750 ml ของตัวทำละลาย งั้น
ผสมผสม 3 นาทีและเขย่าที่ความเร็ว 200 รอบต่อนาที 10 ºองศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วัน สกัดน้ํามันถูกกรองและตัวทำละลาย
นำมาระเหยโดยระเหยแบบสุญญากาศที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียสºน้ำมัน
จำนวนไว้ที่ 4 º C จนกระทั่งใช้ ปริมาณกรดไลโนเลอิก

กรดไลโนเลอิค ( > 99% ) มาตรฐานที่ได้จากซิกม่า Aldrich ( CHEMIE GmbH , steinheim ) .
ละลายน้ำมันตัวอย่าง ( 1G ) ของกรดไขมันอิสระในเมทานอลและแก้ด้วยโซลูชันเกาะ .
ระเหยผสมภายใต้ไนโตรเจน เพิ่มกากใน 0.1 มิลลิลิตร 18-crown-6 2mm และไน
0.1 มิลลิลิตร 4-bromophenacyl Bromide ความร้อนผสมที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีในการผสมเบา ๆหลาย
ครั้งเย็นขวด . แล้ว ตัวอย่าง โดยวิธี HPLC ( ลูน่า® c18 เพื่อไมครอน 250x4.0 nm
phenomenex สหรัฐอเมริกาคอลัมน์ lc1200 UV / VIS เครื่องตรวจจับและ lc1100 HPLC ปั๊ม ) กับ 90 % ( v / v )
ไนและ 10% ( v / v ) 0.1% ( w / v ) กรดไตรฟลูออโรอะซิติกฉีดปริมาณ 10 μลิตร อัตรา 1 มิลลิลิตรต่อนาที
กับ UV เครื่องตรวจจับที่ 210 nm ไหล เนื้อหาของกรด linoleic คำนวณโดยการเปรียบเทียบกับ