1. IntroductionProkaryotes, which c

1. Introduction
Prokaryotes, which constitute the two domains bacteria and
archaea, are the most abundant and diverse organisms in marine
waters (DeLong, 1992; DeLong et al., 1994; Curtis et al., 2002;
Pedrós-Alió, 2006; Alonso-Sáez et al., 2011). These highly diverse
organisms are involved in the cycles of virtually all essential elements
in marine environment such as carbon and nitrogen cycles.
Their essential role in decomposing and recycling organic matter
has been well recognized. Community composition, biomass and
activity of these organisms critically influence carbon fluxes of
marine ecosystems (Mou et al., 2008; Jiao et al., 2010a; Gantner
et al., 2011). Autotrophic bacteria for example, contribute up to
60% of the total primary production in the open ocean ecosystem
(Platt et al., 1983). Heterotrophic bacteria on the other hand,
consume around 20–60% of total primary production in marine
ecosystems (Fuhrman, 1992; Kirchman et al., 1993) and turn dissolved
organic carbon into higher trophic levels via the microbial
loop (Azam, 1998). Moreover, heterotrophic bacteria have recently
been recognized as playing an important role in marine carbon
reservation by the microbial carbon pump (Jiao et al., 2010a).
Comparing to bacteria, archaea are less diverse and not wellstudied
organisms. Archaea, previously found to distribute only in
extreme environment, were later found widely distributed in
marine waters with high abundance (DeLong et al., 1994; DeLong
and Pace, 2001). It has been reported that two main archaeal
phyla, Euryarchaeota and Crenarchaeota, occupy different niche in
marine ecosystems (Massana et al., 1997; DeLong, 2003). Euryarchaeota
are more abundant in surface waters, whereas Crenarchaeota
are more abundant at depth (Massana et al., 1997;
Alonso-Sáez et al., 2011). Study carried out at the Hawai’i Ocean
Time-series station ALOHA in the North Pacific subtropical gyre
showed pelagic Crenarchaeota represents one of the ocean’s most
abundant single cell types (Karner et al., 2001). In some regions,
they account for more than 20% of the total picoplankton cell
densities (DeLong, 2003).
Understanding the variations of microbial communities in the
ocean helps us to understand the long-term responses of marine
microbes to environmental changes (Giovannoni and Vergin,
2012). Based on analysis of the 16S rRNA gene and flow cytometry,
seasonal and spatial variations of bacterioplankton communities
have been studied in many coastal and oceanic waters, such as the
western English Channel (Gilbert et al., 2009, 2011), the Southern
Ocean (Jamieson et al., 2012), southern California (Dillon et al.,
2009) and the Mediterranean Sea (Ruiz-González et al., 2011).
Many of these studies revealed apparent seasonal and spatial
dynamics of bacterioplankton communities, and some studies
pointed out that certain bacterioplankton orders (such as
SAR11 and Rhodobacterales) had different seasonal abundances
(Gilbert et al., 2011). These studies identified a number of different
environmental parameters, such as NH4
+ and total organic nitrogen
concentration (Gilbert et al., 2011), phosphate concentration
(Gilbert et al., 2009), temperature (Gilbert et al., 2009; Jamieson
et al., 2012) and salinity (Dillon et al., 2009; Fortunato et al., 2012),
affecting the dynamics of bacterioplankton communities.
However, there are few studies assessing the seasonal variation
of archaeal community in marine environment (Murray et al.,
1998; Herfort et al., 2007; Winter et al., 2009; Hollibaugh et al.,
2013).
The South China Sea is a large marginal sea in the western
tropical North Pacific Ocean. Its northern part is influenced by a
variety of different oceanographic processes, including freshwater
discharge from the Pearl River, mesoscale eddies, coastal upwelling
and the interaction of different currents, modulated by the
East Asian monsoon. The highly dynamic and complex hydrological
condition affects the composition and function of bacteria
communities along the nutrient gradient from river plume to the
oligotrophic basin in different seasons. This in turn might explain
the seasonal variation of carbon fluxes in this region. However,
only few studies addressing bacterial and archaeal community
compositions and their seasonal variations in the Northern South
China Sea (NSCS) have been done so far.
In recent years, high-throughput sequencing, such as 454 pyrosequencing,
has been applied in the research of bacterial community
composition and diversity. These applications provide less
biased, more robust and high-coverage results that help to
uncover many details about the distribution of bacteria in a broad
range of environments. In this study, we studied the seasonal
variations of free living bacterial and archaeal community compositions
along a transect from the estuarine water of the Pearl
River to the oligotrophic basin in the NSCS by applying the 454
pyrosequencing method.
(5′-adaptorþbarcodeþCCTAYGGGRBGCASCAG-3′) and 806R
(5′-adaptorþGGACTACNNGGGTATCTAAT-3′) (Yu et al., 2005).
Archaeal 16S rRNA gene was amplified using barcoded primers
340F (5′-adaptorþbarcodeþCCCTAYGGGGYGCASCAG-3′) and
1000R (5′-adaptorþGGCCATGCACYWCYTCTC-3′) (Gantner et al.,
2011). For bacterial 16S rRNA gene, PCR reactions contained a final
concentration of 0.5 mM MgCl2, 0.5 mM of each primer (Yu et al.,
2005), 0.8 mM of each dNTP and 1.0 unit of hot start polymerase
(Invitrogen, USA). The template DNA concentration was about
10 ng per reaction (the template DNA was diluted to 10 ng ml
1
,
and 1 ml was added). The PCR cycles started with a 5 min initial
denaturation at 95 °C, followed by 30 cycles at 95 °C for 30 s, 55 °C
for 30 s, and 72 °C for 60 s. A final extension of 72 °C for 5 min was
included before holding at 4 °C. For the amplification of 16S rRNA
gene of archaea, protocol of Stephan Gantner was followed
(Gantner et al., 2011). All the reactions were done in 25 ml reaction
volume in triplicates.
PCR products were gel-purified using the Qiaquick gel purification
kit (Quiagen, Hilgen, Germany). Library quantification was done
by fluorometry using the Quant-iT picoGreen dsDNA Assay Kit
(Invitrogen, USA). An equal volume of each amplicon was mixed to
prepare amplicon pools, and then sequenced in a two-region 454
run on a GS PicoTiterPlate using a Roche/454 GS Junior pyrosequencing
system (Roche, 454 Life Sciences, Branford, CT, USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1. บทนำProkaryotes ซึ่งเป็นแบคทีเรียสองโดเมน และอาร์เคีย ถูกที่สุดอุดมสมบูรณ์ และหลากหลายสิ่งมีชีวิตในทะเลน้ำ (DeLong, 1992 DeLong et al., 1994 เคอร์ทิสและ al., 2002Pedrós-Alió, 2006 Alonso-Sáez et al., 2011) เหล่านี้มีความหลากหลายสูงสิ่งมีชีวิตจะเกี่ยวข้องกับวงจรของแทบทุกองค์ประกอบที่สำคัญในสภาพแวดล้อมทางทะเลเช่นวงจรไนโตรเจนและคาร์บอนความสำคัญในพืชพันธุ์ และรีไซเคิลอินทรีย์ได้ดีรับ องค์ประกอบของชุมชน ชีวมวล และกิจกรรมของสิ่งมีชีวิตเหล่านี้มีอิทธิพลต่อ fluxes คาร์บอนของเหลือระบบนิเวศทางทะเล (Mou et al., 2008 เจียว al. et, 2010a Gantnerร้อยเอ็ด al., 2011) แบคทีเรีย autotrophic เช่น ร่วมถึง60% ของการผลิตหลักทั้งหมดในระบบนิเวศทะเล(Platt และ al., 1983) Heterotrophic แบคทีเรียบนมืออื่น ๆใช้ประมาณ 20 – 60% ของการผลิตหลักทั้งหมดในทะเลระบบนิเวศ (Fuhrman, 1992 Kirchman et al., 1993) และละลายคาร์บอนอินทรีย์ในระดับที่สูงขึ้นชั้นอาหารทางจุลินทรีย์ที่วน (ครัว 1998) นอกจากนี้ แบคทีเรีย heterotrophic มีเมื่อเร็ว ๆ นี้รับรู้เป็นการเล่นมีบทบาทสำคัญในทะเลคาร์บอนจอง โดยปั๊มคาร์บอนจุลินทรีย์ (เจียว et al., 2010a)เปรียบเทียบกับแบคทีเรีย อาร์เคียไม่หลากหลาย และไม่ wellstudiedสิ่งมีชีวิต อาร์เคีย ก่อนหน้านี้ พบกระจายในสภาพแวดล้อมมาก หลังพบกระจายอย่างกว้างขวางในน้ำทะเล มีความอุดมสมบูรณ์สูง (DeLong et al., 1994 DeLongก ก้าว 2001) มีรายงานว่า archaeal หลักสองช่องต่าง ๆ ในครอบครอง phyla, Euryarchaeota และ Crenarchaeotaระบบนิเวศทางทะเล (ลดิว et al., 1997 DeLong, 2003) Euryarchaeotaมีชุกชุมมากขึ้นในผิวน้ำ โดย Crenarchaeotaมีชุกชุมมากที่ความลึก (ลดิว et al., 1997Alonso-Sáez et al., 2011) ศึกษาดำเนินการที่มหาสมุทร Hawai'iชุดเวลาสถานีอโลฮาเขาผิดพลาดแบบแปซิฟิกเหนือแสดงให้เห็นเกี่ยวกับ Crenarchaeota หมายถึงหนึ่งส่วนใหญ่ของทะเลชนิดเซลล์เดียวที่อุดมสมบูรณ์ (Karner et al., 2001) ในบางภูมิภาคพวกเขาบัญชีกว่า 20% ของเซลล์ทั้งหมด picoplanktonความหนาแน่น (DeLong, 2003)เข้าใจรูปแบบของชุมชนจุลินทรีย์ในการโอเชี่ยนช่วยให้เราเข้าใจการตอบสนองระยะยาวของทะเลจุลินทรีย์การเปลี่ยนแปลงของสิ่งแวดล้อม (Giovannoni และ Vergin2012) ตามการวิเคราะห์ของการ 16S rRNA ยีนและกระแสเซลล์เปลี่ยนแปลงตามฤดูกาล และพื้นที่ของชุมชน bacterioplanktonมีการศึกษาในชายฝั่งทะเล และมหาสมุทรน้ำ เช่นการตะวันตกช่องแคบอังกฤษ (Gilbert et al. ปี 2009, 2011), ภาคใต้โอเชี่ยน (Jamieson et al., 2012), แคลิฟอร์เนียภาคใต้ (ดิลลอน et al.,2009) และทะเลเมดิเตอร์เรเนียน (Ruiz González et al., 2011)ของการศึกษาเหล่านี้เปิดเผยชัดเจนตามฤดูกาล และพื้นที่ของชุมชน bacterioplankton และบางการศึกษาชี้ให้เห็นว่า บาง bacterioplankton ใบสั่ง (เช่นSAR11 และ Rhodobacterales) มี abundances แตกต่างกันตามฤดูกาล(Gilbert et al., 2011) การศึกษานี้ระบุจำนวนแตกต่างกันพารามิเตอร์ด้านสิ่งแวดล้อม เช่น NH4+ และอินทรีย์ไนโตรเจนทั้งหมดความเข้มข้น (Gilbert et al., 2011), ความเข้มข้นของฟอสเฟต(Gilbert et al., 2009), อุณหภูมิ (Gilbert et al., 2009 Jamiesonร้อยเอ็ด al., 2012) และเค็ม (ดิลลอน et al., 2009 Fortunato et al., 2012),มีผลต่อการเปลี่ยนแปลงของชุมชน bacterioplanktonอย่างไรก็ตาม มีบางการศึกษาประเมินความผันแปรตามฤดูกาลชุมชน archaeal ในสภาพแวดล้อมทางทะเล (Murray et al.,ปี 1998 Herfort et al., 2007 หนาวและ al., 2009 Hollibaugh et al.,2013)ในทะเลจีนใต้เป็นทะเลร่อแร่ขนาดใหญ่ในตะวันตกมหาสมุทรแปซิฟิกเหนือเขตร้อน ส่วนภาคเหนือมีผลต่อการหลากหลาย oceanographic กระบวนการต่าง ๆ รวมทั้งปลาปล่อยจากแม่น้ำเพิร์ล mesoscale eddies ชายฝั่ง upwellingและการโต้ตอบของกระแสแตกต่างกัน สันทัดโดยมรสุมเอเชียตะวันออก แบบไดนามิกสูง และเชิงอุทกวิทยาเงื่อนไขการมีผลกระทบต่อองค์ประกอบและการทำงานของแบคทีเรียชุมชนตามไล่ระดับธาตุอาหารจากเบิ้ลพลูมของน้ำเพื่อการอ่าง oligotrophic ในฤดูที่แตกต่าง นี้จะอาจอธิบายความผันแปรตามฤดูกาลของ fluxes คาร์บอนในภูมิภาคนี้ อย่างไรก็ตามเพียงไม่กี่ศึกษาแบคทีเรียและ archaeal แก้ปัญหาชุมชนองค์และความแตกต่างของฤดูกาลในภาคใต้ภาคเหนือทำทะเลจีน (NSCS) จนในปีที่ผ่านมา ลำดับเบส เช่น 454 pyrosequencing สูงสูงมีการใช้ในการวิจัยของชุมชนเชื้อแบคทีเรียองค์ประกอบและความหลากหลาย โปรแกรมประยุกต์เหล่านี้ให้น้อยลงผล biased เพิ่มประสิทธิภาพ และความครอบ คลุมสูงที่ช่วยเปิดเผยรายละเอียดมากมายเกี่ยวกับการกระจายของเชื้อแบคทีเรียในกว้างช่วงของสภาพแวดล้อม ในการศึกษานี้ เราเรียนที่ตามฤดูกาลรูปแบบของห้องนั่งเล่นฟรีแบคทีเรียและ archaeal ชุมชนองค์ตาม transect จากน้ำปากแม่น้ำไข่มุกแม่อ่าง oligotrophic ใน NSCS โดยใช้ 454วิธี pyrosequencing(5′-adaptorþbarcodeþCCTAYGGGRBGCASCAG-3′) และ 806R(5′-adaptorþGGACTACNNGGGTATCTAAT-3′) (Yu et al., 2005)Archaeal 16S rRNA ยีนถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ barcoded340F (5′ adaptorþbarcodeþCCCTAYGGGGYGCASCAG 3′) และ1000R (5′-adaptorþGGCCATGCACYWCYTCTC-3′) (Gantner et al.,2011) สำหรับยีนแบคทีเรีย 16S rRNA ปฏิกิริยา PCR อยู่ตัวสุดท้ายความเข้มข้น 0.5 มม. MgCl2, 0.5 มม.แต่ละพื้น (Yu et al.,2005), 0.8 มม.แต่ละ dNTP และ 1.0 หน่วยเริ่มร้อนพอลิเมอเรส(Invitrogen สหรัฐอเมริกา) แบบเข้มข้นดีเอ็นเอที่เกี่ยวกับ10 ng ต่อปฏิกิริยา (แบบดีเอ็นเอถูกทำให้เจือจางไป 10 ng ml1,กเพิ่ม 1 ml) รอบ PCR เริ่ม 5 นาทีแรกdenaturation ที่ 95 ° C ตามรอบ 30 ที่ 95 ° C สำหรับ 30 s, 55 ° Cสำหรับ 30 s, 72 ° C 60 s มีการขยาย 72 ° C สำหรับ 5 นาทีสุดท้ายรวมก่อนถือที่ 4 องศาเซลเซียส การขยายของ 16S rRNAยีนของอาร์เคีย โพรโทคอของ Stephan Gantner ได้ตาม(Gantner et al., 2011) ทำปฏิกิริยาทั้งหมดในปฏิกิริยา 25 mlระดับเสียงใน triplicatesผลิตภัณฑ์ PCR ได้เจบริสุทธิ์ใช้ฟอกเจ Qiaquickชุด (Quiagen, Hilgen เยอรมนี) ห้องสมุดนับเสร็จโดย fluorometry dsDNA picoGreen Quant มันเป็นชุดทดสอบที่ใช้(Invitrogen สหรัฐอเมริกา) มีผสมปริมาตรการเท่ากันของ amplicon แต่ละจัดเตรียมสระว่ายน้ำ amplicon และเรียงลำดับแล้ว ใน 454 สองภูมิภาครันบน PicoTiterPlate GS ที่ใช้ pyrosequencing จูเนียร์ GS โร/454ระบบ (Roche, 454 วิทยาศาสตร์สุขภาพ Branford, CT สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1 . โปรคาริโอทส์บทนำ
ซึ่งเป็นสองโดเมนแบคทีเรียและอาร์เคีย
เป็นมากมาย และหลากหลายมากที่สุดของสิ่งมีชีวิตในน่านน้ำทะเล
( Delong , 1992 ; Delong et al . , 1994 ; เคอร์ติส et al . , 2002 ;
pedr ó s-ali ó , 2006 ; alonso-s . kgm คือ et al . , 2011 ) สิ่งมีชีวิตหลากหลาย
สูงเหล่านี้มีส่วนร่วมในรอบเกือบทั้งหมดที่จำเป็นองค์ประกอบ
ในสิ่งแวดล้อมทางทะเล เช่น คาร์บอน และวัฏจักรไนโตรเจนบทบาทที่สำคัญของพวกเขาในของและการรีไซเคิล
อินทรีย์ได้รับการยอมรับ องค์ประกอบของชุมชน 3
กิจกรรมของสิ่งมีชีวิตเหล่านี้มีอิทธิพลต่อฟลักซ์วิกฤตคาร์บอนของระบบนิเวศทางทะเล
( MOU et al . , 2008 ; เจียว et al . , 2010a ; gantner
et al . , 2011 ) แบคทีเรียโตโทรฟตัวอย่างเช่น ส่งผลถึง
60% ของผลผลิตปฐมภูมิทั้งหมดในระบบนิเวศ
เปิดมหาสมุทร( แพลทท์ et al . , 1983 ) แบคทีเรียแบบบนมืออื่น ๆ ,
กินประมาณ 20 - 60 % ของการผลิตหลักในระบบนิเวศทางทะเล
( เฟอร์แมน , 1992 ; Kirchman et al . , 1993 ) และเปิดละลายอินทรีย์คาร์บอนในระดับที่สูงอันดับ
ผ่านห่วงจุลินทรีย์
( Azam , 1998 ) และแบบมีเมื่อเร็ว ๆนี้ได้รับการยอมรับว่าเป็นแบคทีเรีย

มีบทบาทสําคัญในคาร์บอน มารีนจองโดยปั๊มคาร์บอนจุลินทรีย์ ( เจียว et al . , 2010a )
เมื่อเปรียบเทียบกับแบคทีเรียอาร์เคียมีความหลากหลายน้อยกว่า และไม่ wellstudied
สิ่งมีชีวิต อาร์เคีย ก่อนหน้านี้พบกระจายในสภาพแวดล้อมรุนแรง
) ต่อมาพบกระจายอย่างกว้างขวางในน่านน้ำทางทะเลที่มีความอุดมสมบูรณ์สูง
( Delong et al . , 1994 ; Delong
และก้าว , 2001 ) มันได้รับรายงานว่าสองหลัก archaeal
ไฟลัมและ euryarchaeota ครีนาร์เคียโ า , ครอบครองที่แตกต่างกันเฉพาะใน
ระบบนิเวศทางทะเล ( massana et al . , 1997 ; Delong , 2003 ) euryarchaeota
อุดมสมบูรณ์มากขึ้นในน้ำผิว ในขณะที่ครีนาร์เคียโ า
มีมากมายที่ความลึก ( massana et al . , 1997 ;
alonso-s . kgm คือ et al . , 2011 ) การศึกษาในมหาสมุทร
เวลาชุดสถานี Aloha ฮาวายในมหาสมุทรแปซิฟิกเหนือวงกลมกึ่ง
พบทะเลครีนาร์เคียโ าเป็นหนึ่งในประเภทของมหาสมุทรที่สุด
ดาษดื่นเซลล์เดียว ( คาร์เนอร์ et al . , 2001 ) ในบางภูมิภาค
พวกเขาบัญชีกว่า 20 % ของทั้งหมด Phototrophic picoplankton มีเซลล์
( Delong , 2003 ) .
เข้าใจการเปลี่ยนแปลงของชุมชนจุลินทรีย์ในทะเลจะช่วยให้เราเข้าใจ

คำตอบระยะยาวของมารีนจุลินทรีย์กับการเปลี่ยนแปลงด้านสิ่งแวดล้อม ( เวอร์จิ้น
และ Giovannoni , 2012 ) ตามการวิเคราะห์ของ 16S rRNA ยีนและการไหล (
, พื้นที่และการเปลี่ยนแปลงของฤดูกาล bacterioplankton ชุมชน
ได้รับการศึกษาในน่านน้ำชายฝั่งและมหาสมุทรมาก เช่น
ช่องทางตะวันตกภาษาอังกฤษ ( Gilbert et al . , 2009 , 2011 ) , มหาสมุทรใต้
( เจมีสัน et al . , 2012 ) , แคลิฟอร์เนีย ( ลอน et al . ,
2009 ) และทะเลเมดิเตอร์เรเนียน ( รู gonz . kgm lez et al . , 2011 ) .
หลายของการศึกษาเหล่านี้เปิดเผยโจ่งแจ้งตามฤดูกาลและเชิงพลวัตของชุมชน bacterioplankton

และบางการศึกษาชี้ให้เห็นว่า คำสั่ง bacterioplankton บางอย่าง ( เช่น
sar11 abundances ตามฤดูกาลที่แตกต่างกันและมี rhodobacterales )
( Gilbert et al . , 2011 ) การศึกษานี้ระบุจำนวนของพารามิเตอร์ด้านสิ่งแวดล้อมที่แตกต่างกัน
,เช่น NH4

และความเข้มข้นของไนโตรเจนรวมอินทรีย์ ( Gilbert et al . , 2011 ) ,
ความเข้มข้นของฟอสเฟต ( Gilbert et al . , 2009 ) อุณหภูมิ ( Gilbert et al . , 2009 ; เจมีสัน
et al . , 2012 ) และความเค็ม ( ดิลลอน et al . , 2009 ; ฟอร์ตูนาโต et al . , 2555 ) มีผลต่อการเปลี่ยนแปลงของชุมชน bacterioplankton
.
แต่มีการศึกษาน้อยการประเมิน
ฤดูกาลเปลี่ยนแปลงของชุมชน archaeal ในสิ่งแวดล้อมทางทะเล ( เมอร์เรย์ et al . ,
2541 ; herfort et al . , 2007 ; ฤดูหนาว et al . , 2009 ; hollibaugh et al . ,

) ) ทะเลจีนใต้เป็นทะเลส่วนใหญ่ในภาคเหนือเขตร้อนตะวันตก
มหาสมุทรแปซิฟิก ตอนเหนือของเป็นผลมาจากความหลากหลายของกระบวนการทางสมุทรศาสตร์

จำหน่ายต่าง ๆรวมทั้งน้ำจืดจากแม่น้ำไข่มุก สเกลปานกลาง Eddies
ซ่อนอัตโนมัติ , ชายฝั่งและปฏิสัมพันธ์ของกระแสที่แตกต่างกันปรับโดย
มรสุมเอเชียตะวันออก ขอแบบไดนามิกและเงื่อนไขซับซ้อนอุทกวิทยา
มีผลต่อองค์ประกอบและการทำงานของแบคทีเรีย
ชุมชนตามไล่ระดับธาตุอาหารจากแม่น้ำขนนกกับ
อ่างโอลิโกโทรฟิกในฤดูกาลที่แตกต่าง นี้ในการเปิดอาจอธิบาย
การผันแปรตามฤดูกาลของคาร์บอนทั้งในภูมิภาคนี้ อย่างไรก็ตาม
เพียงไม่กี่การศึกษากับเชื้อแบคทีเรียและ archaeal องค์ประกอบชุมชน
และการเปลี่ยนแปลงตามฤดูกาลของพวกเขาในทางตอนเหนือของทะเลจีนใต้
( nscs ) ได้รับการทำเพื่อให้ห่างไกล .
ในปีล่าสุด การช่วย เช่นคุณไพโรซีเควนซิง
ได้รับ , ใช้ในการศึกษาขององค์ประกอบและความหลากหลายของชุมชน
แบคทีเรีย โปรแกรมเหล่านี้ให้น้อยลง
ลําเอียงเพิ่มเติมที่แข็งแกร่งและการคุ้มครองสูงที่ช่วย
เปิดเผยรายละเอียดมากเกี่ยวกับการกระจายของแบคทีเรียในช่วงกว้าง
ของสภาพแวดล้อม ในการศึกษานี้จึงศึกษาการเปลี่ยนแปลงตามฤดูกาล
ของฟรีอยู่แบคทีเรียและ archaeal องค์ประกอบชุมชน
ตามผลจากน้ำเค็มน้ำของไข่มุก
แม่น้ำอ่างโอลิโกโทรฟิกใน nscs โดยใช้ 454

วิธีไพโรซีเควนซิง .( 5 ’ - อะแดปเตอร์þþบาร์โค้ด cctaygggrbgcascag-3 School ) และ 806r
( 5 ’ - อะแดปเตอร์þ ggactacnngggtatctaat-3 School ) ( ยู et al . , 2005 ) .
archaeal 16S rRNA ยีนโดยใช้ไพรเมอร์ของบรรณานุกรม
340f ( 5 ’ - อะแดปเตอร์þþบาร์โค้ด ccctayggggygcascag-3 School ) และ
1000r ( 5 ’ - อะแดปเตอร์þ ggccatgcacywcytctc-3 School ) ( gantner et al . ,
2011 ) สำหรับแบคทีเรียเบส 16S rRNA ยีน ปฏิกิริยา PCR มีความเข้มข้นสุดท้าย
0.5 มม. ชุด , 0 .5 มม. ของแต่ละสี ( ยู et al . ,
2005 ) 0.8 มิลลิเมตรของแต่ละ dntp และ 1.0 หน่วยจาเริ่มโดย
( Invitrogen , USA ) แม่แบบ DNA ความเข้มข้นเกี่ยวกับ
10 นาโนต่อปฏิกิริยา ( แม่แบบดีเอ็นเอเจือจาง 10 ng ml
1
,
1 ml เพิ่ม ) การตรวจรอบเริ่มจาก 5 นาทีเริ่มต้นที่ 95 องศา C
( ตามด้วย 30 รอบที่ 95 องศา C 30 S 55 ° C
3 S , และ 72 ° C เป็นเวลา 60 วินาทีสุดท้ายเป็นส่วนขยายของ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาทีก่อนที่จะถือ
รวม 4 องศา สำหรับการเพิ่มปริมาณของยีน 16S rRNA
อาร์เคีย , โปรโตคอลของสตีเฟ่น gantner ตามมา
( gantner et al . , 2011 ) ปฏิกิริยาทั้งหมดที่ถูกทำใน 25 มล. ปริมาตรปฏิกิริยา
3 ซ้ำ
ผลิตภัณฑ์ PCR เป็นเจลบริสุทธิ์ การใช้เจลฟอก qiaquick
Kit ( quiagen hilgen , เยอรมนี ) ปริมาณา
ห้องสมุดโดย fluorometry ใช้จํานวนมัน picogreen dsdna การทดสอบชุด
( Invitrogen , USA ) ปริมาณเท่ากันของแต่ละและผสม

เตรียมและสระว่ายน้ำ และลำดับในการเรียกสองภูมิภาค 454
บน GS picotiterplate ใช้โรช / 454 GS จูเนียร์ไพโรซีเควนซิง
ระบบ ( โรช ชีวิต 454 วิทยาศาสตร์ แบรนฟอร์ด , CT , สหรัฐอเมริกา )