2.6. Assessment of crude keratinase

2.6. Assessment of crude keratinase
2.6.1. Substrate specificity study
Keratinolytic protease activity was measured using different
substrates (Casein, Azocasein, Keratin, Skim milk, gelatin, albumin,
BSA and hemoglobin) at concentrations (0e4 mg mL
1). The
MichaeliseMenten constant (Km) and the maximum velocity (Vmax)
were calculated by LineweavereBurk plot.
2.6.2. Effect of temperature and pH on activity and stability
The effect of pH on enzyme activity was determined by
measuring protease activity at pH 6e12 using the following buffers:
Na2HPO4eNaH2PO4 (pH 6e8), Tris-HCL (pH 8.5e9.5) and NaOHGlycin
(pH 10e12). Determination of protease activity was done
with the following modifications: the 0.5 mL enzyme sample was
pre-incubated with 0.25 mL of 50 mM above listed buffer solution
for 0e3 days at room temperature. Then 0.25 mL pre-incubated
enzyme solution was added to 0.1 mL azocasein solution and
then incubated according to standard assay condition. The non-pretreated
enzyme which was left at room temperature was considered
as control (100%).
The effect of temperature on crude enzyme was examined at
50e100 C at pH 10. Thermal stability was determined by incubating
enzyme at 50e100 C and pH 10 for 0e180 h. Aliquots were
withdrawn at desired time intervals (20 min) to test the remaining
activity under standard assay conditions. The non-heated enzyme,
which was left at room temperature, was considered as control
(100%).
2.6.3. Stability with detergents, surfactants and oxidizing agents
The effects of some surfactants (Triton X-100, Tween 20,
Tween 80, and SDS) and oxidizing agents (DTT and b-mercaptoethanol)
were studied by pre-incubating the keratinolytic
protease with the agent for 3 h, pH 10.0, at 70 C, prior to activity
tests. The activity of the enzyme without any additive was taken
as 100%. Enzyme assay was performed under standard assay
condition.
2.6.4. Enzyme susceptibility to different protease inhibitors
The effects of PMSF, benzamidine, iodoacetic acid, EDTA and E-
64 on protease stability were investigated by pre-incubating the
crude keratinolytic protease for 3 h at room temperature with each inhibitor. Enzyme assays were carried out under standard assay
conditions.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 การประเมินของ keratinase ดิบ2.6.1. พื้นผิวที่ความศึกษาKeratinolytic รติเอสกิจกรรมมีวัดโดยใช้แตกต่างกันพื้นผิว (เคซีน Azocasein เครา นมพร่องมันเนย วุ้น albuminบีเอสเอและเฮโมโกลบิน) ที่ความเข้มข้น (0e4 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร 1) การMichaeliseMenten คง (กม.) และความเร็วสูงสุด (Vmax)มีคำนวณ โดยแปลง LineweavereBurk2.6.2. ผลของอุณหภูมิและค่า pH ในกิจกรรมและความมั่นคงผลของค่า pH เอนไซม์ถูกกำหนดโดยวัดรติเอสกิจกรรมที่ 6e12 ค่า pH โดยใช้บัฟเฟอร์ที่ต่อไปนี้:Na2HPO4eNaH2PO4 (ค่า pH 6e8), ทริ HCL (ค่า pH 8.5e9.5) และ NaOHGlycin(pH 10e12) การกำหนดกิจกรรมรติเอสเสร็จเรียบร้อยแล้วด้วยการปรับเปลี่ยนต่อไปนี้: เป็นตัวอย่างของเอนไซม์ 0.5 mLก่อนได้รับการกกกับ 50 มม.ด้านบนโซลูชันบัฟเฟอร์อยู่ 0.25 mLวัน 0e3 ที่อุณหภูมิห้อง แล้ว 0.25 มล.ก่อนได้รับการกกโซลูชั่นเอนไซม์ถูกเพิ่มลงในโซลูชัน azocasein 0.1 มล. และแล้ว มบ่มเลี้ยงตามมาตรฐานทดสอบเงื่อนไข ที่ไม่ใช่ pretreatedเอนไซม์ซึ่งถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องได้รับการพิจารณาเป็นการควบคุม (100%)ผลของอุณหภูมิในเอนไซม์ดิบได้รับการตรวจที่C 50e100 ที่ pH 10 กำหนดความร้อนเสถียรภาพ โดย incubatingเอนไซม์ 50e100 C และค่า pH 10 0e180 h. Aliquots ได้ถอนออกมาได้จนถึงช่วงเวลาที่ต้องการ (20 นาที) การทดสอบที่เหลือกิจกรรมภายใต้เงื่อนไขการทดสอบมาตรฐาน เอนไซม์ไม่ร้อนซึ่งถูกทิ้งที่อุณหภูมิห้อง ถือเป็นตัวควบคุม(100%)2.6.3 ความเสถียรกับผงซักฟอก ชนิด และสารผลกระทบของ surfactants บาง (Triton X-100 แต่ 20แต่ 80 และ SDS) และออกซิไดซ์ตัวแทน (DTT และ b-mercaptoethanol)ได้ศึกษา โดยล่วงหน้า incubating keratinolytic การรติเอสกับตัวแทนของ 3 ชม. ค่า pH 10.0 ที่ 70 C ก่อนกิจกรรมทดสอบ ถ่ายกิจกรรมของเอนไซม์โดยมีเป็น 100% ทดสอบเอนไซม์ดำเนินการภายใต้มาตรฐานวิเคราะห์สภาพ2.6.4. เอนไซม์ง่ายรตีเอสแตกต่างกันผลของ กรด iodoacetic benzamidine, PMSF EDTA และ E-64 เรื่องเสถียรรติเอสถูกตรวจสอบ โดย incubating ก่อนการรติเอส keratinolytic ดิบสำหรับ 3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องกับยับยั้งแต่ละ เอนไซม์ assays ที่ดำเนินการภายใต้มาตรฐานวิเคราะห์เงื่อนไขการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 การประเมินน้ำมันดิบเอนไซม์เคราติ
2.6.1 การศึกษาพื้นผิวจำเพาะ
Keratinolytic กิจกรรมโปรติเอสได้รับการวัดโดยใช้ที่แตกต่างกัน
พื้นผิว (เคซีน Azocasein, เคราติน, นมพร่องมันเนย, เจลาติน, อัลบูมิ,
บีเอสเอและฮีโมโกล) ที่ระดับความเข้มข้น (0e4 มิลลิกรัมมล? 1)
MichaeliseMenten คงที่ (กม) และความเร็วสูงสุด (Vmax)
จะถูกคำนวณโดย LineweavereBurk พล็อต.
2.6.2 ผลของอุณหภูมิและพีเอชอยู่กับกิจกรรมและความมั่นคง
ผลกระทบของค่า pH ในกิจกรรมของเอนไซม์ถูกกำหนดโดย
การวัดกิจกรรมโปรติเอสที่มีค่า pH 6e12 ใช้บัฟเฟอร์ต่อไปนี้:
Na2HPO4eNaH2PO4 (pH 6e8) Tris-HCL (pH 8.5e9.5) และ NaOHGlycin
(pH 10e12) ความมุ่งมั่นของกิจกรรมโปรติเอสที่ได้กระทำ
ด้วยการปรับเปลี่ยนต่อไปนี้: มลตัวอย่างเอนไซม์ 0.5 ถูก
pre-บ่มกับ 0.25 มิลลิลิตรขนาด 50 มมข้างต้นสารละลายบัฟเฟอร์ที่ระบุไว้
สำหรับวัน 0e3 ที่อุณหภูมิห้อง แล้ว 0.25 มลก่อนบ่ม
วิธีการแก้ปัญหาของเอนไซม์ถูกบันทึกอยู่ในวิธีการแก้ปัญหา 0.1 azocasein มิลลิลิตรและ
บ่มแล้วตามเงื่อนไขการทดสอบมาตรฐาน ไม่ใช่ปรับสภาพ
การทำงานของเอนไซม์ที่ถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องได้รับการพิจารณา
เป็นตัวควบคุม (100%).
ผลของอุณหภูมิต่อเอนไซม์ที่ถูกตรวจสอบ
50e100? C ที่ pH 10. เสถียรภาพทางความร้อนถูกกำหนดโดยการบ่ม
เอนไซม์ที่ 50e100? ซีและพีเอช 10 ชั่วโมง 0e180 aliquots ถูก
ถอนออกในช่วงเวลาที่ต้องการ (20 นาที) เพื่อทดสอบที่เหลือ
กิจกรรมภายใต้เงื่อนไขการทดสอบมาตรฐาน เอนไซม์ที่ไม่ใช่ความร้อน
ที่ถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องได้รับการพิจารณาเป็นตัวควบคุม
(100%).
2.6.3 ความมั่นคงกับผงซักฟอกลดแรงตึงผิวและสารออกซิไดซ์
ผลของบางอย่างลดแรงตึงผิว (Triton X-100, Tween 20
Tween 80 และ SDS) และตัวแทนออกซิไดซ์ (DTT และ B-mercaptoethanol)
กำลังศึกษาก่อนบ่ม keratinolytic
น้ำย่อยกับตัวแทน เวลา 3 ชั่วโมงค่า pH 10.0 ที่ 70 องศาเซลเซียสก่อนที่จะมีกิจกรรม
การทดสอบ กิจกรรมของเอนไซม์โดยไม่ต้องเติมแต่งใด ๆ ที่ถูกนำมา
เป็น 100% การทดสอบการทำงานของเอนไซม์ที่ได้ดำเนินการภายใต้การทดสอบมาตรฐาน
สภาพ.
2.6.4 เอนไซม์ที่ไวต่อการน้ำย่อยโปรตีนที่แตกต่างกัน
ผลของ PMSF, benzamidine กรด iodoacetic, EDTA และ E-
64 กับความมั่นคงโปรติเอสได้รับการตรวจสอบโดยก่อนการบ่ม
น้ำย่อย keratinolytic น้ำมันดิบ 3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องด้วยกันยับยั้ง เอนไซม์ได้ดำเนินการภายใต้การทดสอบมาตรฐาน
เงื่อนไข