Depending on the species examined,

Depending on the species examined, lipid droplets have been previously
reported to contain from40 to 300 different proteins [39–43]. We
performed proteomic analysis on three biological replicates of N2 and
daf-2. Our lipid droplet proteome analysis confidently identified 354
proteins belonging to various functional classes including lipid metabolism,
other metabolism, transcription and translation, ribosome,
trafficking and transport, cytoskeleton, chaperones, and signal transduction
(Table 1, Table S2).
To estimate protein abundance we used a spectrum counting approach
[44] in which the number of MS/MS spectrum identifications
of the peptides belonging to a given protein were normalized (divided)
by protein length (Supplemental Table 2 and Table 1). For further analysis,
we focused on the top 100 most abundant proteins. The most
abundant protein was MDT-28. Even though this protein shares sequence
similarity to transcriptional mediator complex, it also contains
an N-terminal domain similarity to pfam 03036, which is a conserved
domain associated with the Perilipin family [10] (Supplemental
Fig. 1). Perilipins are conserved structural components of lipid droplets
that regulate lipid storage and hydrolysis [10].
The most striking difference we found between the lipid droplet
proteomes of wild type and the long-lived, high fat daf-2 mutants was
in the abundance of MDT-28 protein. The daf-2 lipid droplets, which
are larger than wild type, contain relatively less MDT-28 protein, approximately
70% of wild type. This indicates that MDT-28 protein
might be an important regulator of lipid droplet metabolism. Besides
the difference in MDT-28 protein in wild type vs. daf-2, very few other
proteins showed differential abundance in these strains, only 10/354
proteins (2.8%) showed significantly different abundance in daf-2 vs.
wild type C. elegans, with 8/10 proteins showing reduced abundance
in the lipid droplets of daf-2 mutants (Table S2). To determine the roles of lipid droplet proteins in C. elegans growth
and fat accumulation,we performed RNAi knockdown using the feeding
method, focusing on the top 100 most abundant C. elegans LD proteins
(Table 1). Of the 37 non-ribosomal/translation factor proteins, we obtained
21 sequence-verified RNAi constructs. Nine out of 21 showed
an RNAi phenotype of arrested growth or sterility. Of the 63 ribosome/
translation factor genes, we knocked down a subset of 18 of them. Of
this class, all 18 resulted in arrested growth. Thus, of the set of 37
genes knocked down using RNAi, we found an enrichment of essential
genes (73%). This is a much higher proportion of essential genes than
have been typically identified in whole genome RNAi screens, revealing
approximately 10% essential genes [45] (Table 1).
We stained the RNAi treated nematodes with post-fix Nile red to assess
fat accumulation at the young adult stage. Fat accumulation depends
on growth stage, so we were careful to synchronize worms and
stain all strains after the L4-YA molt, but before the formation of eggs.
In the 21 non-ribosomal knockdowns, we stained the 12 normal growing
strains and found six of them affect fat accumulation: acs-4, cey-2,
and vit-6 RNAi resulted in increased fat accumulation, while tkt-1, ant-
1.1, and mdt-28 showed reduced fat (Fig. 2). In the arrested treatments,
including the ribosomal/translation class, we waited until L3 stage to
shift wild type worms to RNAi treatment and stained for fat 24 h later.
Of the nine non-ribosomal strains, five affected fat accumulation. Of
the 18 ribosomal/translation factor strains, four affected fat accumulation
(Fig. 2). Overall, 14/37 strains, 38% showed changes in fat accumulation,
much higher than the percentage of fat regulatory genes in the
overall genome. For example, in a recent study 37/1600 genes (2.3%)
were identified that affected lipid accumulation [46]. Thus, our functional
studies demonstrate that lipid droplet associated proteins are
enriched for essential proteins as well as proteins that influence fat accumulation
in C. elegans.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์ที่ตรวจสอบ หยดไขมันได้ก่อนหน้านี้รายงานมี from40 กับโปรตีนอื่น 300 [39 – 43] เราดำเนินการวิเคราะห์ proteomic ในสามชีวภาพสามารถจำลองของ N2 และเยอรมัน-2 ของเราไขมันหยด proteome วิเคราะห์ระบุ– 354ของการเรียนการทำงานต่าง ๆ รวมทั้งเผาผลาญไขมัน โปรตีนอื่น ๆ เผาผลาญ transcription และแปล ไรโบ โซมการค้า และการขนส่ง cytoskeleton, chaperones และสัญญาณ transduction(ตาราง 1, S2 ตาราง)การประเมินความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีน เราใช้สเปกตรัมเป็นวิธีการตรวจนับ[44] ในการหมายเลขของรหัสสเปกตรัม MS/MSของเปปไทด์ของโปรตีนให้ได้ตามปกติ (ถูกแบ่ง)โดยความยาวโปรตีน (เพิ่มเติมตาราง 2 และตารางที่ 1) สำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติมเราเน้นโปรตีนมากที่สุด 100 สูงสุด มากสุดโปรตีนที่อุดมสมบูรณ์ถูก MDT 28 ถึงแม้ว่า โปรตีนนี้ใช้ลำดับคล้ายคลึงกับผู้ไกล่เกลี่ย transcriptional ซับซ้อน นอกจากนี้ยังประกอบด้วยมี N-เทอร์มินัลโดเมนคล้ายกับ pfam 03036 ซึ่งเป็นการนำโดเมนที่เกี่ยวข้องกับครอบครัวอย่างไร Perilipin [10] (SupplementalFig. 1) Perilipins จะนำส่วนประกอบโครงสร้างของหยดไขมันที่กำหนดจัดเก็บไขมันและไฮโตรไลซ์ [10]ความแตกต่างโดดเด่นที่สุดที่เราพบระหว่างหยดไขมันproteomes ชนิดป่าและ long-lived สูงไขมันเยอรมัน 2 สายพันธุ์คือในความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีน MDT 28 หยดไขมัน 2 เยอรมัน ที่มีขนาดใหญ่กว่าป่าชนิด ประกอบด้วยโปรตีนค่อนข้างน้อย MDT 28 ประมาณ70% ของป่าชนิด บ่งชี้ว่า โปรตีน MDT 28อาจมีการควบคุมที่สำคัญของหยดไขมัน สำรองห้องพักความแตกต่างของชนิดป่าเทียบกับเยอรมัน 2 มากสิ่งอื่น ๆ โปรตีน MDT 28โปรตีนแสดงให้เห็นความแตกต่างในสายพันธุ์เหล่านี้ เฉพาะ 10/354โปรตีน (2.8%) แสดงให้เห็นความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญใน vs เยอรมัน 2ป่าชนิด C. elegans มีโปรตีน 8/10 ที่แสดงลดราคามากมายในหยดไขมันของเยอรมัน 2 สายพันธุ์ (ตาราง S2) เพื่อกำหนดบทบาทของไขมันหยดโปรตีนในการเจริญเติบโตของ C. elegansและสะสมไขมัน เราทำ knockdown RNAi ที่ใช้ในอาหารวิธี การเน้นโปรตีน 100 อันดับแรกมากที่สุด C. elegans LD(ตาราง 1) ของโปรตีนปัจจัยไม่-ribosomal/แปล 37 เรารับ21 ตรวจสอบลำดับ RNAi โครงสร้าง เก้าของ 21 แสดงให้เห็นว่าผิด phenotype RNAi เติบโตจับกุมหรือ sterility ของไรโบโซม 63 /แปลตัวยีน เราโบว์ลิ่งลงย่อย 18 ของพวกเขา ของเรียน 18 ทั้งหมดส่งผลให้อัตราการเติบโตที่จับกุม ดังนั้น ของชุด 37โบว์ลิ่งลงใช้ RNAi ยีน เราพบความโดดเด่นของจำเป็นยีน (73%) นี้เป็นมากขึ้นสัดส่วนของยีนที่สำคัญกว่าได้รับการระบุโดยปกติในหน้าจอ RNAi ทั้งจีโนม เปิดเผยประมาณ 10% จำเป็นยีน [45] (ตารางที่ 1)เราสี nematodes RNAi ที่ถือว่า มีแม่น้ำไนล์แก้ไขหลังแดงประเมินสะสมไขมันในขั้นผู้ใหญ่หนุ่มสาว ขึ้นอยู่กับไขมันสะสมในระยะการเจริญเติบโต ดังนั้นเราไม่ระวังให้หนอน และติดสายพันธุ์ทั้งหมดหลังจาก L4-ยา molt แต่ก่อนการก่อตัวของไข่ใน knockdowns ไม่ใช่ ribosomal 21 เราสีเติบโตปกติ 12สายพันธุ์และพบหกของพวกเขามีผลต่อไขมันสะสม: acs-4, cey-2และวิตามิน-6 RNAi ให้เพิ่มสะสมไขมัน ในขณะที่ tkt-1 มด-1.1 และแสดงให้เห็นว่า 28 mdt ลดไขมัน (Fig. 2) ในการจับกุมการรักษารวมถึงเรียน ribosomal/แปล เรารอจนถึงระยะ L3 จะป่ากะพิมพ์หนอนรักษา RNAi และสีสำหรับไขมัน 24 ชมในภายหลังของสายพันธุ์การจองเก้าไม่ใช่ ribosomal, 5 ผลกระทบสะสมไขมัน ของ18/แปล ribosomal ปัจจัยสายพันธุ์ 4 ผลกระทบสะสมไขมัน(Fig. 2) โดยรวม 14/37 สายพันธุ์ 38% แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงในการสะสมไขมันสูงกว่าเปอร์เซ็นต์ของไขมัน regulatory ยีนในการกลุ่มโดยรวม ตัวอย่าง ในการล่าศึกษายีน 37/1600 (2.3%)ระบุที่ได้รับผลกระทบสะสมไขมัน [46] ดังนั้น เราทำงานการศึกษาแสดงให้เห็นถึงโปรตีนไขมันหยดที่เกี่ยวข้องอุดมไปจำเป็นโปรตีนเป็นโปรตีนที่มีผลต่อการสะสมไขมันใน C. elegans

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์ที่ตรวจสอบหยดไขมันที่ได้รับก่อนหน้านี้มีรายงานว่าจะมี from40 ถึง 300 โปรตีนที่แตกต่างกัน [39-43]
เราดำเนินการวิเคราะห์โปรตีนสามซ้ำทางชีวภาพของ N2 และ DAF-2 ไขมันในเลือดหยดของเราวิเคราะห์โปรตีนมั่นใจระบุ 354 โปรตีนที่อยู่ในชั้นเรียนการทำงานต่าง ๆ รวมทั้งการเผาผลาญไขมัน, การเผาผลาญอาหารอื่น ๆ ถอดความและแปลไรโบโซม, การค้าและการขนส่ง, โครงร่างของเซลล์, ครูใหญ่และสัญญาณ(ตารางที่ 1 ตารางที่ S2). เพื่อประเมินความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีน เราใช้วิธีการนับคลื่นความถี่[44] ซึ่งในจำนวน MS / MS ระบุสเปกตรัมของเปปไทด์ที่เป็นโปรตีนที่กำหนดถูกปกติ (แบ่ง) โดยความยาวโปรตีน (เพิ่มเติมตารางที่ 2 และตารางที่ 1) สำหรับการวิเคราะห์ต่อไปเราจะมุ่งเน้นไปที่ด้านบน 100 โปรตีนที่มีมากที่สุด มากที่สุดของโปรตีนที่อุดมสมบูรณ์เป็น MDT-28 แม้ว่าโปรตีนลำดับหุ้นนี้มีความคล้ายคลึงกันในการถอดรหัสคนกลางที่ซับซ้อนก็ยังมีความคล้ายคลึงกันโดเมนN-terminal เพื่อ Pfam 03036 ซึ่งเป็นป่าสงวนโดเมนที่เกี่ยวข้องกับครอบครัวPerilipin [10] (เพิ่มเติมรูปที่1). Perilipins ป่าสงวนส่วนประกอบโครงสร้างของหยดไขมันที่ควบคุมการจัดเก็บไขมันและย่อยสลาย[10]. ความแตกต่างที่โดดเด่นที่สุดที่เราพบระหว่างหยดไขมันproteomes ของป่าประเภทและระยะยาว, ไขมันสูง DAF-2 กลายพันธุ์เป็นในความอุดมสมบูรณ์ของMDT โปรตีน -28 หยดไขมัน DAF-2 ซึ่งมีขนาดใหญ่กว่าชนิดป่ามีค่อนข้างน้อยโปรตีนMDT-28 ประมาณ70% ของป่าประเภท นี้บ่งชี้ว่าโปรตีน MDT-28 อาจจะมีการควบคุมที่สำคัญของการเผาผลาญไขมันในเลือดหยด นอกจากนี้ความแตกต่างในโปรตีน MDT-28 ในรูปแบบป่ากับ DAF-2, อื่น ๆ น้อยมากโปรตีนแสดงให้เห็นความอุดมสมบูรณ์ที่แตกต่างกันในสายพันธุ์เหล่านี้เพียง10/354 โปรตีน (2.8%) ที่แสดงให้เห็นความอุดมสมบูรณ์ที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญใน DAF-2 เทียบกับป่าประเภทC . elegans มีโปรตีน 8/10 เผยให้เห็นความอุดมสมบูรณ์ลดลงในหยดไขมันของDAF-2 กลายพันธุ์ (ตารางที่ S2) การตรวจสอบบทบาทของโปรตีนหยดไขมันใน C. elegans การเจริญเติบโตและการสะสมไขมันที่เราดำเนินการRNAi ล้มลงโดยใช้การให้อาหารวิธีการมุ่งเน้นไปที่ด้านบน100 มากที่สุด C. elegans โปรตีน LD (ตารางที่ 1) 37 ที่ไม่โซมอล / แปลโปรตีนปัจจัยที่เราได้รับ21 ลำดับการตรวจสอบโครงสร้าง RNAi เก้าออกจาก 21 แสดงให้เห็นว่าฟีโนไทป์RNAi ของการเจริญเติบโตจับกุมหรือเป็นหมัน ของไรโบโซม 63 / แปลยีนปัจจัยที่เราล้มลงส่วนหนึ่งของ 18 จากพวกเขา ของชั้นนี้ทั้ง 18 ส่งผลในการเจริญเติบโตจับกุม ดังนั้นชุดของ 37 ยีนล้มลงโดยใช้ RNAi เราพบว่ามีการเพิ่มคุณค่าของสิ่งจำเป็นยีน(73%) นี้เป็นสัดส่วนที่สูงมากของยีนที่สำคัญกว่าที่ได้รับการระบุโดยทั่วไปในจีโนมทั้งหน้าจอ RNAi เผยให้เห็นประมาณ10% ยีนที่สำคัญ [45] (ตารางที่ 1). เราสี RNAi รับการรักษาไส้เดือนฝอยที่มีการโพสต์แก้ไขแดงแม่น้ำไนล์ในการประเมินการสะสมไขมันในขั้นตอนวัยหนุ่มสาว การสะสมไขมันขึ้นอยู่ในระยะการเจริญเติบโตดังนั้นเราจึงระมัดระวังในการประสานเวิร์มและคราบทุกสายพันธุ์หลังจากลอกคราบL4-YA แต่ก่อนที่การก่อตัวของไข่. ใน 21 ที่ไม่โซมอล knockdowns เราสี 12 การเจริญเติบโตปกติสายพันธุ์และพบว่าหกของพวกเขาส่งผลกระทบต่อการสะสมไขมัน: ACS-4, CEY-2, และไก่ RNAi-6 ส่งผลให้เกิดการสะสมไขมันเพิ่มขึ้นในขณะที่ TKT-1 ant- 1.1 และ MDT-28 แสดงให้เห็นว่าลดไขมัน (. รูปที่ 2) ในการรักษาที่ถูกจับกุมที่รวมทั้งโซมอล / ระดับการแปลที่เรารอจนกว่าขั้นตอน L3 จะเปลี่ยนหนอนป่าประเภทการรักษาRNAi สีและไขมัน 24 ชั่วโมงต่อมา. เก้าสายพันธุ์ที่ไม่โซมอลห้าการสะสมไขมันได้รับผลกระทบ ของ18 โซมอล / แปลสายพันธุ์ปัจจัยที่สี่การสะสมไขมันได้รับผลกระทบ(รูปที่. 2) โดยรวม, 14/37 สายพันธุ์ 38% แสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงในการสะสมไขมันมากขึ้นกว่าร้อยละของการกำกับดูแลยีนไขมันในจีโนมโดยรวม ยกตัวอย่างเช่นในการศึกษาล่าสุดที่ 37/1600 ยีน (2.3%) ที่ถูกระบุว่าได้รับผลกระทบการสะสมไขมัน [46] ดังนั้นการทำงานของเราการศึกษาแสดงให้เห็นว่าหยดไขมันโปรตีนร่วมอุดมโปรตีนที่จำเป็นเช่นเดียวกับโปรตีนที่มีอิทธิพลต่อการสะสมไขมันในC. elegans

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ขึ้นอยู่กับชนิดตรวจไขมันพบได้รับก่อนหน้านี้
รายงานประกอบด้วย from40 300 โปรตีนแตกต่างกัน [ 39 – 43 ] เราทำการวิเคราะห์โปรตีนใน
3 ซ้ำทางชีวภาพของ N2 และ
daf-2 . ของเรา ไขมันแตกตัว การวิเคราะห์โปรตีนก็ระบุ 354
โปรตีนเป็นของบทเรียนการทำงานต่างๆรวมทั้งการเผาผลาญไขมัน
การเผาผลาญอาหารอื่น ๆการถอดความและแปล ไรโบโซม
, การค้าและการขนส่งขาดตอน คนติดตาม และส่งสัญญาณ ,
( ตารางที่ 1 ตาราง S2 )
เพื่อประเมินความอุดมสมบูรณ์โปรตีนที่เราใช้สเปกตรัมนับแนวทาง
[ 44 ] ซึ่งในจำนวนของ MS / MS สเปกตรัมการแสดงตัวของ
ของเปปไทด์ของโปรตีนปกติ ( ให้ แบ่งตามความยาวของโปรตีน )
( โต๊ะเสริม 2 และตารางที่ 1 )สำหรับการวิเคราะห์ต่อไป
เราเน้นในด้านบน 100 สุดมากมาย โปรตีน ที่สุด
มากมายของโปรตีน mdt-28 . แม้ว่าโปรตีนหุ้นลำดับ
ความคล้ายคลึงกับ particle คนกลางที่ซับซ้อนนอกจากนี้ยังมีความคล้ายคลึงกับกรดอะมิโน
เป็นโดเมน pfam 03036 ซึ่งเป็นป่าสงวน
โดเมนที่เกี่ยวข้องกับครอบครัว perilipin [ 10 ] ( เสริม
รูปที่ 1 )perilipins อนุรักษ์องค์ประกอบโครงสร้างของไขมันหยด
ที่ควบคุมไขมันกระเป๋าย่อย [ 10 ] .
ที่โดดเด่นที่สุดที่เราพบความแตกต่างระหว่างไขมันแตกตัว
proteomes ชนิดป่าและจีรัง ไขมันสูง daf-2 โคโลนี
ในความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีน mdt-28 . หยดไขมัน daf-2 ซึ่ง
มีขนาดใหญ่กว่าป่าชนิด มีค่อนข้างน้อยประมาณ
mdt-28 โปรตีน70% ของป่าประเภท นี้บ่งชี้ว่า
โปรตีน mdt-28 อาจจะควบคุมที่สำคัญของไขมันแตกตัว การเผาผลาญ นอกจากนี้
ความแตกต่างใน mdt-28 โปรตีนในป่าประเภท กับ daf-2 โปรตีนอื่น ๆน้อยมาก พบความแตกต่าง
อุดมสมบูรณ์ในสายพันธุ์เหล่านี้ เท่านั้น 10 / 354
โปรตีน ( 2.8% ) พบว่าแตกต่างกันมากมายใน daf-2 vs
ประเภทซี ถิ่นป่า ,กับ 8 / 10 โปรตีนแสดงลดลงความอุดมสมบูรณ์
ในไขมันหยด daf-2 กลายพันธุ์ ( ตาราง S1 ) เพื่อศึกษาบทบาทของไขมันแตกตัว โปรตีนในการเจริญเติบโตและการสะสมไขมัน
C . ถิ่นเราดำเนินการหาวิธีน็อคโดยใช้อาหาร
เน้นด้านบน 100 ชุกชุมมากที่สุดค . ถิ่น LD โปรตีน
( ตารางที่ 1 ) ของ 37 ไม่แปลโปรตีน Protein ปัจจัย เรารับ
ลำดับ 21 ตรวจสอบหาโครงสร้าง . 9 จาก 21 พบ
หาจับการเจริญเติบโตหรือการเป็นหมัน ของ 63 ไรโบโซม /
ปัจจัยการแปลยีน เราล้มลง เป็นเซตย่อยของ 18 ของพวกเขา ของ
ชั้นนี้ทั้งหมด 18 ( จับ ) ดังนั้นของชุด 37
ยีนล้มลงการใช้ RNAi , เราพบว่ามีการเสริมที่จำเป็น
ยีน ( 73% )นี้เป็นมากขึ้นจำเป็นกว่าสัดส่วนของยีน
ได้รับมักจะระบุในทั้งจีโนม RNAi หน้าจอเปิดเผย
ประมาณ 10% ที่สำคัญยีน [ 45 ] ( ตารางที่ 1 ) .
เราเปื้อนหาเลี้ยงไส้เดือนฝอยกับโพสต์แก้ไขไนล์เรดประเมิน
ไขมันสะสมที่เวทีผู้ใหญ่หนุ่มสาว การสะสมไขมันขึ้นอยู่กับ
ในการเจริญเติบโต ดังนั้นเราระมัดระวังประสานหนอน
คราบทุกสายพันธุ์ หลัง l4-ya ลอกคราบ แต่ก่อนการก่อตัวของไข่ .
ใน 21 ไม่ knockdowns ไรโบโซมเราเปื้อน 12 ปกติเติบโต
สายพันธุ์และพบหกของพวกเขามีผลต่อการสะสมไขมัน : acs-4 cey-2
, , vit-6 RNAi และทำให้เพิ่มการสะสมของไขมัน ในขณะที่ tkt-1 , มด -
1.1 และ mdt-28 ให้ไขมันลดลง ( รูปที่ 2 ) ในจับ
, การรักษารวมถึงชั้นเรียนไรโบโซม / แปล เราต้องรอจนกว่าขั้นตอน L3

กะป่าประเภทเวิร์มเพื่อหาการรักษาคราบไขมัน 24 ชั่วโมงต่อมา .
ของเก้าไม่มีไรโบโซมสายพันธุ์ได้รับการสะสมไขมัน ของ
18 สายพันธุ์ Protein / แปล , ปัจจัยมีผลต่อการสะสมไขมัน 4
( รูปที่ 2 ) โดยรวมแล้ว 14 / 37 สายพันธุ์ ร้อยละ 38 พบการเปลี่ยนแปลงในการสะสมไขมัน
สูงกว่าร้อยละของไขมันที่มียีนใน
จีโนมทั้งหมด ตัวอย่างเช่นในการศึกษายีนล่าสุด 37 / 1600 ( 2.3% )
ถูกระบุที่มีผลต่อการสะสมไขมัน [ 46 ] ดังนั้น การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าการทำงาน

ที่อุดมด้วยโปรตีนไขมันแตกตัวที่โปรตีนเป็นโปรตีนที่จำเป็นต่อ การสะสมไขมันในถิ่น
C .