2.6. Cloning and sequencing of the

2.6. Cloning and sequencing of the MBV PCR amplicon
The PCR reaction mixture containing the amplified
261 bp product was purified using QIAquick
PCR purification kit (Qiagen, Valencia, CA) following
the manufacturer’s protocol. The DNA concentration
was determined at 260 nm using a
BioPhotometer (Eppendorf, Germany). Purified
DNA was cloned into the pGEM-T Easy vector
(Promega, Madison, WI) and transformed into
Escherichia coli JM109 competent cells. The recombinant
clones were identified by white colonies
on X-Gal and IPTG plates. The plasmid DNA was
purified using the Perfectprep plasmid mini kit
(Qiagen, Valencia, CA) according to the manufacturer’s
protocol and this DNA was used as the PCR
positive control template and for determination of
the sensitivity of the assay. The PCR products were
sequenced with an automated DNA sequencer ABI
Prism 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA)
at the sequencing facility of the University of
Arizona.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 การโคลน และลำดับเบสของ amplicon MBV PCRส่วนผสมของปฏิกิริยา PCR ที่ประกอบด้วยการเอาต์261 bp ผลิตภัณฑ์ที่บริสุทธิ์ที่ใช้ QIAquickPCR ฟอกชุด (Qiagen, Valencia, CA) ต่อไปนี้โพรโทคอลของผู้ผลิต ความเข้มข้นของดีเอ็นเอกำหนดที่ 260 nm ใช้เป็นBioPhotometer (Eppendorf เยอรมนี) บริสุทธิ์ดีเอ็นเอถูกโคลนเป็นเวกเตอร์กลาย pGEM T(Promega เมดิสัน WI) และเปลี่ยนเป็นEscherichia coli JM109 เซลล์มีอำนาจ วททชระบุโคลน โดยอาณานิคมสีขาวบนแผ่น X-กัลและ IPTG Plasmid มีดีเอ็นเอบริสุทธิ์ใช้ชุดมินิของ plasmid Perfectprep(Qiagen, Valencia, CA) ตามของผู้ผลิตมีใช้โพรโทคอลและดีเอ็นเอนี้เป็น PCRแม่บวกควบคุม และกำหนดความไวของการทดสอบ ผลิตภัณฑ์ PCRเรียงลำดับ ด้วย ABI sequencer ดีเอ็นเอเป็นแบบอัตโนมัติปริซึม 377 (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA)ที่สิ่งอำนวยความสะดวกการจัดลำดับของมหาวิทยาลัยอริโซนา

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 การโคลนและการหาลำดับเบสของ PCR MBV amplicon
ผสมปฏิกิริยา PCR ที่มีการขยาย
สินค้า 261 bp บริสุทธิ์โดยใช้ QIAquick
ชุดฟอก PCR (Qiagen, วาเลนเซีย, CA) ตาม
โปรโตคอลของผู้ผลิต ความเข้มข้นของดีเอ็นเอ
ถูกกำหนดที่ 260 นาโนเมตรโดยใช้
Biophotometer (Eppendorf, เยอรมนี) บริสุทธิ์
ดีเอ็นเอเป็นโคลนเข้าไปใน pGEM-T ง่ายเวกเตอร์
(Promega, Madison, WI) และกลายเป็น
อีโค JM109 เซลล์อำนาจ recombinant
โคลนถูกระบุอาณานิคมสีขาว
ใน X-Gal และแผ่น IPTG พลาสมิดดีเอ็นเอถูก
ทำให้บริสุทธิ์โดยใช้พลาสมิด Perfectprep ชุดมินิ
(Qiagen, วาเลนเซีย, CA) ตามที่ผู้ผลิตของ
โปรโตคอลและ DNA นี้ถูกใช้เป็นวิธี PCR
แม่แบบการควบคุมในเชิงบวกและการกำหนด
ความไวของการทดสอบ ผลิตภัณฑ์ PCR ถูก
ติดใจกับซีเควนดีเอ็นเออัตโนมัติ ABI
ปริซึม 377 (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย)
ที่สถานที่จัดลำดับของมหาวิทยาลัย
แอริโซนา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 การโคลนและการจัดลำดับของดีเอ็นเอ และ MBV
เพื่อตรวจหาส่วนผสมที่มีปริมาณ
261 BP ผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์ใช้ชุดผลิต PCR qiaquick
( เพิ่ม , Valencia , CA ) โปรโตคอลต่อไปนี้
ผู้ผลิตของ DNA ความเข้มข้น
ตั้งใจที่ 260 nm ใช้
biophotometer ( เพนดอร์ฟ , เยอรมนี ) ถูกโคลนเข้าดีเอ็นเอบริสุทธิ์

( pgem-t เวกเตอร์ง่าย promega เมดิสันวี ) และกลายเป็น
Escherichia coli ที่มีความสามารถเซลล์ การโคลนยีนที่ถูกระบุโดยอาณานิคมผิวขาว

และ x-gal เอนไซม์บนแผ่น พลาสมิดดีเอ็นเอบริสุทธิ์โดยใช้พลาสมิด perfectprep

( เพิ่มชุดมินิ , Valencia , CA ) ตามพิธีสารและ DNA ของ
ผู้ผลิตนี้ถูกใช้เป็นแม่แบบและ PCR
บวกการควบคุมสำหรับการหา
ความไวของการทดสอบที่เพิ่มปริมาณยีนกับ DNA sequencer อัตโนมัติ

ปริซึม ABI 377 ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย )
ที่จัดลำดับสิ่งอำนวยความสะดวกของมหาวิทยาลัย
อาริโซน่า