2.4. Sensitivity of the inhibitory

2.4. Sensitivity of the inhibitory substance to proteolytic enzymes
The effect of proteolytic enzymes on the antimicrobial activity of the CFS, prepared as described above in Section 2.3, was tested according to Van Reenen, Dicks, and Chikindas (1998). One milliliter of the CFS was mixed with pepsin (1 mg/mL) or protease (1 mg/mL) and incubated at 37 °C for 30 min. The enzymes were purchased from Sigma, New York, USA. The enzymatic reactions were stopped by heating at 100 °C for 3 min and the antimicrobial activity was assessed by the spot-on-the-lawn test.

2.5. Effect of pH, temperature and chemical agents on the antimicrobial activity
The effect of pH on the antimicrobial activity of the CFS was tested adjusting the pH of aliquots (5 mL) of the CFS from 2.0 up to 12.0 (with increments of one pH unit) with 1 M NaOH or 1 M HCl (Synth, Diadema, Brazil). After incubation at 25 °C for 30 min, the pH was readjusted to 7.0. The effect of temperature on the antimicrobial activity of the CFS was tested heating aliquots of 1 mL of CFS at 60 °C, 80 °C and 100 °C for 30 min, 60 min and 120 min. The effect of sodium dodecyl sulfate (SDS) (BioAgency, Sao Paulo, Brazil), ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) (Invitrogen, Carlsbad, USA), tween 80 (Synth, Diadema, Brazil) and urea (Synth, Diadema, Brazil) on the antimicrobial activity was tested by adding 1% (w/v) of these substances to the CFS. For all tests the antimicrobial activity was determined by the spot-on-the-lawn test, using L. sakei ATCC 15521 as indicator microorganism. In all experiments, the bacteriocin-producing strain L. sakei subsp. sakei 2a was used as positive control ( De Martinis & Franco, 1998).

2.6. Spectrum of antibacterial activity
Two isolates (69 and 94) that produced antimicrobial substances sensitive to the proteolytic enzymes and not affected by pH, heat and chemical agents, were considered bacteriocin producers and thus tested for antimicrobial activity against the target strains listed in Table 2. In addition to the halophilic and halotolerant bacteria isolated from charqui, these strains included reference strains (ATCC and others) and food isolates belonging to the culture collection at Food Microbiology Laboratory of University of Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil. The activity was evaluated using the spot-on-the-lawn test. A target microorganism was considered sensitive to the bacteriocin producer strain when the diameter of the growth inhibition zone was at least 5 mm. The growth conditions of each tested microorganism are shown in Table 2.
Table 2.
Spectrum of activity of isolates 69 and 94, obtained from charqui.
Number of tested strains sensitive to the bacteriocin/total number of tested strains.
2.7. Mode of action
For the determination of the mode of action of the antimicrobial compounds, 20 mL of filter sterilized (0.22 μm, Millipore, USA) CFS was added to a culture (100 mL) of L. monocytogenes ScottA in Brain Heart Infusion (BHI) broth (Oxoid, Basingstoke, UK) in early (3 h) exponential phase and the optical density (600 nm) and number of viable cells were measured every hour up to 10 h ( Todorov & Dicks, 2005). The numbers of CFU/mL of L. monocytogenes ScottA in the mixture were determined by plating on TSA supplemented with 0.6% (w/v) yeast extract (Oxoid, Basingstoke, UK).
The adsorption of the bacteriocin produced by isolate 69 to L. monocytogenes ScottA, L. monocytogenes 620 4b (University of Sao Paulo culture collection), L. monocytogenes 637 1/2c (University of Sao Paulo culture collection), L. sakei ATCC 15521 and Enterococcus faecium ATCC 19443 was measured according to Todorov (2008). The target microorganisms were grown overnight in BHI broth at 37 °C and then centrifuged (8000 ×g, 15 min, 4 °C). Cells were washed twice with sterile 5 mM phosphate buffer (pH 6.5) and re-suspended in the same buffer to OD at 600 nm equal to 1.0. The pH was adjusted to 6.5 with sterile 0.1 M NaOH. One milliliter of each cell suspension was mixed with 1 mL of CFS and incubated at 37 °C for 1 h. After removal of cells (8000 ×g, 15 min, 25 °C), the activity of unbound bacteriocin in the supernatant was determined by the critical dilution method. The adsorbed bacteriocins were determined as:
AU/mL0 and AU/mL1 refer to the bacteriocin activity before and after treatment, respectively.

In addition, the influence of temperature (4 °C, 25 °C, 30 °C and 37 °C), pH (4.0, 6.0, 8.0 and 10.0) and presence of 1% (w/v) of NaCl, tween 20, tween 80, glycerol and SDS on the adsorption of the bacteriocin produced by isolate 69 to L. monocytogenes ScottA was determined according to Todorov (2008).
2.8. Growth and survival in media containing different concentrations of NaCl
To investigate the capability of isolate 69 to grow in the presence of NaCl, the microorganism was inoculated (105 CFU/mL) in 100 mL of MRS broth containing increasing concentrations of NaCl (0%, 3%, 5%, 10%, 15% and 20% w/v) and incubated at 30 °C up to 72 h. The growth in MRS broth containing 0%, 3% and 5% NaCl was monitored by enumeration of viable cells performed every 2 h up to 12 h, and then every 12 h up 72 h. In MRS broth containing 10%, 15% and 20% NaCl, the growth was monitored at 24 h, 30 h, 36 h, 48 h, 60 h and 72 h of incubation. MRS agar was used for the determination of number of CFU/mL in each culture.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. ความไวของสารลิปกลอสไขให้เอนไซม์ proteolytic
ผลของเอนไซม์ proteolytic กิจกรรมจุลินทรีย์ของ CFS เตรียมตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในหัวข้อ 2.3 ทดสอบตามแวน Reenen, Dicks และ Chikindas (1998) หนึ่ง milliliter ของ CFS ที่ผสมกับเพพซิน (1 mg/mL) หรือรติเอส (1 mg/mL) และ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ 30 นาที เอนไซม์ถูกซื้อจากซิก นิวยอร์ก สหรัฐอเมริกา มีหยุดปฏิกิริยาเอนไซม์ในระบบ โดยความร้อนที่ 100 ° C ใน 3 นาที และกิจกรรมจุลินทรีย์ถูกประเมิน โดย test. spot-on--บริเวณสนามหญ้า

2.5 ผลของ pH อุณหภูมิ และสารเคมีกิจกรรมจุลินทรีย์
ผลของกิจกรรมการต้านจุลชีพของ CFS ถูกทดสอบปรับ pH ของ aliquots (5 mL) ของ CFS จาก 2.0 ถึง 12.0 (พร้อมด้วยการเพิ่มค่า pH หนึ่งหน่วย) 1 M NaOH หรือ 1 M HCl (Synth, Diadema บราซิล) หลังจากบ่มที่ 25 ° C สำหรับ 30 นาที pH ถูก readjusted กับ 7.0 ผลของอุณหภูมิกิจกรรมจุลินทรีย์ของ CFS ถูกทดสอบความร้อน aliquots ของ mL 1 ของ CFS ที่ 60 ° C, 80 ° C และ 100 ° C สำหรับ 30 นาที 60 นาทีและ 120 นาที ผลของโซเดียม dodecyl ซัลเฟต (SDS) (BioAgency เซาเปาโล บราซิล), ethylenediamine tetraacetic กรด (EDTA) (Invitrogen คาร์ลส สหรัฐอเมริกา), tween 80 (Synth, Diadema บราซิล) และยูเรีย (Synth, Diadema บราซิล) กิจกรรมจุลินทรีย์ได้รับการทดสอบ โดยการเพิ่ม 1% (w/v) ของสารเหล่านี้เข้าแบบ CFS สำหรับการทดสอบทั้งหมด กิจกรรมจุลินทรีย์ที่ถูกกำหนด โดยการทดสอบ spot-on--บริเวณสนามหญ้า sakei L. ATCC 15521 โดยใช้จุลินทรีย์บ่งชี้ ในการทดลองทั้งหมด bacteriocin ผลิตพันธุ์ L. sakei ถั่ว sakei 2a ถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวก (&เดอมาร์ตินี่ฝรั่งเศส 1998)

2.6 สเปกตรัมของกิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรีย
สองแยก (69 และ 94) ที่ผลิตเอนไซม์ proteolytic ความไวต่อสารต้านจุลชีพ และไม่ได้รับผลกระทบ โดยค่า pH ความร้อน และสารเคมีตัว แทน bacteriocin ผู้ผลิตพิจารณา และทดสอบกิจกรรมจุลินทรีย์กับสายพันธุ์เป้าหมายที่ระบุไว้ในตารางที่ 2 ดัง นั้น นอกจากแบคทีเรียชอบเกลือและทนเกลือเพื่อใช้ที่แยกต่างหากจาก charqui สายพันธุ์เหล่านี้รวมสายพันธุ์อ้างอิง (ATCC และอื่น ๆ) และอาหารแยกเป็นชุดวัฒนธรรมที่อาหารจุลชีววิทยาปฏิบัติการของมหาวิทยาลัยของเปา เปา บราซิล กิจกรรมที่ถูกประเมินโดยใช้การทดสอบ spot-on--บริเวณสนามหญ้า จุลินทรีย์เป้าหมายถือว่าสำคัญโหมโปรดิวเซอร์ bacteriocin เมื่อเส้นผ่าศูนย์กลางของโซนยับยั้งการเจริญเติบโต อย่างน้อย 5 มม. สภาพการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ที่ผ่านการทดสอบแต่ละแสดงในตารางที่ 2.
ตาราง 2.
รับสเปกตรัมของการแยก 69 และ 94 จาก charqui.
จำนวนสายพันธุ์ที่ผ่านการทดสอบความไวต่อ bacteriocin/รวม จำนวนทดสอบสายพันธุ์
2.7 โหมดของการดำเนินการ
สำหรับการกำหนดวิธีการดำเนินการของสารต้านจุลชีพ 20 mL กรอง sterilized (0.22 μm มาก สหรัฐอเมริกา) เพิ่ม CFS วัฒนธรรม (100 mL) ของ L. monocytogenes ในสมองหัวใจคอนกรีต (BHI) ซุป (Oxoid, Basingstoke, ScottA UK) ในช่วงต้น (3 h) เนนระยะและความหนาแน่นออปติคอล (600 nm) และจำนวนของเซลล์ทำงานได้ที่วัดทุกชั่วโมงจนถึง 10 h (Todorov & Dicks, 2005) จำนวน CFU/mL ของ L. monocytogenes ScottA ส่วนผสมถูกกำหนด โดยชุบบน TSA เสริม ด้วย 0.6% (w/v) ยีสต์สกัด (Oxoid, Basingstoke, UK) .
ของ bacteriocin ผลิตโดยแยก 69 ไป l monocytogenes ScottA, L. monocytogenes 620 4b (มหาวิทยาลัยเซาเปาโลชุดวัฒนธรรม), L. monocytogenes 637 1 / 2c (มหาวิทยาลัยเซาเปาโลชุดวัฒนธรรม), sakei L. ATCC 15521 และ Enterococcus faecium ATCC 19443 ถูกวัดตาม Todorov (2008) จุลินทรีย์เป้าหมายถูกปลูกค้างคืนใน BHI ซุปที่ 37 ° C และ centrifuged แล้ว (ซื้อ 8000 g, 15 นาที 4 ° C) เซลล์ถูกล้างสองครั้งกับ 5 มม.ใส่ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6.5) และชั่วคราวอีกครั้งในบัฟเฟอร์เดียวไป OD ที่ 600 นาโนเมตรเท่ากับ 1.0 ถูกปรับ pH 6.5 กับกอซ 0.1 M NaOH Milliliter หนึ่งรัฐแต่ละเซลล์มี 1 mL ของ CFS และ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ 1 h หลังจากเอาของเซลล์ (8000 ซื้อ g, 15 นาที 25 ° C), การผูก bacteriocin ใน supernatant ถูกกำหนด โดยวิธีเจือจางที่สำคัญ Adsorbed bacteriocins ถูกกำหนดเป็น:
AU/mL0 และ AU/mL1 ถึง bacteriocin กิจกรรมก่อน และ หลังการ รักษา ตามลำดับ.

เพิ่ม อิทธิพลของอุณหภูมิ (4 ° C, 25 ° C, 30 ° C และ 37 ° C), (4.0, 6.0, 8.0 และ 10.0) และของ 1% (w/v) ของ NaCl, tween 20 tween 80 กลีเซอร และ SDS ในของ bacteriocin ผลิตโดยแยก 69 กับ L. monocytogenes ScottA กำหนดตาม Todorov (2008) .
2.8 เจริญเติบโตและอยู่รอดในสื่อที่ประกอบด้วยความเข้มข้นแตกต่างกันของ NaCl
การตรวจสอบความสามารถในการแยก 69 จะเติบโตในต่อหน้าของ NaCl จุลินทรีย์ถูก inoculated (105 CFU/mL) ใน 100 mL ของซุป MRS ที่ประกอบด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของ NaCl (0%, 3%, 5%, 10%, 15% และ 20% w/v) และ incubated ที่ 30 ° C ถึง 72 h การเจริญเติบโตในซุป MRS ประกอบด้วย 0%, 3% และ 5% NaCl ถูกตรวจสอบโดยการแจงนับของเซลล์ทำงานได้ดำเนินการทุก 2 h ขึ้นไป 12 h และจากนั้นทุก h 12 ค่า 72 h ใน MRS ซุปที่มี 10%, 15% และ 20% NaCl การเจริญเติบโตถูกตรวจสอบที่ 24 h, 30 h, 36 h, 48 h, 60 h และ h 72 ของคณะทันตแพทยศาสตร์ MRS agar ใช้สำหรับการกำหนดหมายเลขของ CFU/mL ในแต่ละวัฒนธรรม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 ความไวของสารยับยั้งเอนไซม์โปรตีเอสที่จะ
มีผลบังคับใช้ของเอนไซม์โปรตีนที่ฤทธิ์ต้านจุลชีพของ CFS เตรียมตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในมาตรา 2.3 ได้รับการทดสอบตาม Van Reenen, จู๋และ Chikindas (1998) หนึ่งมิลลิลิตรของ CFS ผสมกับน้ำย่อย (1 mg / มิลลิลิตร) หรือโปรติเอส (1 mg / มิลลิลิตร) และบ่มที่ 37 ° C นาน 30 นาที เอนไซม์ที่ถูกซื้อมาจากซิกม่า, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา ปฏิกิริยาของเอนไซม์ก็หยุดด้วยความร้อนที่ 100 ° C เป็นเวลา 3 นาทีและฤทธิ์ต้านจุลชีพได้รับการประเมินจากการทดสอบจุดบนสนามหญ้า2.5 ผลของพีเอชอุณหภูมิและสารเคมีตัวแทนในฤทธิ์ต้านจุลชีพผลของ pH ต่อฤทธิ์ต้านจุลชีพของ CFS ได้รับการทดสอบการปรับค่าพีเอชของ aliquots (5 มิลลิลิตร) CFS จาก 2.0 ถึง 12.0 (โดยมีการเพิ่มขึ้นของหน่วย pH หนึ่ง) 1 M NaOH หรือ 1 M HCl (Synth, Diadema, บราซิล) หลังจากการบ่มที่ 25 ° C เป็นเวลา 30 นาที, ค่าพีเอชที่ถูกปรับ 7.0 ผลกระทบของอุณหภูมิที่มีฤทธิ์ต้านจุลชีพของ CFS ได้รับการทดสอบความร้อนของ aliquots 1 มิลลิลิตร CFS ที่ 60 ° C 80 ° C และ 100 ° C เป็นเวลา 30 นาที, 60 นาทีและ 120 นาที ผลของโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) (BioAgency, เซาเปาลู, บราซิล), กรด tetraacetic ethylenediamine (EDTA) (Invitrogen, คาร์ลส, สหรัฐอเมริกา), ทวี 80 (Synth, Diadema, บราซิล) และยูเรีย (Synth, Diadema, บราซิล) กับกิจกรรมต้านจุลชีพได้รับการทดสอบโดยการเพิ่ม 1% (w / v) ของสารเหล่านี้จะ CFS สำหรับการทดสอบฤทธิ์ต้านจุลชีพทั้งหมดถูกกำหนดโดยการทดสอบจุดบนสนามหญ้าโดยใช้ L. sakei ATCC 15521 เป็นจุลินทรีย์ตัวบ่งชี้ ในการทดลองทั้งหมด bacteriocin ผลิตสายพันธุ์ L. sakei subsp sakei 2a ใช้เป็นที่ควบคุมบวก (เดอมาร์ตินี่และฝรั่งเศส, 1998) 2.6 สเปกตรัมของฤทธิ์ต้านแบคทีเรียสองสายพันธุ์ (69 และ 94) ที่ผลิตสารต้านจุลชีพที่มีความสำคัญกับเอนไซม์โปรตีนและไม่ได้รับผลกระทบจากค่า pH, ความร้อนและสารเคมีที่ได้รับการพิจารณาผู้ผลิต bacteriocin และทดสอบจึงเป็นกิจกรรมที่ยาปฏิชีวนะกับสายพันธุ์เป้าหมายที่ระบุไว้ในตารางที่ 2 นอกจากนี้ยังมีแบคทีเรียชอบเกลือและทนเค็มที่แยกได้จาก charqui สายพันธุ์เหล่านี้รวมถึงสายพันธุ์อ้างอิง (ATCC และอื่น ๆ ) และอาหารแยกเป็นของสะสมที่วัฒนธรรมอาหารปฏิบัติการจุลชีววิทยาของมหาวิทยาลัยเซาท์เปาโล, เซาเปาโลประเทศบราซิล กิจกรรมที่ได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบที่จุดบนสนามหญ้า จุลินทรีย์กลุ่มเป้าหมายได้รับการพิจารณาความไวต่อความเครียดผลิต bacteriocin เมื่อเส้นผ่าศูนย์กลางของโซนการยับยั้งการเจริญเติบโตเป็นอย่างน้อย 5 มิลลิเมตร สภาวะการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์แต่ละการทดสอบจะแสดงในตารางที่ 2 ตารางที่ 2 สเปกตรัมของกิจกรรมของแยก 69 และ 94 ที่ได้จาก charqui จำนวนสายพันธุ์ที่ผ่านการทดสอบความไวต่อ bacteriocin / จำนวนรวมของสายพันธุ์ที่ผ่านการทดสอบ2.7 โหมดของการดำเนินการสำหรับการกำหนดรูปแบบของการกระทำของสารต้านจุลชีพ, 20 มิลลิลิตรของตัวกรองฆ่าเชื้อ (0.22 ไมโครเมตรค, สหรัฐอเมริกา) CFS ถูกบันทึกอยู่ในวัฒนธรรม (100 มิลลิลิตร) monocytogenes ลิตร Scotta ในสมองหัวใจ Infusion (BHI ) น้ำซุป (Oxoid, เบซิง, UK) ในช่วงต้น (3 ชั่วโมง) ขั้นตอนการชี้แจงและความหนาแน่นของแสง (600 นาโนเมตร) และจำนวนของเซลล์ทำงานได้ถูกวัดทุกชั่วโมงถึง 10 ชั่วโมง (Todorov และจู๋, 2005) จำนวนโคโลนี / มิลลิลิตร L. monocytogenes Scotta ในส่วนผสมที่ถูกกำหนดโดยการชุบบน TSA เสริมด้วย 0.6% (w / v) ยีสต์สกัด (Oxoid, เบซิง, สหราชอาณาจักร) การดูดซับของ bacteriocin ที่ผลิตโดยแยก 69 L . monocytogenes Scotta, L. monocytogenes 620 4b (มหาวิทยาลัยรวบรวมวัฒนธรรมเปา), L. monocytogenes 637 1/2c (มหาวิทยาลัยรวบรวมวัฒนธรรมเปา), L. sakei ATCC 15521 และ Enterococcus faecium ATCC 19443 วัดตาม Todorov ( 2008) จุลินทรีย์เป้าหมายเป็นผู้ใหญ่ค้างคืนใน BHI น้ำซุปที่ 37 ° C และจากนั้นหมุนเหวี่ยง (8000 ×กรัม, 15 นาที, 4 ° C) เซลล์ที่ถูกล้างครั้งที่สองที่มีการฆ่าเชื้อ 5 มิลลิฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6.5) และอีกครั้งที่ถูกระงับในบัฟเฟอร์เดียวกันกับ OD ที่ 600 นาโนเมตรเท่ากับ 1.0 พีเอชมีการปรับ 6.5 ด้วยหมัน 0.1 M NaOH หนึ่งมิลลิลิตรของแต่ละเซลล์แขวนลอยผสมกับ 1 มิลลิลิตร CFS และบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากการกำจัดของเซลล์ (8000 ×กรัม, 15 นาที, 25 ° C), กิจกรรมของแบคเทอริโอหลุดในสารละลายที่ถูกกำหนดโดยวิธีการลดสัดส่วนที่สำคัญ bacteriocins ดูดซับได้รับการพิจารณาเป็นAU/mL0 และ AU/mL1 อ้างถึงกิจกรรม bacteriocin ก่อนและหลังการรักษาตามลำดับนอกจากนี้อิทธิพลของอุณหภูมิ (4 ° C, 25 ° C, 30 ° C และ 37 ° C) พีเอช (4.0, 6.0, 8.0 และ 10.0) และการปรากฏตัวของ 1% (w / v) โซเดียมคลอไรด์, ทวี 20, ทวี 80, กลีเซอรอลและ SDS ในการดูดซับของ bacteriocin ที่ผลิตโดยแยก 69 ลิตร monocytogenes Scotta ถูกกำหนด ตาม Todorov (2008) 2.8 การเจริญเติบโตและการอยู่รอดในสื่อที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของโซเดียมคลอไรด์เพื่อตรวจสอบความสามารถในการแยก 69 ที่จะเติบโตในที่ที่มีโซเดียมคลอไรด์, จุลินทรีย์ที่ได้รับการฉีดวัคซีน (105 โคโลนี / มิลลิลิตร) ใน 100 มล. ของน้ำซุปที่มีความเข้มข้น MRS ที่เพิ่มขึ้นของโซเดียมคลอไรด์ (0% 3%, 5%, 10%, 15% และ 20% w / v) และบ่มที่ 30 ° C ถึง 72 ชั่วโมง การเจริญเติบโตในน้ำซุป MRS ที่มี 0%, 3% และ 5% โซเดียมคลอไรด์ที่ได้รับการตรวจสอบโดยการนับของเซลล์ทำงานได้ดำเนินการทุก 2 ชั่วโมงถึง 12 ชั่วโมงและจากนั้นทุก 12 ชั่วโมง 72 ชั่วโมงขึ้น ในน้ำซุป MRS ที่มี 10%, 15% และ 20% โซเดียมคลอไรด์, การเจริญเติบโตได้รับการตรวจสอบเวลา 24 ชั่วโมง, 30 ชั่วโมง, 36 ชั่วโมง, 48 ชั่วโมง, 60 ชั่วโมงและ 72 ชั่วโมงของการบ่ม MRS agar ถูกนำมาใช้สำหรับการกำหนดจำนวนโคโลนี / มิลลิลิตรในแต่ละวัฒนธรรม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . ความไวของสารที่ยับยั้งเอนไซม์ที่จะระ
ผลของโปรตีนเอนไซม์ในกิจกรรมการต้านจุลชีพของโฆษณา เตรียมตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในส่วน 2.3 ถูกทดสอบตามรถตู้ reenen , Dicks และ chikindas ( 1998 ) หนึ่งมิลลิลิตรของโฆษณาที่ถูกผสมกับเอนไซม์เปปซิน ( 1 mg / ml ) หรือโปรตีน ( 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร ) และบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 30 นาทีเอนไซม์ที่ถูกซื้อจาก Sigma , นิวยอร์ก , สหรัฐอเมริกาปฏิกิริยาเอนไซม์ถูกหยุดโดยความร้อนที่อุณหภูมิ 100 องศา C เป็นเวลา 3 นาที และฤทธิ์ต้านจุลชีพที่ถูกประเมิน โดยจุดบนสนามหญ้าทดสอบ

2.5 ผลของ pH , อุณหภูมิและสารเคมีบน
ฤทธิ์ต้านจุลชีพผลของ pH ที่มีฤทธิ์ต้านจุลชีพของโฆษณาที่ถูกทดสอบค่า pH ของเฉยๆ ( 5 มล. ) ของโฆษณาจาก 2.0 ถึง 12.0 ( มีการเพิ่มขึ้นของหนึ่งหน่วย pH ) 1 M NaOH หรือ 1 M HCl ( Synth Diadema บราซิล ) หลังจากบ่มที่อุณหภูมิ 25 ° C เป็นเวลา 30 นาที เพื่อปรับ pH เป็น 7.0 .ผลของอุณหภูมิต่อฤทธิ์ต้านจุลชีพของโฆษณาที่ถูกทดสอบความร้อนเฉยๆ 1 มิลลิลิตรของ CFS ที่ 60 °องศาเซลเซียส , 80 ° C และ 100 องศา C นาน 30 นาที 60 นาที และ 120 นาที ผลของโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS ) ( bioagency เซาเปาโล ประเทศบราซิล tetraacetic acid ( EDTA ) , ธิลีนไดเ ีน ) ( Invitrogen Carlsbad , USA ) Tween 80 ( Synth Diadema บราซิล ) และยูเรีย ( Synth Diadema ,บราซิล ) เมื่อทดสอบฤทธิ์ต้านจุลชีพโดยเพิ่ม 1% ( w / v ) สารเหล่านี้เพื่องานโฆษณา เพื่อทดสอบฤทธิ์ต้านจุลชีพที่ถูกกำหนดโดยจุดบนสนามหญ้าทดสอบ ใช้ L . sakei 15521 เป็นตัวเชื้อจุลินทรีย์ ในการทดลองทั้งหมดที่ผลิตความเครียดต่อลิตร sakei subsp . sakei 2A ถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวก ( เดอ มาตินี่& Franco , 1998 ) .

2.6สเปกตรัมของกิจกรรม antibacterial
2 ไอโซเลท ( 69 และ 94 ) ที่ผลิตสารยับยั้งเอนไซม์ที่จำเพาะต่อ และไม่ได้รับผลกระทบจากค่า pH , ความร้อนและสารเคมี ถือว่าเป็นผู้ผลิตแบคทีริโอซินและดังนั้นจึงทดสอบฤทธิ์ต้านจุลชีพ เป้าหมายสายพันธุ์ที่แสดงในตารางที่ 2 นอกเหนือไปจากเอนไซม์ทนเค็มและแบคทีเรียที่แยกได้จาก charqui ,สายพันธุ์ได้แก่สายพันธุ์อ้างอิง ( ATCC และอื่น ๆ ) และอาหารจากวัฒนธรรมอาหารของคอลเลกชันที่ห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา มหาวิทยาลัยเซาเปาโล เซา เปาโล ประเทศบราซิล กิจกรรมที่ประเมินโดยใช้จุดบนสนามทดสอบเป้าหมายคือการพิจารณาที่ไวต่อเชื้อแบคทีริโอซิน ผู้ผลิตสายพันธุ์เมื่อเส้นผ่าศูนย์กลางของยับยั้งการเจริญเติบโตโซน คืออย่างน้อย 5 มม. โดยเงื่อนไขของแต่ละการทดสอบจุลินทรีย์จะแสดงดังตารางที่ 2 ตาราง 2
.
สเปกตรัมของกิจกรรมของสายพันธุ์และ 94 , ที่ได้รับจาก charqui .
จำนวนการทดสอบสายพันธุ์ที่ไวต่อต่อ / จํานวนทดสอบสายพันธุ์
2.7 .โหมดของการกระทำ
สำหรับกำหนดโหมดของการกระทำของสารประกอบยา 20 มิลลิลิตร กรองฆ่าเชื้อ ( 0.22 มิลลิเมตรμ , USA ) โฆษณาที่ถูกเพิ่มเข้าไปในวัฒนธรรม ( 100 มล. ) ของ L . monocytogenes scotta ในแช่หัวใจสมอง ( BHI broth ( oxoid Basingstoke , ) ,สหราชอาณาจักร ) ในช่วงต้น ( 3 ชั่วโมง ) ระยะ exponential และความหนาแน่นของแสง ( 600 nm ) และจำนวนเซลล์ ทุก ๆชั่วโมง วัดได้ถึง 10 ชั่วโมง ( Todorov & Dicks , 2005 ) จำนวนโคโลนีของ L . monocytogenes scotta ในส่วนผสมซึ่งชุบบน TSA เสริมด้วย 0.6 % ( w / v ) สารสกัดจากยีสต์ ( oxoid Basingstoke , สหราชอาณาจักร ) .
การดูดซับของแบคทีริโอซินที่ผลิตโดยแยก 69 กับ Lmonocytogenes scotta L monocytogenes 620 4B ( มหาวิทยาลัยเซาเปาโลวัฒนธรรมของสะสม ) L monocytogenes 1 1 / 2C ( มหาวิทยาลัยเซาเปาโลวัฒนธรรมของสะสม , L . ) และ sakei 15521 เอ็นเทโรค็อกคัสจาก ATCC 19443 วัดจาก Todorov ( 2008 ) เป้าหมายจุลินทรีย์เติบโตค้างคืนที่ 37 ° C ใน BHI broth และไฟฟ้า ( 8 × G , 15 นาที , 4 ° C )เซลล์มีการล้างสองครั้งกับหมัน 5 mM ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.5 ) และแขวนลอยในบัฟเฟอร์เดียวกันไป OD ที่ 600 nm เท่ากับ 1.0 ปรับ pH 6.5 กับหมัน 0.1 M NaOH หนึ่งมิลลิลิตรของแต่ละเซลล์แขวนลอยที่ได้ผสม 1 มิลลิลิตรของ CFS และบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากการกำจัดเซลล์ ( 8000 × G , 15 นาที , 25 ° C )กิจกรรมคลายต่อในน่านถูกหาโดยวิธีเจือจางวิกฤต ดูดซับวัตถุดิบถูกกำหนดเป็น :
Au / ml0 และ AU / ml1 อ้างถึงต่อกิจกรรมก่อนและหลังการรักษาตามลำดับ

นอกจากนี้ อิทธิพลของอุณหภูมิ ( 4 ° C 25 ° C , 30 ° C และ 37 ° C ) , ( pH 4.0 , 6.0 และ 8.0 10.0 ) และการแสดงตนของ 1% ( w / v ) เกลือ Tween 20ทวีน 80 , กลีเซอรอลและ SDS ในการดูดซับของแบคทีริโอซินที่ผลิตโดยแยก 69 เพื่อ L . monocytogenes scotta ถูกกำหนดตาม โทโดรอฟ ( 2551 ) .
2.8 . การเจริญเติบโตและอัตรารอดในการสื่อที่มีระดับความเข้มข้นของเกลือ
เพื่อศึกษาความสามารถของแยก 69 เติบโตในที่มีเกลือ ,เป็นเชื้อจุลินทรีย์ ( 105 CFU / ml ) ใน 100 มิลลิลิตรของ MRS broth ที่มีเพิ่มความเข้มข้นของเกลือโซเดียมคลอไรด์ ( 0 , 3% , 5% , 10% , 15% และ 20% w / v ) และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C ถึง 72 ชั่วโมง การเจริญเติบโตใน MRS broth ที่มี 0 % 3 , % 5 % NaCl และถูกตรวจสอบ โดยการวางเซลล์แสดงทุก 2 ชั่วโมง ถึง 12 ชั่วโมง และทุกๆ 12 ชั่วโมง ขึ้น 72 ชั่วโมงใน MRS broth ที่มี 10% , 15% และ 20% เกลือ ,การตรวจสอบใน 24 ชั่วโมง 30 ชั่วโมง 36 ชั่วโมง , 48 ชั่วโมง , 60 ชั่วโมงและ 72 ชั่วโมงของการบ่ม นางวุ้นที่ใช้สำหรับการกำหนดจำนวนเซลล์ต่อมิลลิลิตร ในแต่ละวัฒนธรรม