Genomic DNA was isolated from Penic

Genomic DNA was isolated from Penicillium chrysogenum
cells by a modification of the Marmur method (Marmur,
1961). Cells were harvested in mid-exponential growth
phase by centrifugation (8000g for 10 min at 4 °C) and
suspended in TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA [pH
8.0]). Cells were treated with lysozyme (1 mg/ml) for
20 min and then treated with 0.5% sodium dodecyl sulfate
(SDS) and proteinase K (100 mg/ml) at 37 °C for 1 h,
subsequently 10% CTAB at 65 °C for 20 min. The lysate
was twice extracted with chloroform-isoamyl alcohol (24:1);
DNA was precipitated with 0.6 volumes of isopropanol and
harvested by centrifugation (10,000g for 15 min at 4 °C)
and re suspended in TE buffer.
Digestion of DNA with restriction endonucleases,
separation of fragments by agarose gel electrophoresis,
ligation of DNA fragments, transformation of E. coli with
plasmidic DNA and extraction of recombinant DNA were all
performed as described by Sambrook et al. (1989). DNA
fragments were recovered from low-melting agarose gels
using the Gel Extraction Kit of Takara.
Xylanase gene was amplified using Taq DNA
polymerase (Roche applied science) and the primers
specific for the coding region of xylB. Primer sequences
were the following: the forward primer was xylB-F: 5'-
GTGCACGTTCATAAAAGGAGGAAG- 3 and the reverse
primer was xylB-R: 5'-
GCCCAAGCTTGGGTTATTTTCCGCTT -3. Restriction
enzyme sites of XbaI and KpnI (underlined nucleotides in
the above sequences) were integrated into the 5’ end of
primers xylB -F and xylB -R, respectively. PCR reactions
were performed in a total volume of 25 µL containing 100
ng of template DNA, 1µM of each primers, 2 mM MgCl2, 5
µL of 10X PCR buffer, 200 µM dNTPs and 1 unit of Taq
DNA polymerase (Roche applied science). The following
conditions were applied: initial denaturation The PCR
product was at 95°C for 5 minutes, followed by 30 cycles;
denaturation at 94°C for 1 min, annealing at 61°C for 1
min, elongation at 72° for 1 min. The program was followed
by final elongation at 72°C for 5 minutes. The PCRamplified products were detected in 1% ethidium bromide
(EtBr)-stained agarose gel electrophoresis. After
electrophoresis, images were obtained in UVIdoc gel
documentation systems (UK).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดีเอ็นเอที่แยกได้จาก Penicillium chrysogenum
เซลล์โดยการเปลี่ยนแปลงวิธีการ Marmur (ที่ Marmur,
1961) เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวในการเจริญเติบโตของกลางชี้แจงขั้นตอนโดยการหมุนเหวี่ยง (8000G เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 ° C) และลอยอยู่ในบัฟเฟอร์TE (10 มิลลิทริส 1 มิลลิ EDTA [พีเอช8.0]) เซลล์ได้รับการรักษาที่มีไลโซไซม์ (1 mg / ml) สำหรับ20 นาทีและรับการรักษาแล้วด้วยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต 0.5% (SDS) และโปร K (100 mg / ml) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงต่อมา10% CTAB ที่ 65 ° C เป็นเวลา 20 นาที lysate ถูกสกัดเป็นครั้งที่สองที่มีแอลกอฮอล์คลอโรฟอร์ม isoamyl (24: 1); ดีเอ็นเอตกตะกอนกับ 0.6 เล่ม isopropanol และเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง(10,000g นาน 15 นาทีที่ 4 ° C) และกำลังลอยอยู่ในบัฟเฟอร์ TE. การย่อยอาหารของดีเอ็นเอที่มี endonucleases ข้อ จำกัดการแยกชิ้นส่วนโดยข่าวคราว agarose, ligation ของดีเอ็นเอการเปลี่ยนแปลงของเชื้อ E. coli กับดีเอ็นเอplasmidic และการสกัดดีเอ็นเอถูกดำเนินการตามที่อธิบายSambrook et al, (1989) ดีเอ็นเอชิ้นส่วนหายจากเจล agarose ต่ำละลายโดยใช้เจลสกัดชุดของTakara. ยีนไซลาเนสถูกขยายโดยใช้ Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์(Roche วิทยาศาสตร์ประยุกต์) และไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับการเข้ารหัสของภูมิภาคxylB ลำดับไพรเมอร์มีดังต่อไปนี้: ไพรเมอร์ไปข้างหน้าเป็น xylB-F: 5'- GTGCACGTTCATAAAAGGAGGAAG- 3 และกลับไพรเมอร์เป็นxylB-R: 5'- GCCCAAGCTTGGGTTATTTTCCGCTT -3 ข้อ จำกัดเว็บไซต์ของเอนไซม์ XbaI และ KpnI (นิวคลีโอที่ขีดเส้นใต้ในลำดับข้างต้น) ถูกรวมเข้าปลาย 5 'ของไพรเมอร์xylB -F และ xylB -R ตามลำดับ ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการในปริมาณรวมของ 25 ไมโครลิตรมี 100 นาโนกรัมดีเอ็นเอแม่แบบ1μMของแต่ละไพรเมอร์ 2 มิลลิ MgCl2 5 ไมโครลิตรของ buffer 10X PCR 200 ไมครอน dNTPs และ 1 หน่วย Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Roche วิทยาศาสตร์ประยุกต์) ต่อไปนี้เงื่อนไขที่ถูกนำไปใช้: denaturation เริ่มแรก PCR สินค้าอยู่ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 30 รอบ; denaturation ที่ 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที, การอบที่ 61 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที, การยืดตัวที่ 72 องศาเป็นเวลา 1 นาที . โปรแกรมที่ถูกใช้โดยการยืดตัวสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ผลิตภัณฑ์ PCRamplified ถูกตรวจพบใน 1% ethidium bromide (EtBr) -stained ข่าวคราว agarose หลังจากที่อิภาพที่ได้รับใน UVIdoc เจลระบบเอกสาร(สหราชอาณาจักร)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดีเอ็นเอที่แยกได้จากเชื้อรา Penicillium เก๊กฮวย
เซลล์โดยการปรับเปลี่ยนวิธีการของมาร์เมอร์ ( มาร์เมอร์
, 1961 ) เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวในกลางแทนการเจริญเติบโต
เฟสโดยการเหวี่ยงแยก ( 8000g สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ° C )
แขวนลอยใน TE บัฟเฟอร์ ( หรือ 10 มม. 1 mM EDTA pH
[ 8 ] ) เซลล์จะถูกกับไลโซไซม์ ( 1 mg / ml )
20 นาทีแล้วที่ได้รับ 0.5 % โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต
( SDS ) และโปรตีน K ( 100 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรที่อุณหภูมิ 37 องศา C 1 H ,
ต่อมา 10% ctab 65 ° C เป็นเวลา 20 นาที lysate
ถึงสกัดด้วยคลอโรฟอร์มในปริมาณแอลกอฮอล์ ( 24 : 1 ) ;
ดีเอ็นเอตกตะกอนกับ 0.6 และปริมาณของไอโซโพรพานอล
เก็บเกี่ยวโดยการเหวี่ยงแยก ( 10000g 15 นาทีที่ 4 ° C )
และแขวนลอยใน TE buffer การย่อยอาหารของดีเอ็นเอที่มีข้อ จำกัด สงบเงียบ

,การแยกเศษโดยเจลอิเล็ก
Ligation ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอของเชื้อ E . coli ด้วย
plasmidic การสกัดดีเอ็นเอและดีเอ็นเอทั้งหมด
ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดย sambrook et al . ( 1989 ) ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่พบจากจุดหลอมเหลวต่ำ (

ใช้เจลเจลสกัดชุดของ Takara .
ยีนไซลาเนสถูกขยายโดยใช้
ดีเอ็นเอทัควิทยาศาสตร์ ( การใช้ยา ) และไพรเมอร์
ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับรหัสภูมิภาคของ xylb . ไพรเมอร์ เป็นลำดับ
ต่อไปนี้ : รองพื้นไปข้างหน้าคือ xylb-f : 5 ' -
gtgcacgttcataaaaggaggaag - 3 และย้อนกลับ
primer คือ xylb-r : 5 ' -
gcccaagcttgggttattttccgctt - 3 จำกัดเอนไซม์และเว็บไซต์ของ xbai
kpni ( ขีดเส้นใต้ในลำดับนิวคลีโอไทด์
ข้างบน ) ถูกรวมเข้าไปใน 5 จบ
ไพรเมอร์ xylb - F - r xylb ตามลำดับ เทคนิคปฏิกิริยา
ได้ในปริมาณรวม 25 µ L ( 100
นาโนดีเอ็นเอแม่แบบ 1 µ M ของแต่ละชุดไพรเมอร์ 2 มม. , 5
µผม 10x PCR buffer , 200 µ M dntps 1 หน่วยดีเอ็นเอพอลิเมอเรสได้ดี
( วิทยาศาสตร์ประยุกต์ โรช ) ต่อไปนี้
เงื่อนไขที่ใช้ : เริ่มต้น ( ผลิตภัณฑ์ PCR
อยู่ที่ 95 องศา C เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 30 รอบ ;
ที่ 94 ° C ( 1 นาทีที่ 61 ° C สำหรับการอบ 1
มิน , ยืดที่ 72 / 1 นาที โปรแกรมตาม
โดยการยืดตัวสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที การ pcramplified ผลิตภัณฑ์พบว่า 1% ทิเดียมโบรไมด์
( etbr ) - สีโรสเจล หลังจาก
อิเล็ก , ภาพที่ได้รับในระบบเอกสารเจล
uvidoc ( UK )