2.3. Cell culture, transfection and

2.3. Cell culture, transfection and reporter activity assay
TO cells were seeded in 24-well plates (Nunc) at a density of
2  105 cells per well. The cells were transfected using 10 ml Neon®
Transfection System (Invitrogen, Carlsbad, CA) with 10 ml buffer R
and 500 n plasmid in each well, and using 2 pulses of 1100 V and
30 ms each. In each well, cells were transfected with 50 ng ofRenilla luciferase vector (Promega, Madsion, WI), 150 ng of pA1(-
202), 150 ng of either pIRF1, pIRF3 pIRF7A, pIRF7B or pIPS-1, and
150 ng of either ps7ORF1, ps8ORF2 or control vector pcDNA3.1. The
transfected TO cells were harvested after 48 h. According to manufacturer's
instruction, the cells were lysed by 70 ml 1  passive
lysis buffer from Dual-Luciferase® reporter assay system (Promega,
Madsion, WI). Ten microliters of lysate was dispensed with 100 ml of
luciferase assay buffer II to measure the Renilla luciferase activity
for normalization of transfection efficiency. Then the firefly luciferase
activity was recorded after adding 100 ml of Stop & Glo buffer
in the same well. Both luciferase activity assays were documented
using a plate Luminometer, Luminoskan Ascent (Thermo Scientific,
Beverly, MA). All samples for promoter assay were set up in triplicates
and the results were presented as relative luciferase activities.
All luciferase reporter assays were repeated at least three times.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. ทดสอบเซลล์วัฒนธรรม transfection และข่าวกิจกรรมเซลล์ถูกเตรียมในดี 24 แผ่น (Nunc) ที่ความหนาแน่นของ2 105 เซลล์ต่อดี เซลล์ถูก transfected ใช้ 10 มล. Neon®ระบบ transfection (Invitrogen คาร์ลบาด CA) บัฟเฟอร์ 10 ml Rและ 500 n plasmid ในแต่ละดี และใช้ 2 กะพริบของ V และ30 ms แต่ละ ในแต่ละดี เซลล์ถูก transfected กับ 50 ฉบับ ofRenilla luciferase เวกเตอร์ (Promega, Madsion, WI), 150 ฉบับของ pA1 (-202), 150 ฉบับของ pIRF1, pIRF3 pIRF7A, pIRF7B หรือจุด-1 และ150 ฉบับของ ps7ORF1, ps8ORF2 หรือการควบคุมเวกเตอร์ pcDNA3.1 การtransfected เป็นเซลล์เก็บเกี่ยวหลังจาก 48 ชั่วโมง ตามของผู้ผลิตคำแนะนำ เซลล์ถูก lysed โดย 70 ml 1 แฝงlysis บัฟเฟอร์จาก Dual-Luciferase® โปรแกรมรายงานการทดสอบระบบ (PromegaMadsion, WI) Microliters สิบของ lysate ของถูกจ่าย มี 100 มล.บัฟเฟอร์การทดสอบ luciferase II วัดกิจกรรม luciferase Renillaสำหรับการฟื้นฟูประสิทธิภาพ transfection แล้ว luciferase หิ่งห้อยกิจกรรมบันทึกหลังจากเพิ่ม 100 มล.ของบัฟเฟอร์และ Gloในบ่อเดียวกัน Assays ทั้งกิจกรรม luciferase ถูกได้ใช้จาน Luminometer, Luminoskan ขึ้น (เทอร์โมวิทยาศาสตร์เบเวอร์ลี่ MA) ตัวอย่างทั้งหมดสำหรับผู้ทดสอบตั้งขึ้นใน triplicatesและมีแสดงผลเป็นกิจกรรมสัมพันธ์ luciferaseทั้งหมด luciferase ข่าว assays ซ้ำกันน้อยครั้งที่สาม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 การเพาะเลี้ยงเซลล์, transfection และผู้สื่อข่าวกิจกรรมการทดสอบ
กับเซลล์เมล็ดในแผ่น 24 หลุม (Nunc) ความหนาแน่นของ
2? 105 เซลล์ต่อกัน เซลล์ถูก transfected ใช้ 10 มล. Neon®
ระบบมีเดีย (Invitrogen, Carlsbad, CA) 10 มล. บัฟเฟอร์ R
และ 500 N พลาสมิดในแต่ละอย่างดีและใช้ 2 พัลส์ 1100 V และ
30 มิลลิวินาทีในแต่ละ ในแต่ละดีเซลล์ถูก transfected 50 NG ofRenilla luciferase เวกเตอร์ (Promega, Madsion, WI) 150 NG ของ PA1 (-
202) 150 NG ทั้ง pIRF1, pIRF3 pIRF7A, pIRF7B หรือ pips-1 และ
150 นาโนกรัมทั้ง ps7ORF1, ps8ORF2 หรือการควบคุมเวกเตอร์ pcDNA3.1
transfected ไปยังเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 48 ชั่วโมง ตามที่ผู้ผลิตของ
การเรียนการสอนเซลล์ถูก lysed 70 มล. 1? เรื่อย ๆ
บัฟเฟอร์สลายจาก Dual-Luciferase®ระบบนักข่าวทดสอบ (Promega,
Madsion, WI) สิบไมโครลิตรของ lysate ถูกจ่าย 100 มิลลิลิตร
luciferase ทดสอบบัฟเฟอร์ครั้งที่สองในการวัดกิจกรรม luciferase Renilla
สำหรับการฟื้นฟูของประสิทธิภาพ transfection แล้ว luciferase หิ่งห้อย
กิจกรรมที่บันทึกไว้หลังจากเพิ่ม 100 มล. ของ Stop & Glo บัฟเฟอร์
ในดีเหมือนกัน การวิเคราะห์ทั้งสองกิจกรรม luciferase ได้รับการบันทึก
โดยใช้ Luminometer แผ่น Luminoskan Ascent (Thermo Scientific,
Beverly, MA) ตัวอย่างทั้งหมดสำหรับการทดสอบก่อการตั้งอยู่ใน triplicates
และผลลัพธ์ที่ได้นำเสนอเป็นกิจกรรม luciferase ญาติ.
ทั้งหมดตรวจนักข่าว luciferase ซ้ำอย่างน้อยสามครั้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การเพาะเลี้ยงเซลล์และการทดสอบสำหรับนักข่าว , กิจกรรมเซลล์ถูก seeded ใน 24 ดีแผ่น ( ขณะนี้ ) ในอัตราความหนาแน่นของ2 ) เซลล์ ต่อด้วย เซลล์ก็ transfected ใช้®นีออน 10 มล.ระบบสำหรับ ( Invitrogen Carlsbad , CA , ) กับ 10 R กันชนมลและ 500 N พลาสมิดในแต่ละหลุม และใช้ 2 กะพริบ 1 , 100 และ30 นางสาวแต่ละ ในแต่ละเซลล์มี transfected ดี กับ 50 ของ ofrenilla เวกเตอร์เอนไซม์ลูซิเฟอเรส ( promega แมดิ น , , WI ) , 150 นาโน pa1 ( -202 ) , 150 นาโนให้ pirf1 pirf3 pirf7a pirf7b หรือ pips-1 , , , และ150 นาโนให้ ps7orf1 ps8orf2 , หรือควบคุม pcdna3.1 เวกเตอร์ ที่transfected เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 48 ชั่วโมง ตามผู้ผลิตการสอน เซลล์ก็ lysed 70 ml 1 เรื่อยๆจากการสลายบัฟเฟอร์คู่ลูซิเฟอเรส®การทดสอบระบบ ( promega นักข่าว ,แมดิ น วี ) 10 ตัวเลขของ lysate คือจ่าย 100 มิลลิลิตรบัฟเฟอร์ ( ลูซิเฟอเรส 2 วัด renilla ลูซิเฟอเรส กิจกรรมสำหรับการฟื้นฟูประสิทธิภาพสำหรับ . แล้วหิ่งห้อยลูซิเฟอเรสกิจกรรมบันทึกหลังจากเพิ่ม 100 มิลลิลิตรของหยุดฯบัฟเฟอร์ในแบบเดียวกันด้วย ทั้งกิจกรรมเอนไซม์ลูซิเฟอเรส ( เอกสาร )ใช้จานลูมิโนมิเตอร์ luminoskan ทางขึ้น ( เทอร์โม , วิทยาศาสตร์เบเวอร์ลี , MA ) ตัวอย่างสำหรับการตั้งค่าการทดสอบมี 3 ซ้ำและผลลัพธ์ที่ได้ แสดง เป็น กิจกรรมเอนไซม์ลูซิเฟอเรส ญาตินักข่าวลูซิเฟอเรสสามารถเป็นเวลาอย่างน้อยสามครั้ง