Purification of rErAIIThe ion-excha

Purification of rErAII

The ion-exchange liquid chromatography purification protocol was performed using an ÄKTA System (GE Healthcare, United Kingdom) at 4 ºC. The purification assay employed was performed as described by others (Krasotkina et al., 2004; Wink et al., 2010) with minor modifications. The aliquots stored from the bioreactor cultivation were resuspended in 20 mM potassium phosphate buffer pH 5.5 (buffer A) (1 g cells 10 mL-1 buffer) and were disrupted with a modified French press (Constant Systems, England) at 30 kpsi. The cell lysate was centrifuged at 38900 x g for 30 min at 4 ºC. The supernatant was incubated for 30 min with 1% (w/v) streptomycin sulfate at 4 ºC under gentle agitation and was centrifuged at 38900 x g for 30 min. The resulting supernatant was dialyzed twice against 2 L of buffer A. Dialysis samples were clarified by centrifugation (38900 x g, 30 min, 4 ºC), and the supernatants were loaded onto a HiPrep 16/10 SP XL cation exchange chromatography column (GE Healthcare, United Kingdom) previously equilibrated with buffer A. The flow rate was 1 mL min-1. Non-adsorbed proteins were washed out with 5 column volumes (CVs) of buffer A, while the adsorbed proteins were eluted with a 20 CV linear pH gradient, 5.5 to 8.5, of 20 mM potassium phosphate buffer. The eluted fractions containing recombinant rErAII enzyme were pooled and were stored at -20 ºC. Fractions were analyzed by SDS-PAGE stained with Coomassie Brilliant Blue.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทำให้บริสุทธิ์ของ rErAIIแลกเปลี่ยนไอออนของเหลว chromatography ฟอกโพรโทคอลดำเนินการใช้ระบบ ÄKTA (GE สุขภาพ สหราชอาณาจักร) ที่ 4 ºC ทดสอบฟอกที่ว่าจ้างดำเนินการตามที่อธิบายไว้ โดยผู้อื่น (Krasotkina et al. 2004 กระพริบ et al. 2010) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย Aliquots เก็บไว้จากการเพาะปลูก bioreactor ถูก resuspended ใน 20 มม.โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 5.5 (บัฟเฟอร์ A) (1 g เซลล์บัฟเฟอร์ mL 1 10) และถูกหยุดชะงัก ด้วยการกดฝรั่งเศสแก้ไข (ระบบคง อังกฤษ) ใน 30 kpsi เซลล์ lysate ของถูกจากที่ 38900 x g 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ของ supernatant incubated 30 นาทีกับซัลเฟต streptomycin 1% (w/v) ที่ 4 องศาเซลเซียสภายใต้ความปั่นป่วนที่อ่อนโยน และเป็นผลิตภัณฑ์ที่ 38900 x g 30 นาที Supernatant ผลลัพธ์ถูก dialyzed สองเท่ากับ 2 ลิตรของบัฟเฟอร์ตัวอย่าง A. ไตได้ชี้แจง โดยการหมุนเหวี่ยง (38900 x g, 30 นาที 4 ºC), และ supernatants ถูกโหลดลงบน HiPrep 16/10 SP XL แลกเปลี่ยน chromatography คอลัมน์ (GE สุขภาพ สหราชอาณาจักร) ก่อนหน้านี้ equilibrated กับบัฟเฟอร์ a อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร 1 นาทีได้ ซับไม่ใช่โปรตีนถูกล้างออก ด้วย 5 คอลัมน์ปริมาณ (CVs) บัฟเฟอร์ A ในขณะที่โปรตีน adsorbed ถูก eluted กับ 20 CV pH เชิงเส้นไล่ระดับสี 5.5 ถึง 8.5, 20 มม.โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ เศษส่วน eluted ที่ประกอบด้วยเอนไซม์ recombinant rErAII ถูกพู และถูกเก็บไว้ที่-20 ºC เศษส่วนถูกวิเคราะห์ โดย SDS-หน้าย้อม ด้วย Coomassie Blue สดใส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทำให้บริสุทธิ์ของ rErAII

ไอออนแลกเปลี่ยนของเหลวโปรโตคอลโครมาทำให้บริสุทธิ์ได้ดำเนินการโดยใช้ระบบ Akta (GE Healthcare, สหราชอาณาจักร) วันที่ 4 องศาเซลเซียส การทดสอบการทำให้บริสุทธิ์การจ้างงานที่ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยคนอื่น (Krasotkina et al, 2004;. ขยิบตา et al, 2010.) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย aliquots ที่จัดเก็บจากการเพาะปลูกเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพถูก resuspended ใน 20 มิลลิเมตรโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 5.5 (บัฟเฟอร์) (1 เซลล์ G 10 ML-1 กันชน) และกระจัดกระจายกับการแก้ไขกดฝรั่งเศส (ระบบคงที่อังกฤษ) วันที่ 30 KPSI lysate เซลล์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 38,900 XG 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ใสถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีกับ 1% (w / v) streptomycin ซัลเฟตที่ 4 องศาเซลเซียสภายใต้การกวนอ่อนโยนและถูกหมุนเหวี่ยงที่ 38,900 XG เป็นเวลา 30 นาที ใสส่งผลให้ได้รับการ dialyzed สองครั้งกับ 2 ลิตรของตัวอย่างไตบัฟเฟอร์ A. ถูกชี้แจงโดยการหมุนเหวี่ยง (38,900 XG, 30 นาที, 4 องศาเซลเซียส) และ supernatants ถูกโหลดลงบน HiPrep 16/10 SP XL คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนโครมาโต (GE Healthcare สหราชอาณาจักร) equilibrated ก่อนหน้านี้กับบัฟเฟอร์ A. อัตราการไหล 1 มลนาที 1 โปรตีนที่ไม่ใช่การดูดซับถูกล้างออกด้วย 5 เล่มคอลัมน์ (CV) ของบัฟเฟอร์ในขณะที่โปรตีนการดูดซับที่ถูกชะด้วย 20 CV ลาดเชิงเส้นค่า pH 5.5-8.5 ของ 20 มิลลิเมตรบัฟเฟอร์โพแทสเซียมฟอสเฟต เศษส่วนชะมีเอนไซม์ rErAII recombinant ถูกรวบรวมและเก็บรักษาที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส เศษส่วนถูกนำมาวิเคราะห์โดยวิธี SDS-PAGE ย้อมด้วย Coomassie สีฟ้าสดใส

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การ reraiiการแลกเปลี่ยนไอออนโครมาโทกราฟีของเหลวบริสุทธิ์การใช้โปรโตคอล IKEA ได้รับระบบ ( GE สุขภาพ , สหราชอาณาจักร ) ที่ 4 º C ใช้บำบัดน้ำเสีย โดยมีการอธิบายโดยคนอื่น ๆ ( krasotkina et al . , 2004 ; ขยิบตา et al . , 2010 ) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ที่จัดเก็บจากการเพาะปลูกเป็นแบบเฉยๆ resuspended 20 มม. โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 5.5 ( บัฟเฟอร์ ) ( 1 กรัมเซลล์ 10 แน่นอน buffer ) และติดขัดกับการแก้ไขแบบฝรั่งเศส ( ระบบอังกฤษคงที่ ) ที่ 30 kpsi . เซลล์ lysate คือระดับที่ 38900 x G สำหรับ 30 นาทีที่ 4 º C สูงถูกบ่ม 30 นาทีด้วย 1% ( w / v ) สเตรปโตมัยซินซัลเฟตที่ 4 ºภายใต้อุณหภูมิและระดับที่อ่อนโยนมาก 38900 x g เป็นเวลา 30 นาที ผลคือ นำผ่านสองครั้งกับ 2 ลิตร กันชนล้างตัวอย่าง . มีการชี้แจงโดยการเหวี่ยงแยก ( 38900 x G , 30 นาที , 4 º C ) และ supernatants ถูกโหลดลงบน hiprep 16 / 10 SP chromatography คอลัมน์ XL แลกเปลี่ยนประจุ ( GE Healthcare , สหราชอาณาจักร ) ก่อนหน้านี้ equilibrated บัฟเฟอร์ . อัตราการไหลเท่ากับ 1 มล. min-1 . ไม่ดูดซับโปรตีนถูกล้างออกด้วย 5 เล่ม คอลัมน์ ( CVS ) ของบัฟเฟอร์ , ในขณะที่ดูดซับโปรตีนเป็นตัวอย่างกับ 20 พันธุ์ อ เส้นไล่ระดับสี 5.5 ถึง 8.5 , 20 มม. โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ มีตัวอย่างเศษส่วนที่มีรีคอมบิแนนท์ reraii เอนไซม์ถูก pooled และเก็บไว้ที่ - 20 องศาเซลเซียส ºวิเคราะห์โดย SDS-PAGE และย้อมด้วยเหล่านี้น่าจะเป็นสดใสสีฟ้า