To extract viral nucleic acid fromm

To extract viral nucleic acid frommussels, digestive tissues (DT), defined
here as the digestive glands which surround the entire stomach
and part of the intestine (Gosling, 2003), from at least 10 animals originating
fromone or two neighbor harvesting areaswere excised, pooled
and comminuted by razor blades. Viral nucleic acid was extracted from
2.0 g sub-samples of DT according to the method included in the newly
developed ISO TS 15216 standard (Anonymous, 2013), except that the
entire amount of homogenized DT using three ml of lysis buffer and
140 μl magnetic beads was processed as described by Uhrbrand et al.
(2010).
To evaluate the extraction efficiency of viral nucleic acids from the
mussel tissue, approximately 104 plaque forming units of mengovirus
(MC0),was added as internal process control to all portions of homogenized
DT prior to proteinase K (N30 units/mg, FinnZymes, Finland)
treatment. The relative recovery efficiencies and the inhibition during
detection of HEV, RV-A and PCV2 in mussel DT, were determined in
two independent runs usingmussel DT froma confirmed negative sample
and pig slurry previously shown to contain 1.2 × 104, 5.4 × 104 and
3.8 × 105 PCR units ml−1 of HEV, PCV2 or RV-A particles, respectively.
One PCR unit was defined as the highest dilution that tested positive
by the assay. The recovery efficiencieswere calculated as the differences
in average Ct (ΔCt) values obtained from nucleic acid extracts of 140 μl
pig slurry alone and 2 g DT spiked with 140 μl slurry prior to PK treatment.
To determine the effect of PK treatment on the virus recoveries
during nucleic acid extraction, Ct values obtained from virus detection
in pig slurry by the inclusion and exclusion of PK prior to the nucleic
acid extraction were compared.
The inhibitory effect of the mussel extract was calculated as the differences
in Ct values obtained from testing 1 μl of slurry extracts alone,
and spiked with undiluted and 10-fold diluted mussel extracts (5 μl).
Detection of viruses was carried out by real time RT-PCR on a
RotorGene Q (QIAGEN, Hilden, Germany) using the RotorGene Q Series
software 2.0.2. All samples were assayed in duplicates of undiluted and
10-fold diluted nucleic acid extracts. HEV was detected using the assay
by Breumet al. (Breumet al., 2010) applyingmodified primer and probe
concentrations, HEV2-R and HEV2-P (500 nM) and HEV-F (100 nM),
and reaction conditions, denaturation (15 s), annealing (15 s) and elongation
(20 s). From the 10-fold dilution series of a plasmid containing
the target HEV region, an amplification efficiency of 88% and a slope of
−3.64 were calculated. RV-A and MC0 were detected using the RNA
Ultrasense One-Step qRT-PCR System (Invitrogen, cat number 11732-

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การสกัดกรดนิวคลีอิกไวรัส frommussels เนื้อเยื่อทางเดินอาหาร (DT), กำหนดที่นี่เป็นต่อมย่อยอาหารที่กระเพาะอาหารทั้งหมดล้อมรอบและส่วนของลำไส้ (กอสลิง 2003), จากสัตว์น้อย 10 มาfromone หรือสองใกล้เคียงเก็บเกี่ยว areaswere excised รวมและ comminuted โดยใบมีดโกน กรดนิวคลีอิกไวรัสถูกสกัดจาก2.0 g ย่อยตัวอย่าง DT ตามวิธีการรวมอยู่ในใหม่พัฒนามาตรฐาน ISO TS 15216 (ไม่ระบุชื่อ 2013), ยกเว้นที่จำนวนทั้งหมดใช้ ml สามบัฟเฟอร์ lysis DT homogenized เป็นกลุ่ม และΜl 140 เม็ดแม่เหล็กมีการประมวลผลตามที่อธิบายไว้โดย Uhrbrand et al(2010)การประเมินประสิทธิภาพการสกัดกรดนิวคลีอิกไวรัสจากการเนื้อเยื่อหอยแมลงภู่ ประมาณ 104 หินปูนขึ้นรูปหน่วย mengovirus(MC0), เพิ่มเป็นการควบคุมกระบวนการภายในกับส่วนทั้งหมดของ homogenized เป็นกลุ่มDT ก่อน proteinase K (N30 หน่วย/มิลลิกรัม FinnZymes ฟินแลนด์)การรักษา ประสิทธิภาพการกู้คืนญาติและยับยั้งในระหว่างตรวจ HEV, RV-A และ PCV2 ใน DT หอยแมลงภู่ถูกกำหนดในfroma usingmussel DT ทำงานอิสระสองยืนยันตัวอย่างลบและน้ำหมูที่แสดงก่อนหน้านี้ มี 1.2 × 104, 5.4 × 104 และMl−1 การหน่วย PCR 3.8 × 105 HEV, PCV2 หรือ อนุภาค RV A ตามลำดับหน่วย PCR ถูกกำหนดเป็นการเจือจางสูงสุดที่ทดสอบเป็นบวกโดยทดสอบ Efficiencieswere กู้คำนวณเป็นความแตกต่างCt (ΔCt) ค่าเฉลี่ยที่ได้จากกรดนิวคลีอิกสารสกัดของ 140 μlหมูน้ำเพียงอย่างเดียวและ g 2 DT spiked ด้วยสารละลาย μl 140 ก่อนรักษา PKการกำหนดผลของการบำบัด PK recoveries ไวรัสในระหว่างการสกัดกรดนิวคลีอิก ค่า Ct ที่ได้รับจากการตรวจหาไวรัสในสารละลายหมูโดยรวมและแยกของ PK ก่อนที่ nucleicสกัดกรดถูกเปรียบเทียบลิปกลอสไขผลของสารสกัดจากหอยแมลงภู่ถูกคำนวณเป็นความแตกต่างค่า Ct ที่ได้รับจากการทดสอบ μl 1 ของสารละลายแยกคนเดียวและถูกแทง ด้วยสารสกัดจากหัว และแตกออก 10-fold หอย (5 μl)ตรวจหาไวรัสที่ถูกดำเนินการตามจริงเวลา RT-PCR ในการQ RotorGene (QIAGEN, Hilden เยอรมนี) โดยใช้ชุด Q RotorGeneซอฟต์แวร์ 2.0.2 ตัวอย่างทั้งหมดถูก assayed ในสำเนาของหัว และ10-fold ผสมสารสกัดจากกรดนิวคลีอิก HEV พบโดยใช้การทดสอบโดย Breumet al. (Breumet al., 2010) applyingmodified สีรองพื้นและโพรบความเข้มข้น HEV2 R และ HEV2 P (500 nM) และ HEV F (100 นาโนเมตร),และเงื่อนไขปฏิกิริยา denaturation (15 s), หลอม (15 s) และ elongation(20 s) จากชุด 10-fold เจือจางของ plasmid ที่ประกอบด้วยภูมิภาคเป้าหมาย HEV ประสิทธิภาพการขยาย 88% และความชันของมีคำนวณ −3.64 RV-A และ MC0 พบใช้อาร์เอ็นเอระบบ qRT PCR ขั้นตอนเดียว Ultrasense (Invitrogen แมวเลข 11732-

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ต้องการแยก frommussels กรดนิวคลีอิกของไวรัสเนื้อเยื่อทางเดินอาหาร (DT) กำหนดไว้
ที่นี่เช่นต่อมย่อยอาหารที่ล้อมรอบทั้งท้อง
และเป็นส่วนหนึ่งของลำไส้ (กอสลิง, 2003) จากอย่างน้อย 10 สัตว์ที่มีต้นกำเนิด
fromone หรือสองเก็บเกี่ยวเพื่อนบ้าน areaswere พอ, pooled
และชิ้นเล็กโดยใบมีดโกน กรดนิวคลีอิกไวรัสถูกสกัดจาก
2.0 กรัมตัวอย่างย่อยของ DT ตามวิธีการที่รวมอยู่ในที่เพิ่ง
พัฒนา ISO TS 15216 มาตรฐาน (Anonymous, 2013) ยกเว้นว่า
จำนวนเงินทั้งหมดของหดหาย DT ใช้สามมลของบัฟเฟอร์สลายและ
140 ไมโครลิตรแม่เหล็ก ลูกปัดมีการประมวลผลตามที่อธิบายไว้โดย Uhrbrand et al.
(2010).
เพื่อประเมินประสิทธิภาพในการสกัดของกรดนิวคลีอิกของไวรัสจาก
เนื้อเยื่อหอยแมลงภู่ประมาณ 104 แผ่นโลหะขึ้นรูปหน่วย mengovirus
(MC0) ถูกบันทึกอยู่ในการควบคุมกระบวนการภายในเพื่อทุกส่วนของหดหาย
DT ก่อนที่จะ Proteinase K (หน่วย N30 / มิลลิกรัม FinnZymes, ฟินแลนด์)
การรักษา ประสิทธิภาพในการกู้คืนญาติและการยับยั้งในระหว่าง
การตรวจสอบของ HEV, RV-และ PCV2 ใน DT หอยแมลงภู่, ได้รับการพิจารณาใน
สองวิ่งอิสระ usingmussel DT FROMA ยืนยันตัวอย่างเชิงลบ
และผสมหมูแสดงก่อนหน้านี้จะมี 1.2 × 104, 104 × 5.4 และ
3.8 × 105 มลหน่วย PCR-1 ของ HEV, PCV2 หรืออนุภาค RV-ตามลำดับ.
หนึ่งหน่วย PCR ถูกกำหนดเป็นเจือจางสูงสุดที่ทดสอบบวก
ด้วยวิธี efficiencieswere กู้คืนคำนวณเป็นความแตกต่าง
ในค่าเฉลี่ยกะรัต (ΔCt) ค่าที่ได้จากสารสกัดจากกรดนิวคลีอิกของ 140 ไมโครลิตร
ผสมหมูคนเดียวและ 2 กรัม DT ถูกแทงด้วย 140 ไมโครลิตรผสมก่อนที่จะมีการรักษา PK.
เพื่อตรวจสอบผลของการรักษา PK บนกลับคืนไวรัส
ในระหว่างการสกัดกรดนิวคลีอิกค่ากะรัตที่ได้รับจากการตรวจหาไวรัส
ในหมูผสมโดยรวมและการยกเว้นจากการ PK ก่อนที่จะมีนิวคลีอิก
สกัดกรดถูกนำมาเปรียบเทียบ.
ผลการยับยั้งของสารสกัดจากหอยแมลงภู่ที่คำนวณได้เป็นความแตกต่าง
ในค่ากะรัตที่ได้รับจากการทดสอบ 1 ไมโครลิตร ของสารละลายสารสกัดคนเดียว
และถูกแทงด้วยเจือปนและ 10 เท่าเจือจางสารสกัดจากหอยแมลงภู่ (5 ไมโครลิตร).
การตรวจจับไวรัสได้ดำเนินการโดยเวลาจริง RT-PCR ใน
RotorGene Q (QIAGEN, ฮิลเดน, เยอรมนี) ใช้ RotorGene Q ชุด
ซอฟแวร์ 2.0.2 ตัวอย่างทั้งหมดถูก assayed ในรายการที่ซ้ำกันของเจือปนและ
10 เท่าเจือจางสารสกัดจากกรดนิวคลีอิก HEV ถูกตรวจพบโดยใช้การทดสอบ
โดย Breumet อัล (อั Breumet., 2010) ไพร applyingmodified และสอบสวน
เข้มข้น HEV2-R และ HEV2-P (500 เมตร) และ HEV-F (100 นาโนเมตร)
และเงื่อนไขปฏิกิริยา denaturation (15 วินาที), การอบ (15 วินาที) และการยืดตัว
(20 s) จากชุดเจือจาง 10 เท่าของพลาสมิดที่มี
ภูมิภาค HEV เป้าหมายการขยายประสิทธิภาพ 88% และความลาดเอียงของ
-3.64 ถูกคำนวณ RV-และ MC0 ตรวจพบโดยใช้อาร์เอ็นเอ
Ultrasense หนึ่งขั้นตอน qRT-PCR ระบบ (Invitrogen จำนวนแมว 11732-

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สกัดไวรัสกรดนิวคลีอิค frommussels เนื้อเยื่อทางเดินอาหาร ( DT ) กำหนด
ที่นี่เป็นการย่อยอาหาร ต่อมซึ่งล้อมรอบทั้งท้อง
และเป็นส่วนหนึ่งของลำไส้ ( กอสลิง , 2003 ) อย่างน้อย 10 สัตว์ที่มา
fromone หรือสองเพื่อนบ้านเก็บเกี่ยวพื้นที่ตัดและรวม
, ความท้อแท้ใจด้วยใบมีดโกน กรดนิวคลีอิกของไวรัสสกัดจาก
20 กรัมย่อยตัวอย่างของ DT ตามวิธีการรวมอยู่ในใหม่
พัฒนา ISO TS 15216 มาตรฐาน ( นิรนาม , 2013 ) , ยกเว้นว่า
ทั้งหมดปริมาณโฮโม DT ใช้สามมิลลิลิตรและบัฟเฟอร์การสลาย
140 μ L แม่เหล็กลูกปัดถูกประมวลผลตามที่อธิบายไว้โดย uhrbrand et al .

ไป ( 2010 ) ประเมินประสิทธิภาพการสกัดกรดนิวคลีอิกของไวรัสจาก
หอยเนื้อเยื่อประมาณ 104 จุลินทรีย์สร้างหน่วยของ mengovirus
( mc0 ) เข้ามาเป็นกระบวนการควบคุมภายในทุกส่วนของโฮโม
DT ก่อนโปร K ( 30 หน่วย / มิลลิกรัม finnzymes , ฟินแลนด์ )
รักษา ส่วนประสิทธิภาพการกู้คืนและยับยั้งในการปลูกและ rv-a
, pcv2 ใน DT หอย มีความตั้งใจใน
สองอิสระวิ่ง usingmussel DT มียืนยัน
ตัวอย่างลบและหมู ? แสดงก่อนหน้านี้มี 1.2 × 104 , 5.4 และ 3.8 ×× 104 105 หน่วยมิลลิลิตร
) − 1 ปลูก pcv2 , หรืออนุภาค rv-a ตามลำดับ
หนึ่งหน่วยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสที่กำหนดไว้สูงสุดที่เจือจางที่ผ่านการทดสอบบวก
โดยการทดสอบ การกู้คืน efficiencieswere คํานวณความแตกต่าง
ใน CT เฉลี่ย ( Δ CT ) ค่าที่ได้จากกรดนิวคลีอิก สารสกัดจาก 140 μ L
หมูกากคนเดียวและ DT 2 G C 140 μผมเสียก่อน PK รักษา .
เพื่อศึกษาผลของการรักษาใน PK เมื่อไวรัส
ระหว่างการสกัดกรดนิวคลีอิก , CT ค่าที่ได้จากการตรวจหาไวรัสในหมู น้ำ
โดยการรวมและการยกเว้น PK ก่อนการสกัดกรดนิวคลีอิก

เมื่อมี . ผลของสารสกัดจากหอยแมลงภู่มีค่าความแตกต่าง
เป็นค่าที่ได้จากการทดสอบใน CT 1 μลิตรน้ำและสารสกัดคนเดียว
C และสารสกัดจากหอยแมลงภู่เจือปนเจือจาง 10 เท่า ( 5 μ l )
การตรวจหาไวรัสกระทำโดยเวลาจริงนี้ใน rotorgene
Q ( QIAGEN Hilden , เยอรมนี ) ใช้ Q
ชุด rotorgene ซอฟต์แวร์ดาวน์โหลด . ตัวอย่างในรายการที่ซ้ำกันของเอนไซม์และสารเจือปน
10 เท่า ทั้งนี้ กรดนิวคลีอิก .ยานพาหนะไฟฟ้าไฮบริดที่ตรวจพบโดยใช้วิธี breumet
โดยอัล ( breumet al . , 2010 ) applyingmodified ไพรเมอร์และสอบสวน
ความเข้มข้นและ hev2-r hev2-p ( 500 nm ) และ hev-f ( 100 nm )
และเงื่อนไขปฏิกิริยา ( ( 15 ) การอบ ( 15 ) และการยืดตัว
( 20 วินาที ) จาก 10 เท่า ( ชุดของพลาสมิดที่มี
เป้าหมายปลูกภูมิภาค การขยายประสิทธิภาพของ 88% และความลาดชัน
− 364 ได้ rv-a mc0 และถูกตรวจพบใช้ RNA
ultrasense ขั้นตอนหนึ่งที่ข้าพเจ้า PCR System ( Invitrogen , แมวเลข 11732 -