After 2–3 weeks, plantlets with a f

After 2–3 weeks, plantlets with a fully developed root system were transplanted to 10 cm × 15 cm pots with a 3:1 (v:v) ratio of peat:perlite in a 20–23 °C glasshouse with about 80% relative humidity (Beijing Forestry University, Beijing, China). Survival rates were recorded two weeks after transplantation.

2.6. Determination of ploidy level

Visible morphological differences were observed among regenerated plants, and ploidy level of each plantlet was analyzed using flow cytometry and chromosome counting.

2.6.1. Flow cytometry

Leaf fragments from in vitro-grown plants derived from the anther cultures were chopped with a razor blade in Lysis buffer (15 mmol/l Tris, 2 mmol/l Na2EDTA, 0.5 mmol/l spermine, 80 mmol/l KCl, 20 mmol/l NaCl, and 0.1% (v/v) Triton X-100; pH 7.5) to release the nuclei. The entire sample was filtered through a 25 μm nylon mesh and stained with 2 μl DAPI. Analysis of nuclei was conducted using a Partec CA II flow cytometer (Partec GmbH, Germany). Tissue from a diploid plant of P. forbesii was used as an internal standard. The ploidy level of each tested plant was determined based on a comparison between the fluorescence peak value of the tested plants with that of the diploid control.

2.6.2. Cytological analysis

Actively growing root tips (5–8) approximately 2 mm in length were excised, treated with 0.002 N 8-hydroxyquinoline solution for 2–3 h in the darkness, then washed three times with distilled water. Washed root tips were fixed in Carnoy's solution 1:3 (v/v) acetic acid: ethanol for 24 h at 4 °C, then washed again. Fixed root tips were hydrolyzed in 1 N HCl for 10 min at 60 °C. After hydrolysis, root tips were rinsed with distilled water three times, placed on a glass slide, and stained with a drop of Carbol fuchsin solution for 2–3 min. Finally, stained root tips were squashed under a cover glass and photographed under a 100× objective lens using a microscope (Olympus BX51, Japan) equipped with a camera (ProgRes C5, JENOPTIK, Germany).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หลังจาก 2-3 สัปดาห์ plantlets ด้วยระบบรากพัฒนาเต็มที่ transplanted กับหม้อ 10 cm × 15 cm มีอัตราส่วนเป็น 3:1 (v: v) พรุ: perlite ในเรือนกระจกสำหรับปลูกต้นไม้ 20 – 23 ° C ประมาณ 80% ความชื้นสัมพัทธ์ (มหาวิทยาลัยวนศาสตร์ปักกิ่ง ปักกิ่ง จีน) อัตราอยู่รอดได้รับการบันทึกสองสัปดาห์หลังปลูก2.6 การกำหนดระดับพล็อยดีมองเห็นความแตกต่างของสุภัคระหว่างพืชสร้าง และระดับพล็อยดีละ plantlet ถูกวิเคราะห์โดยใช้เซลล์ไหลและตรวจนับโครโมโซม2.6.1 การกระแสเซลล์ชิ้นส่วนใบจากในเครื่องปลูกพืชมาจากวัฒนธรรม anther ถูกสับ ด้วยใบมีดโกนในบัฟเฟอร์ Lysis (15 mmol/l ตรี 2 mmol/l Na2EDTA สเปอร์มีน 0.5 mmol/l, 80 mmol/l KCl, 20 mmol/l NaCl และ 0.1% (v/v) ไตรตั้น X-100; pH 7.5) การปลดปล่อยแอลฟา ตัวอย่างทั้งหมดกรองผ่านตาข่ายไนล่อน 25 μm และสีกับ 2 μl DAPI วิเคราะห์ของแอลฟาได้ดำเนินการใช้ cytometer การไหล Partec CA II (Partec GmbH เยอรมนี) เนื้อเยื่อจากพืช diploid ของ P. forbesii ถูกใช้เป็นการภายใน พล็อยดีระดับของแต่ละโรงงานผ่านการทดสอบถูกกำหนดตามการเปรียบเทียบระหว่างค่าสูงสุด fluorescence ของพืชทดสอบที่ควบคุม diploid2.6.2. วิเคราะห์ cytologicalกำลังเติบโตรากคำแนะนำ (5-8) ความยาวประมาณ 2 มม.มี excised รับแก้ปัญหา N 8-hydroxyquinoline 0.002 สำหรับ h 2-3 ในความมืด นั้นล้าง 3 ครั้ง ด้วยน้ำกลั่น เคล็ดลับหินรากได้ถาวรในโซลูชันของ Carnoy 1:3 (v/v) กรดอะซิติก: เอทานอลใน 24 ชมที่ 4 ° C จากนั้นล้างอีกครั้ง เคล็ดลับรากถาวรถูก hydrolyzed ใน 1 N HCl สำหรับ 10 นาทีที่ 60 องศาเซลเซียส หลังจากไฮโตรไลซ์ คำแนะนำรากได้ rinsed กลั่นน้ำสามครั้ง วางบนสไลด์แก้ว และสีกับหยด Carbol fuchsin โซลูชันสำหรับ 2 – 3 นาที สุดท้าย เคล็ดลับรากทิ้งคราบได้ squashed ภายใต้ฝาครอบแก้ว และถ่ายภาพภายใต้เลนส์วัตถุประสงค์ 100 ×ใช้กล้องจุลทรรศน์ (Olympus BX51 ญี่ปุ่น) พร้อมกล้อง (ProgRes C5, JENOPTIK เยอรมนี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

หลังจาก 2-3 สัปดาห์ต้นกล้าที่มีระบบรากที่ได้รับการพัฒนาอย่างเต็มที่ย้ายไป 10 ซม. × 15 ซม. หม้อกับ 3: 1 (V: V) อัตราส่วนของพีท: perlite ในวันที่ 20-23 ° C เรือนกระจกที่มีประมาณ 80% เมื่อเทียบ ความชื้น (มหาวิทยาลัยปักกิ่งป่าไม้, ปักกิ่ง, จีน) อัตราการรอดชีวิตที่ถูกบันทึกไว้สองสัปดาห์หลังจากการปลูกถ่าย. 2.6 การกำหนดระดับ ploidy ความแตกต่างทางสัณฐานวิทยาที่มองเห็นได้ถูกตั้งข้อสังเกตในหมู่พืช Regenerated และระดับ ploidy ต้นของแต่ละคนถูกวิเคราะห์โดยใช้ cytometry ไหลและการนับโครโมโซม. 2.6.1 โฟเศษใบจากพืชในหลอดทดลองปลูกมาจากวัฒนธรรมดอกไม้ถูกสับด้วยใบมีดโกนในการสลายบัฟเฟอร์ (15 มิลลิโมล / ลิตร Tris 2 มิลลิโมล / ลิตร Na2EDTA, 0.5 มิลลิโมล / ลิตรเปอร์ 80 มิลลิโมล / ลิตร KCl 20 มิลลิโมล / ลิตรโซเดียมคลอไรด์และ 0.1% (v / v) Triton X-100; pH 7.5) ที่จะปล่อยนิวเคลียส กลุ่มตัวอย่างทั้งหมดถูกกรองผ่านตาข่ายไนลอน 25 ไมครอนและย้อมด้วยสี 2 ไมโครลิตร DAPI การวิเคราะห์นิวเคลียสได้ดำเนินการโดยใช้ CA พาร์เท็คครั้งที่สองไหล cytometer (พาร์เท็ GmbH ประเทศเยอรมนี) จากเนื้อเยื่อพืชซ้ำพี forbesii ถูกใช้เป็นมาตรฐานภายใน ระดับ ploidy ของแต่ละโรงงานที่ผ่านการทดสอบได้รับการพิจารณาจากการเปรียบเทียบระหว่างค่าสูงสุดเรืองแสงของพืชทดสอบกับที่ของการควบคุมซ้ำ. 2.6.2 การวิเคราะห์เซลล์แข็งขันการเจริญเติบโตของปลายราก (5-8) ประมาณ 2 มิลลิเมตรยาวถูกตัด, การรักษาด้วยวิธีการแก้ปัญหา 0.002 ไม่มี 8 จากสาร 2-3 ชั่วโมงในความมืดแล้วสามครั้งล้างด้วยน้ำกลั่น ปลายรากล้างได้รับการแก้ไขในการแก้ปัญหาของ Carnoy 1: 3 (v / v) กรดอะซิติก: เอทานอลเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 4 ° C แล้วล้างอีกครั้ง ปลายรากคงถูกไฮโดรไลซ์ใน 1 N HCl เป็นเวลา 10 นาทีที่ 60 องศาเซลเซียส หลังจากการย่อยสลายและเคล็ดลับรากล้างด้วยน้ำกลั่นสามครั้งที่วางอยู่บนสไลด์แก้วและย้อมด้วยสีลดลงของการแก้ปัญหา Carbol ฟุ 2-3 นาที สุดท้ายปลายรากสีถูกแบนภายใต้ฝาครอบแก้วและถ่ายภาพภายใต้ 100 ×เลนส์ใกล้วัตถุโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ (โอลิมปั BX51 ญี่ปุ่น) พร้อมกับกล้อง (Progres C5, JENOPTIK, เยอรมนี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หลังจาก 2 - 3 สัปดาห์ ต้นกับการพัฒนาอย่างเต็มที่ระบบรากถูกย้ายไป 10 cm × 15 ซม. หม้อ กับ 3 : 1 ( V : V ) อัตราส่วนของพีท : เพอร์ไลต์ใน 20 – 23 ° C ) มีประมาณ 80 % ความชื้นสัมพัทธ์ ( มหาวิทยาลัยการป่าไม้กรุงปักกิ่งปักกิ่ง , จีน ) อัตราการรอดชีวิตที่ถูกบันทึกไว้สองสัปดาห์หลังจากการปลูก

2.6

การกำหนดระดับมองเห็นความแตกต่างของลักษณะทางสัณฐานวิทยาพบว่าต้นข้าว และการปลูกในระดับ วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้การนับโครโมโซมและการดูแล ( .

. การไหล (

ใบแตกจากการเพาะปลูกพืชที่ได้มาจากอับละอองเกสรวัฒนธรรมถูกสับด้วยมีดในการสลายบัฟเฟอร์ ( 15 mmol / L หรือ 2 mmol / L na2edta 0.5 มิลลิโมล / ลิตร spermine KCl 80 มิลลิโมล / ลิตร20 mmol / L NaCl 0.1 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) Triton X-100 ; พีเอช 7.5 ) ปลดปล่อยนิวเคลียส . ตัวอย่างทั้งหมดถูกกรองผ่าน 25 μเมตรตาข่ายไนลอนและย้อมด้วย 2 μผม dapi . การวิเคราะห์ของการทดลองใช้พาร์เท็ค CA การใช้โมโน II ( พาร์เท็ค GmbH , Germany ) เนื้อเยื่อจากพืชซ้ำของหน้า forbesii ถูกใช้เป็นมาตรฐานภายในในการตรวจสอบระดับของแต่ละโรงงาน คือ พิจารณาจากการเปรียบเทียบระหว่างการยอดค่าของพืชทดสอบกับของการควบคุมการเกิด

ดาวน์โหลด . สามารถวิเคราะห์

อย่างการปลูกรากเคล็ดลับ ( 5 – 8 ) ประมาณ 2 มม. ความยาวถูกตัดรับกับ 0.002 N ซึ่งโซลูชั่น 2 – 3 ชั่วโมง ความมืดก็ล้าง 3 ครั้งด้วยน้ำกลั่นล้างราก เคล็ดลับคือการแก้ไขใน carnoy สารละลาย 1 : 3 ( v / v ) กรดอะซิติก : เอทานอลเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 4 ° C แล้วล้างอีกครั้ง เคล็ดลับซ่อมรากผ่านการย่อยใน 1 N HCl เป็นเวลา 10 นาทีที่ 60 องศา หลังจากการย่อย รากเคล็ดลับถูกล้างด้วยน้ำกลั่น 3 ครั้ง วางไว้บนสไลด์แก้ว และเปรอะเปื้อนไปด้วยหยดของสารละลาย carbol เท่า 2 – 3 นาทีในที่สุดเคล็ดลับถูกทับอยู่ใต้รากติดฝาครอบกระจกและถ่ายภาพภายใต้ 100 ×เลนส์วัตถุประสงค์การใช้กล้องจุลทรรศน์ ( Olympus bx51 , ญี่ปุ่น ) พร้อมกล้อง ( โปรเกรส C5 , jenoptik , เยอรมัน )