CHARACTERIZATION OF POLYPHENOLOXIDA

CHARACTERIZATION OF POLYPHENOL
OXIDASE AND ANTIOXIDANTS FROM
PAWPAW (ASIMINA TRIBOLA) FRUIT

CHAPTER 1: INTRODUCTION ………………………………………………...1
CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW
2.1. Pawpaw …………………………...…………………………………….4
2.1.1. Pawpaw biology …………………………...…………………4
2.1.2. Pawpaw fruit as food ………………………………………...6
2.2. Food Browning …………………………………………………………7
2.2.1. Non-enzymatic browning …………………………………….7
2.2.1.1. Maillard reaction …………………………………….…7
2.2.1.2. Ascorbic acid oxidation ...……………….…………..….8
2.2.1.3. Caramelization …………………………………………....8
2.2.2. Enzymatic browning …………………………………….…....9
2.2.2.1. Polyphenol oxidase (PPO) ……………………….……9
2.2.2.2. Factors affecting PPO activity ………………………..12
2.2.2.2.1. Enzyme active site ……………………………..12
2.2.2.2.2. Prosthetic groups ………………………………12
2.2.2.2.3. pH dependence ………………………………...14
2.2.2.2.4. Temperature dependence …..………………….14
2.2.2.3. Inhibition of PPO ……………………………….…...15
2.2.2.4. Methods to characterize PPO ………………………...16
2.2.2.4.1. Colorimetry ………………………………...….16
2.2.2.4.2. Extraction …………………………………..….18
2.2.2.4.3. Assay for PPO activity .……………………....18
2.2.2.4.4. Gel filtration chromatography .……………....19
2.2.2.4.5. SDS-PAGE ……..……………………………….19
2.3. Lipid Oxidation ………………………………………………………….21
2.3.1. Mechanism of lipid oxidation ……………………………….21
2.3.2. Measurements of lipid oxidation ……...….……………….22
2.3.2.1. Peroxide method ……………………...………………24
2.3.2.2. Thiobarbituric acid method .…………………....……24
2.3.2.3. Conjugated diene method ………………………….…25
2.4. Antioxidants From Edible Plants ………………………………...……25
2.4.1. Mechanism of antioxidant action …………………….…...26
2.4.2. Extraction of antioxidants …………………………….…..26
2.4.3. Evaluation of antioxidant activity …………………….…….27
2.4.3.1. Radical-scavenging methods ……………………...….27
2.4.3.1.1. ABTS assay ……………………………………27
2.4.3.1.2. DPPH assay …………………………...……….30
2.4.3.2. Metal-chelation methods ……………………………..30
2.4.3.2.1. Phycoerythyrin assay …………………………...30
2.4.3.3. Reducing power methods …………………….……….31
2.4.3.3.1. FRAP assay ………………………….…………31
2.4.3.3.2. Copper reduction assay ……………...…………31
CHAPTER 3: EXTRACTION AND CHARACTERIZATION OF
POLYPHENOL OXIDASE IN PAWPAW
(ASIMINA TRILOBA) FRUIT
3.1. Summary ………………………………………………………………32
3.2. Introduction …………………………………………………...………33
3.3. Materials and Methods ……………………………………………….35
3.3.1. Materials …………………………………………………….35
3.3.2. Crude enzyme extraction ……………………………………35
3.3.3. Enzyme purification and separation …………….….……..36
3.3.4. Electrophoresis …………………………… ………………...37
3.3.5. Assay for enzyme activity …………………………………..38
3.3.6. The pH effect ………………………………………….……..39
3.3.7. The temperature effect ……………………….……………....39
3.3.8. Enzyme kinetics …………………….……………………….40
3.4. Results and Discussion ………………………………..……….……….41
3.4.1. PPO extraction and purification ……………………………..41
3.4.2. The pH effect …………………………………………….….46
3.4.3. The temperature effect ……………………………………....49
3.4.4. Enzyme kinetics ……………….……………………….……52
3.5. Conclusions ………………………………………………………………55
CHAPTER 4: ACTIVITYAND THERMAL STABILITY OF
POLYPHENOL OXIDASE FROM DIFFERENT
GENOTYPES OF PAWPAW (ASIMINA TRILOBA) FRUIT
4.1. Summary ………………………………………………………………58
4.2. Introduction ………………………………………………………...…59
4.3. Materials and Methods ……………………………………………….61
4.3.1. Pawpaw materials ………………………………….………..61
4.3.2. Heating effect ………………………………………….……61
4.3.3. Crude enzyme extraction ………………………….…….…..62
4.3.4. Enzyme activity measurement ………………….…………..62
4.3.5. Electrophoresis ………………………………………..…….63
4.3.6. PPO quantification ……………………………………….…64
4.3.7. Colorimetric measurement ……………………………….....65
4.3.8. Statistical analysis …………………………………………..65
4.4. Results and Discussion ………………………………………………..65
4.4.1. PPO activity in crude extracts ……………………………….…65
4.4.2. PPO quantification …………….…………………………….....67
4.4.3. PPO thermal stability …………………………………………..70
4.4.4. Colorimetric measurement …………………………..…………75
4.4.5. Relationship between PPO concentrations, PPO
activity and visual color ………………………………….........83
4.5. Conclusions ……………………………………………………………83
CHAPTER 5: ANTIOXIDANT ACTIVITY OF PAWPAW FRUIT
(ASIMINA TRILOBA) EXTRACT
5.1. Summary ………………………………………………………………86
5.2. Introduction ……………………………………………………..…….87
5.3. Materials and Methods ……………………………………………….88
5.3.1. Materials ………………………………………………….....88
5.3.2. Antioxidant extraction ………………………………………89
5.3.3. ABTS assay …………………………………………………89
5.3.4. Liposome oxidation assay …………………………….…….90
5.3.5. Measurement of conjugated dienes ………………………....91
5.3.6. HPLC analysis ………………………………………………91
5.4. Results and Discussion ………………………………………...……….92
5.4.1. Antioxidant activity ……………………………………….…....92
5.4.1.1. Scavenging effect on ABTS•+ ……………...…….93
5.4.1.2. Inhibition of liposome peroxidation …………….…96
5.4.2. HPLC …………………………………………………..………99
5.4.3. Relationship between antioxidant activity PPO
activity and visual color ……………………………………...101
5.5. Conclusions ……………………………………………………...……….104
CHAPTER 6: OVERALL CONCLUSIONS ………………………..………………105
REFERENCES …………………………………………………………….…………..107
VITA ………………………………………………………………….………………..127

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

คุณสมบัติของ POLYPHENOLOXIDASE และสารต้านอนุมูลอิสระจากผลไม้ PAWPAW (ASIMINA TRIBOLA)บทที่ 1: แนะนำ... 1บทที่ 2: การทบทวนวรรณกรรม2.1. pawpaw การ..42.1.1. pawpaw ชีววิทยา... 42.1.2. pawpaw ผลไม้เป็นอาหาร... 62.2. อาหารเกิดสีน้ำตาล... 72.2.1. Non-เอนไซม์ในระบบ browning ..72.2.1.1 ปฏิกิริยา Maillard ... 72.2.1.2 การกรดแอสคอร์บิคออกซิเดชัน..82.2.1.3 การ caramelization ... 82.2.2. browning เอนไซม์ในระบบ... 92.2.2.1 การ Polyphenol oxidase (PPO) ... 92.2.2.2. ปัจจัยที่มีผลต่อกิจกรรม PPO ..122.2.2.2.1 การเอนไซม์ใช้งานไซต์..122.2.2.2.2. Prosthetic กลุ่ม... 122.2.2.2.3 pH พึ่งพา... 142.2.2.2.4 อุณหภูมิพึ่งพา..142.2.2.3 การยับยั้ง PPO ... 152.2.2.4. วิธีการกำหนดลักษณะ PPO ... 162.2.2.4.1. Colorimetry ………………………………...….162.2.2.4.2. Extraction …………………………………..….182.2.2.4.3. Assay for PPO activity .……………………....182.2.2.4.4. Gel filtration chromatography .……………....192.2.2.4.5. SDS-PAGE ……..……………………………….192.3. Lipid Oxidation ………………………………………………………….212.3.1. Mechanism of lipid oxidation ……………………………….212.3.2. Measurements of lipid oxidation ……...….……………….222.3.2.1. Peroxide method ……………………...………………242.3.2.2. Thiobarbituric acid method .…………………....……242.3.2.3. Conjugated diene method ………………………….…252.4. Antioxidants From Edible Plants ………………………………...……252.4.1. Mechanism of antioxidant action …………………….…...262.4.2. Extraction of antioxidants …………………………….…..262.4.3. Evaluation of antioxidant activity …………………….…….272.4.3.1. Radical-scavenging methods ……………………...….272.4.3.1.1. ABTS assay ……………………………………272.4.3.1.2. DPPH assay …………………………...……….302.4.3.2. Metal-chelation methods ……………………………..302.4.3.2.1. Phycoerythyrin assay …………………………...302.4.3.3. Reducing power methods …………………….……….312.4.3.3.1. FRAP assay ………………………….…………312.4.3.3.2. Copper reduction assay ……………...…………31CHAPTER 3: EXTRACTION AND CHARACTERIZATION OFPOLYPHENOL OXIDASE IN PAWPAW(ASIMINA TRILOBA) FRUIT3.1. Summary ………………………………………………………………323.2. Introduction …………………………………………………...………333.3. Materials and Methods ……………………………………………….353.3.1. Materials …………………………………………………….353.3.2. Crude enzyme extraction ……………………………………353.3.3. Enzyme purification and separation …………….….……..363.3.4. Electrophoresis …………………………… ………………...373.3.5. Assay for enzyme activity …………………………………..383.3.6. The pH effect ………………………………………….……..393.3.7. The temperature effect ……………………….……………....393.3.8. Enzyme kinetics …………………….……………………….403.4. Results and Discussion ………………………………..……….……….413.4.1. PPO extraction and purification ……………………………..413.4.2. The pH effect …………………………………………….….463.4.3.อุณหภูมิผล... 493.4.4 การเอนไซม์จลนพลศาสตร์... 523.5. บทสรุป... 55บทที่ 4: ACTIVITYAND ความร้อนเสถียรภาพของPOLYPHENOL OXIDASE จากแตกต่างกันการศึกษาจีโนไทป์ของผลไม้ PAWPAW (ASIMINA TRILOBA)4.1. สรุป... 584.2 การนำ... 594.3. วัสดุและวิธีการ..614.3.1 วัสดุ pawpaw ..614.3.2 การร้อนผล... 614.3.3 การสกัดเอนไซม์ดิบ..624.3.4 วัดกิจกรรมของเอนไซม์..624.3.5 การ electrophoresis การ..634.3.6 การ PPO นับ... 644.3.7. วัดสีวัด... 654.3.8. สถิติวิเคราะห์. ..654.4 การผลลัพธ์ และสนทนา..654.4.1 กิจกรรม PPO ในสารสกัดหยาบ... 654.4.2. PPO quantification …………….…………………………….....674.4.3. PPO thermal stability …………………………………………..704.4.4. Colorimetric measurement …………………………..…………754.4.5. Relationship between PPO concentrations, PPOactivity and visual color ………………………………….........834.5. Conclusions ……………………………………………………………83CHAPTER 5: ANTIOXIDANT ACTIVITY OF PAWPAW FRUIT(ASIMINA TRILOBA) EXTRACT5.1. Summary ………………………………………………………………865.2. Introduction ……………………………………………………..…….875.3. Materials and Methods ……………………………………………….885.3.1. Materials ………………………………………………….....885.3.2. Antioxidant extraction ………………………………………895.3.3. ABTS assay …………………………………………………895.3.4. Liposome oxidation assay …………………………….…….905.3.5. Measurement of conjugated dienes ………………………....915.3.6. HPLC analysis ………………………………………………915.4. Results and Discussion ………………………………………...……….925.4.1. Antioxidant activity ……………………………………….…....925.4.1.1. Scavenging effect on ABTS•+ ……………...…….935.4.1.2. Inhibition of liposome peroxidation …………….…965.4.2. HPLC …………………………………………………..………995.4.3. Relationship between antioxidant activity PPOactivity and visual color ……………………………………...1015.5. Conclusions ……………………………………………………...……….104CHAPTER 6: OVERALL CONCLUSIONS ………………………..………………105REFERENCES …………………………………………………………….…………..107VITA ………………………………………………………………….………………..127

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

คุณสมบัติของโพลีฟีนออกซิเดสและสารต้านอนุมูลอิสระจากมะละกอ(ASIMINA TRIBOLA) ผลไม้บทที่1: บทนำ ...................................................... ... 1 บทที่ 2: การทบทวนวรรณกรรม2.1 มะละกอ .............................. ... .......................................... 0.4 2.1.1 ชีววิทยามะละกอ .............................. ... ..................... 4 2.1.2 มะละกอผลไม้เป็นอาหาร ............................................. ... 6 2.2 อาหารบราวนิ่ง .................................................................. 7 2.2.1 การเกิดสีน้ำตาลที่ไม่ใช่เอนไซม์ .......................................... 0.7 2.2.1.1 ปฏิกิริยา Maillard .......................................... . ... 7 2.2.1.2 การเกิดออกซิเดชันวิตามินซี ... .................. . ............ .. ... 0.8 2.2.1.3 caramelization ................................................ .... 8 2.2.2 สีน้ำตาลเอนไซม์ .......................................... . ... .... 9 2.2.2.1 polyphenol oxidase (PPO) ........................... . ...... 9 2.2.2.2 ปัจจัยที่มีผลกิจกรรม PPO ........................... ..12 2.2.2.2.1 เอนไซม์ใช้งานเว็บไซต์ ................................. ..12 2.2.2.2.2 กลุ่มเทียม .................................... 12 2.2.2.2.3 การพึ่งพาค่า pH .................................... ... 14 2.2.2.2.4 ขึ้นอยู่กับอุณหภูมิ ... .. ..................... 0.14 2.2.2.3 ยับยั้งการ PPO .................................... . ... ... 15 2.2.2.4 วิธีการที่จะอธิบายลักษณะ PPO ........................... ... 16 2.2.2.4.1 colorimetry .................................... ... ... 0.16 2.2.2.4.2 สกัด ....................................... .. ... 0.18 2.2.2.4.3 Assay กิจกรรม PPO. ........................ .... 18 2.2.2.4.4 กรองโคเจล. ............... .... 19 2.2.2.4.5 SDS-PAGE ...... .. .................................... 0.19 2.3 ออกซิเดชันไขมัน .................................................................. 0.21 2.3.1 กลไกของการเกิดออกซิเดชันของไขมัน .................................... 0.21 2.3.2 วัดออกซิเดชันของไขมัน ... ... ...... . .................. 0.22 2.3.2.1 วิธี Peroxide ........................ ... .................. 24 2.3.2.2 วิธีกรด Thiobarbituric. ..................... ...... .... 24 2.3.2.3 วิธี diene Conjugated .............................. . ... 25 2.4 สารต้านอนุมูลอิสระจากพืชกิน .................................... ... ...... 25 2.4.1 กลไกการออกฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ........................ . ... ... 26 2.4.2 การสกัดสารต้านอนุมูลอิสระ ................................. . ... ..26 2.4.3 การประเมินผลของสารต้านอนุมูลอิสระ ........................ . ...... 0.27 2.4.3.1 วิธีการที่รุนแรง-ไล่ ........................ ... ... 0.27 2.4.3.1.1 ทดสอบ ABTS .......................................... 27 2.4.3.1.2 ทดสอบ DPPH .............................. ... ......... 0.30 2.4.3.2 วิธีการขับโลหะ ................................. ..30 2.4.3.2.1 ทดสอบ Phycoerythyrin .............................. ... 30 2.4.3.3 วิธีการลดการใช้พลังงาน ........................ . ......... 0.31 2.4.3.3.1 ทดสอบ FRAP .............................. . ............ 31 2.4.3.3.2 ทองแดงทดสอบลด ............... ... ............ 31 บทที่ 3: การสกัดและคุณสมบัติของโพลีฟีนออกซิเดสในมะละกอ(ASIMINA TRILOBA) ผลไม้3.1 ข้อมูลอย่างย่อ ........................................................................ 32 3.2 บทนำ ......................................................... ... ......... 33 3.3 วัสดุและวิธีการ ...................................................... 0.35 3.3.1 วัสดุ ............................................................ 0.35 3.3.2 สกัดเอนไซม์ .......................................... 35 3.3.3 เอนไซม์ให้บริสุทธิ์และการแยก ............... . ... . ...... ..36 3.3.4 อิ ................................. .................. ... 37 3.3.5 สำหรับการทดสอบการทำงานของเอนไซม์ ....................................... ..38 3.3.6 ผลกระทบค่า pH ................................................ . ...... ..39 3.3.7 ผลอุณหภูมิ ........................... . ............... .... 39 3.3.8 จลนศาสตร์ของเอนไซม์ ........................ . ........................... 0.40 3.4 ผลการทดลองและการอภิปราย .................................... .. ......... . ......... 0.41 3.4.1 การสกัดและการทำให้บริสุทธิ์ PPO ................................. ..41 3.4.2 ผลกระทบค่า pH ................................................... . ... 0.46 3.4.3 ผลอุณหภูมิ .......................................... .... 49 3.4.4 จลนศาสตร์ของเอนไซม์ .................. . ........................... . ...... 52 3.5 สรุป ........................................................................ 55 บทที่ 4: ACTIVITYAND เสถียรภาพทางความร้อนของโพลีฟีนออกซิเดสจากที่แตกต่างกันจีโนไทป์ของมะละกอ(ASIMINA TRILOBA) ผลไม้4.1 ข้อมูลอย่างย่อ ........................................................................ 58 4.2 บทนำ ............................................................... ... ... 59 4.3 วัสดุและวิธีการ ...................................................... 0.61 4.3.1 วัสดุมะละกอ ....................................... . ......... ..61 4.3.2 ผลทำความร้อน ................................................ . ...... 61 4.3.3 สกัดเอนไซม์ .............................. . ...... . ... ..62 4.3.4 การวัดการทำงานของเอนไซม์ ..................... . ............ ..62 4.3.5 อิ ............................................. .. ...... 0.63 4.3.6 ปริมาณ PPO ............................................. . ... 64 4.3.7 วัดสี .................................... ..... 65 4.3.8 การวิเคราะห์ทางสถิติ ................................................ ..65 4.4 ผลการทดลองและการอภิปราย ...................................................... ..65 4.4.1 กิจกรรม PPO ในสารสกัดหยาบ .................................... . ... 65 4.4.2 ปริมาณ PPO ............... . ................................. ..... 67 4.4.3 PPO เสถียรภาพทางความร้อน ................................................ ..70 4.4.4 วัดสี .............................. .. ............ 75 4.4.5 ความสัมพันธ์ระหว่างความเข้มข้นของ PPO, PPO กิจกรรมและ ....................................... สีภาพ ......... 83 4.5 สรุปผลการวิจัย ..................................................................... 83 บทที่ 5: การต้านอนุมูลอิสระการทำงานของมะละกอผลไม้(ASIMINA TRILOBA) EXTRACT 5.1 ข้อมูลอย่างย่อ ........................................................................ 86 5.2 บทนำ ............................................................ .. ...... 0.87 5.3 วัสดุและวิธีการ ...................................................... 0.88 5.3.1 วัสดุ ..... ......................................................... 88 5.3.2 การสกัดสารต้านอนุมูลอิสระ ............................................. 89 5.3.3 ทดสอบ ABTS ......................................................... 89 5.3.4 การเกิดออกซิเดชัน Liposome ทดสอบ ................................. . ...... 0.90 5.3.5 วัด dienes ผัน ........................... .... 91 5.3.6 การวิเคราะห์ HPLC ...................................................... 91 5.4 ผลการทดลองและการอภิปราย ............................................. ... ......... 0.92 5.4.1 ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ............................................. . ... .... 92 5.4.1.1 ผลกระทบต่อการขับ ABTS • + ............... ... ...... 0.93 5.4.1.2 ยับยั้งการ peroxidation ลิโปโซม ............... . ... 96 5.4.2 HPLC ......................................................... .. ......... 99 5.4.3 ความสัมพันธ์ระหว่างสารต้านอนุมูลอิสระ PPO กิจกรรมและภาพสี .......................................... ... 101 5.5 สรุปผลการวิจัย ............................................................ ... ......... 0.104 บทที่ 6: สรุปโดยรวม ........................... .. ............... ... 105 อ้างอิง ..................................................................... . ............ ..107 VITA ............................................. .............................. . .................. ..127

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การศึกษาคุณลักษณะของเอนไซม์โพลีฟีนอล สารต้านอนุมูลอิสระจาก

ปากท้อง ( asimina tribola ) ผลไม้

ตอนที่ 1 : บทนำ ......................................................... 1
บทที่ 2 ทบทวนวรรณกรรม
2.1 . ปากท้อง ............................................................................ 4
2.1.1 . ปากท้องชีววิทยา ...................................................... 4
2.1.2 . 6
2 ................................................ ปากท้องผลไม้เป็นอาหารอาหารการ ..................................................................
7 ร . ไม่ใช่สีน้ำตาล ........................................... 7
2.2.1.1 . ปฏิกิริยา Maillard .............................................. 7
2.2.1.2 . กรดแอสคอร์บิคออกซิเดชัน ........................................ 8
2.2.1.3 . คาราเมล .................................................... 8
2.2.2 . สีน้ำตาล .................................................. 9
2.2.2.1 .polyphenol oxidase ( PPO ) .................................. 9
2.2.2.2 . ปัจจัยที่มีผลต่อกิจกรรมของเอนไซม์ PPO ............................. 12
2.2.2.2.1 . เอนไซม์ที่ใช้งานเว็บไซต์ ................................... 12
2.2.2.2.2 . กลุ่มเทียม .................................... 12
2.2.2.2.3 . อ การพึ่งพา ....................................... 14
2.2.2.2.4 . พึ่งพาอุณหภูมิ ........................... 14
2.2.2.3 . การยับยั้ง PPO ........................................... 15