3. Results3.1. siRNA and shRNA-medi

3. Results
3.1. siRNA and shRNA-mediated knockdown of hTERT expression in cancer
cells
Transient knockdown methods can reveal the silencing of target
gene and it also helps to understand the associated changes in immediate
early gene expression profile. To investigate the immediate early effects
of siRNA against hTERT, HeLa cells were transfected with 80 pmol
siRNA and harvested 72 h posttransfection. The sense and anti-sense sequences
of siRNA are shown in Fig. 1A. In parallel, equimolar concentrations
of siRNA against GAPDH and scrambled siRNA were used as
controls. Real Time PCR using hTERT specific primers showed 60% reduction
of hTERT transcript level in cells transfected with siRNA against
hTERT (Fig. 1B). HeLa cells transfected with hTERT siRNA showed no
morphological changes (Fig. 1C).
To further assess the potential of shRNA targeting different target
sites of hTERT, the duplex representing the shRNA along with miRNA
loop was constructed in pPRIME vector under a Tet regulated promoter
(Fig. 2A). Schematic representation of predicted RNA folds for simple
stem-loop and miR-30–based hTERT shRNA is shown in Fig. 2B. As reported
earlier, the miR30 loop can increase the processivity and knockdown
efficiency by presenting silencing RNAs in its natural format. In
addition, the transfected shRNA can be monitored with GFP expression
(Fig. 2C). HeLaTet-On cell lines were transfected with shRNA mirhTERT
constructwith Dox and 80% reduction in the hTERT levelswas observed
(Fig. 2D). The silencing efficiency of siRNA and shRNA was comparable
and the latter was used in subsequent experiments.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผลลัพธ์3.1. siRNA และ shRNA มีถอด hTERT ของมะเร็งเซลล์วิธีประกอบนำมาต่อแบบชั่วคราวสามารถแสดงการสมรของเป้าหมายยีนและยังช่วยให้เข้าใจการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องในทันทีต้นยีนนิพจน์โปรไฟล์ การตรวจสอบผลก่อนทันทีของ siRNA กับ hTERT เซลล์ HeLa ถูก transfected กับ 80 pmolsiRNA และ h 72 หวง posttransfection ลำดับที่ความรู้สึกและความรู้สึกต่อต้านของ siRNA จะแสดงในรูป 1A ในความเข้มข้นขนาน equimolarsiRNA กับ GAPDH และ siRNA สัญญาณรบกวนใช้เป็นการควบคุม เวลาจริง PCR โดยใช้ไพรเมอร์เฉพาะ hTERT ว่าลด 60%ของ hTERT ระดับเสียงบรรยายในเซลล์ transfected กับ siRNA กับhTERT (รูปที่ 1B) เซลล์ HeLa transfected กับ hTERT siRNA ไม่แสดงให้เห็นเปลี่ยนแปลงสัณฐาน (รูปที่ 1C)เพื่อประเมินศักยภาพของ shRNA กำหนดเป้าหมายต่าง ๆเว็บไซต์ของ hTERT เพล็กซ์แทน shRNA พร้อมเที่ยววนสร้างเวกเตอร์ pPRIME ภายใต้ผู้ควบคุมเกี่ยวกับการ(รูป 2A) คาดการณ์ RNA เท่าสำหรับการผังวนรอบลำต้นและมีร์ 30 – ตาม hTERT shRNA จะแสดงในรูป 2B ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ วง miR30 จะเพิ่ม processivity และถอดประสิทธิภาพ โดยนำสมร RNAs ในรูปแบบธรรมชาติ ในนอกจากนี้ transfected shRNA สามารถตรวจสอบได้ด้วย GFP(รูปที่ 2C) บรรทัด HeLaTet บนเซลล์มี transfected กับ shRNA mirhTERTconstructwith ลด Dox และ 80% ใน levelswas hTERT ที่สังเกต(รูปที่ 2D) ประสิทธิภาพของ siRNA และ shRNA เงียบได้เปรียบและหลังใช้ในการทดลอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. ผลการทดลอง
3.1 siRNA และล้มลงในการแสดงออก hTERT shRNA สื่อกลางในการรักษามะเร็ง
เซลล์
วิธีการล้มลงชั่วคราวสามารถที่จะเปิดเผยสมรของเป้าหมาย
ของยีนและนอกจากนี้ยังช่วยให้เข้าใจการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องในทันที
ยีนต้นรายละเอียดการแสดงออก เพื่อศึกษาผลกระทบในช่วงต้นทันที
ของ siRNA กับ hTERT เซลล์ HeLa ถูก transfected 80 pmol
siRNA และเก็บเกี่ยว 72 ชั่วโมง posttransfection ความรู้สึกและต่อต้านความรู้สึกลำดับ
ของ siRNA จะแสดงในรูป 1A ในแบบคู่ขนานความเข้มข้น equimolar
ของ siRNA กับ GAPDH และมีสัญญาณรบกวน siRNA ถูกนำมาใช้เป็น
ตัวควบคุม จริง PCR เวลาโดยใช้ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจง hTERT แสดงให้เห็นว่าการลดลง 60%
จากระดับหลักฐาน hTERT ในเซลล์ transfected กับ siRNA กับ
hTERT (รูปที่ 1B.) เซลล์ HeLa transfected กับ hTERT siRNA พบว่าไม่มี
การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา (รูปที่ 1C.).
เพื่อเพิ่มเติมการประเมินศักยภาพของ shRNA กำหนดเป้าหมายเป้าหมายที่แตกต่างกัน
เว็บไซต์ของ hTERT เพล็กซ์เป็นตัวแทนของ shRNA พร้อมกับ miRNA
ห่วงถูกสร้างขึ้นใน pPRIME เวกเตอร์ภายใต้การก่อการควบคุมเทต
( รูป. 2A) แผนผังแสดงของอาร์เอ็นเอที่คาดการณ์ไว้สำหรับพับง่าย
ลำต้นวงและ miR-30-based hTERT shRNA แสดงในรูป 2B ตามที่ได้รายงาน
ก่อนหน้านี้วง miR30 สามารถเพิ่ม processivity และล้มลง
อย่างมีประสิทธิภาพโดยนำเสนอ RNAs silencing ในรูปแบบตามธรรมชาติของมัน ใน
นอกจากนี้ shRNA transfected สามารถตรวจสอบได้มีการแสดงออก GFP
(รูป. 2C) HeLaTet-On เซลล์ถูก transfected กับ shRNA mirhTERT
constructwith Dox และการลดลง 80% ใน hTERT levelswas สังเกต
(รูป. 2D) ประสิทธิภาพของสมร siRNA และ shRNA เทียบเคียง
และหลังถูกใช้ในการทดลองที่ตามมา