[Abstract] Glucose tolerance test i

[Abstract] Glucose tolerance test is a standard procedure that addresses how quickly exogenous glucose can be cleared from blood. Specifically, uptake of glucose from the blood by cells is regulated by insulin. Impairment of glucose tolerance (i.e, longer time to clear given amount of glucose) indicates problems with maintenance of glucose homeostasis (insulin resistance, carbohydrate metabolism, diabetes, etc).
According to the WHO, in a standard oral glucose tolerance test (OGTT), glucose level should be below 7.8 mmol/L (140 mg/dl) at 2 h. Levels between this and 11.1 mmol/L (200 mg/dl) indicate “impaired glucose tolerance”, and any level above 11.1 mmol/L (200 mg/dl) confirms a diagnosis of diabetes.

Materials and reagents

Mice (~20 C57BL/6J (B6) males of 2-3 months old)
70% ethanol
Beta-D(+)-glucose (Sigma-Aldrich, catalog number: G8270)
NaCl
KCl
Sodium phosphate
Phosphate buffered saline (PBS) (see Recipes)
Equipment

ACCU-CHEK comfort curve glucometer (Roche Diagnostics, catalog number: 03537536001) (this product has been discontinued. Any new product of ACCU-CHEK should work fine as well)
Such device quantifies glucose amperometrically by measuring the current produced upon oxidation of glucose to gluconic acid by glucose oxidase, or to gluconolactone by dehydrogenase.
27 gauge needle (Single-Use Needles, supplied by VWR, BD Medical, catalog number: BD305109)
Microvette CB300 Z serum separator (SARSTEDT, catalog number: 16.440.100)
Acrodisc 25 mm syringe filters w/ 0.2 μM HT Tuffryn membrane (Pall Corporation, catalog number: 4192)
Procedure

Note: All the following experimental procedures that involve animals (rodents) should receive approval from IACUC or equivalent committee. Humane treatment of animals should be practiced all the time.
In the Cavener lab, we used glucose tolerance test extensively in the characterization of mice lacking Pek/Perk, encoding an eIF2alpha kinase that is crucial to translational control and ER homeostasis (Zhang et al., 2002).
Obtain ~20 C57BL/6J (B6) males of 2-3 months old from Jackson Laboratory or Harlan Teklad and raise them on a regular diet for about 2 weeks.
Tip 1: Males, if not from the same litter, tend to fight with each other. Raise only 3-4 animals per cage and monitor any aggressive behavior.
Fast animals O/N in fresh cages with water supply for ~16 h the day before experiment.
Monitor body weight as well as baseline blood glucose level for each animal.
Tip 2: Clean tail with 70% ethanol and rub it for better circulation before making a clip with sterile scissors.
In non-terminal procedures, collect sufficient amount of blood sample (i.e., ~30 μl) from saphenous vein for serum isolation and insulin determination by radioimmunoassay (RIA). To reduce lysis of red blood cells, make multiple punctures on the saphenous vein with a small needle and collect blood using Microvette CB300 Z serum separator.
Prepare 10% glucose in 1x PBS and sterilize the solution by 0.2 μm-filtration.
Prepare injection solution in a 0.5 ml eppendorf tube for each animal (2 mg glucose/g body weight). Volume (μl) = Body Weight (g) x 20. Use 20% glucose instead, should the body weight be greater than 30 g.
Sterilize abdominal region of animal with 70% ethanol, and clean up with dry cotton ball. Hold the back of the animal firmly, and inject glucose intraperitoneally into recipient subject with a 27-gauge sterile needle.
Tip3: Remove air bubble before injection and do NOT stick the needle into the body too deeply. Perform injection slowly with an angle of 30 to 45 °C to avoid subcutaneous injection. Pick the injection site away from the liver and close to the ventral axis to avoid kidney damage.
Put the animal back into the cage and measure blood glucose levels at 15, 30, 60, 90 and 120 min (or 30, 60, 90, 120 and 240 min). At least 3-4 replicate animals should be used for each time-point.
Representative data



Figure 1. This figure is adapted from the original (Zhang et al., 2002). Fasted B6 mice were injected at time zero with glucose, and blood glucose levels were monitored and normalized to the value of time zero. Each data point represents the average of three to five individual mice. The baseline value of blood glucose is typically ~100 mg/dl. Representative data are shown here.
Notes

Please note that mice of different genders, ages, and inbred backgrounds can show different responses to glucose. Certain strain-specific phenotype data can be found at http://phenome.jax.org/db/q?rtn=meas/methodologies.
Recipes

PBS (pH 7.4)
0.8% NaCl
0.02% KCl
12 mM sodium phosphate
Acknowledgments

This protocol was adapted from work performed by Dr. Maureen Gannon at the Vanderbilt University Medical Center. PZ was supported by a research assistantship in the Cavener lab at the Pennsylvania State University.
References

Zhang, P., McGrath, B., Li, S., Frank, A., Zambito, F., Reinert, J., Gannon, M., Ma, K., McNaughton, K. and Cavener, D. R. (2002). The PERK eukaryotic initiation factor 2 alpha kinase is required for the development of the skeletal system, postnatal growth, and the function and viability of the pancreas. Mol Cell Biol 22(11): 3864-3874.


How to cite this protocol: Zhang, P. (2011). Glucose Tolerance Test in Mice. Bio-protocol 1(19): e159. http://www.bio-protocol.org/e159

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

[บทคัดย่อ] ทดสอบกลูโคสยอมรับเป็นกระบวนการมาตรฐานที่อยู่กลูโคสอย่างรวดเร็วบ่อยสามารถถูกลบออกจากเลือด โดยเฉพาะ ของกลูโคสจากเลือดโดยเซลล์จะถูกกำหนด โดยอินซูลิน ผลของน้ำตาลในการยอมรับ (อาทิ นานล้างให้จำนวนกลูโคส) บ่งชี้ปัญหาบำรุงรักษาภาวะธำรงดุลกลูโคส (ต้านทานอินซูลิน การเผาผลาญคาร์โบไฮเดรต เบาหวาน ฯลฯ) ตามคน ในการทดสอบยอมรับมาตรฐานปากกลูโคส (OGTT), ระดับกลูโคสควรต่ำกว่า 7.8 mmol/L (140 mg/dl) ระดับ 2 h. ระหว่างนี้ 11.1 mmol/L (200 mg/dl) ระบุว่า "ยอมรับผู้ที่มีกลูโคส" และระดับใดเหนือ 11.1 mmol/L (200 mg/dl) ยืนยันการวินิจฉัยโรคเบาหวานวัสดุและ reagentsหนู (~ 20 C57BL/6J (B6) ชายอายุ 2-3 เดือน)เอทานอล 70%(+) เบต้า-D-กลูโคส (ซิก-Aldrich แค็ตตาล็อกหมายเลข: G8270)NaClKClโซเดียมฟอสเฟตฟอสเฟต buffered น้ำเกลือ (PBS) (ดูสูตร)อุปกรณ์ACCU เชคจึงโค้ง glucometer (Roche วินิจฉัย แค็ตตาล็อกหมายเลข: 03537536001) (ผลิตภัณฑ์นี้ได้ถูกยกขึ้น สินค้าใหม่ของ ACCU เชคควรทำงานดีด้วย)อุปกรณ์เช่น quantifies amperometrically กลูโคส โดยวัดปัจจุบันผลิตเมื่อเกิดออกซิเดชันของกลูโคสกรด gluconic โดยกลูโคส oxidase หรือ gluconolactone โดย dehydrogenase27 วัดเข็ม (เข็มเดียวใช้ จาก VWR, BD แพทย์ แค็ตตาล็อกหมายเลข: BD305109)แยกซีรั่ม Microvette CB300 Z (SARSTEDT แค็ตตาล็อกหมายเลข: 16.440.100)Acrodisc 25 มม.เข็มกรอง ด้วย 0.2 μM เอชที Tuffryn เมมเบรน (แถบวาย คอร์ปอเรชั่น แค็ตตาล็อกเลข: 4192)ขั้นตอนการหมายเหตุ: ทั้งหมดต่อไปนี้ทดลองขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับสัตว์ (งาน) ควรรับการอนุมัติจาก IACUC หรือเทียบเท่าคณะกรรมการ รักษาสัตว์จรจัดควรฝึกฝนตลอดเวลาในห้องปฏิบัติการ Cavener เราใช้กลูโคสทดสอบการยอมรับอย่างกว้างขวางในคุณสมบัติของหนูขาดเป็ก/เงย เข้ารหัสเป็น eIF2alpha kinase ที่สำคัญการควบคุม translational ER ภาวะธำรงดุล (Zhang et al., 2002)รับชาย C57BL/6J (B6) ~ 20 ของ 2-3 เดือนจากห้องปฏิบัติการ Jackson หรือฮาร์ลาน Teklad และเพิ่มในอาหารปกติประมาณ 2 สัปดาห์เคล็ดลับที่ 1: เพศชาย ถ้าไม่ใช่จากแคร่เดียว มักจะ ต่อสู้กัน ยกเพียง 3-4 สัตว์ต่อกรง และตรวจสอบพฤติกรรมก้าวร้าวใด ๆรวดเร็วสัตว์ O/N ในกรงสดกับน้ำสำหรับ h ~ 16 วันก่อนการทดลองตรวจร่างกายน้ำหนักเป็นพื้นฐานเลือดระดับน้ำตาลในสัตว์แต่ละแนะนำ 2: ทำความสะอาดหาง ด้วย 70% เอทานอล และย้ำสำหรับหมุนเวียนดีกว่าก่อนทำคลิปด้วยกรรไกรกอซในขั้นตอนไม่ใช่เทอร์มินัล เก็บตัวอย่างเลือด (เช่น μl ~ 30) จำนวนเพียงพอจากหลอดเลือดดำซาฟีนัสเส้นสำหรับการกำหนดแยกและอินซูลินเซรั่ม โดย radioimmunoassay (เรีย) เพื่อลดการ lysis ของเซลล์เม็ดเลือดแดง ทำ punctures หลายในหลอดเลือดดำซาฟีนัสเส้น ด้วยเข็มขนาดเล็ก และรวบรวมเลือดที่ใช้แยกซีรั่ม Microvette CB300 Zเตรียมกลูโคส 10% ใน PBS 1 x และหมันโซลูชัน โดย μm 0.2-กรองเตรียมฉีดโซลูชันใน eppendorf 0.5 ml หลอดละสัตว์ (2 มิลลิกรัมต่อน้ำหนักตัว กลูโคส/g) ระดับเสียง (μl) =น้ำหนักตัว (กรัม) x 20 ใช้แทนน้ำตาลกลูโคส 20% น้ำหนักควรมากกว่า 30 กรัมหมันบริเวณช่องท้องของสัตว์ด้วย 70% เอทานอล และทำความสะอาด ด้วยผ้าแห้งลูก กดค้างไว้ด้านหลังของสัตว์อย่างแน่นหนา และฉีดกลูโคส intraperitoneally เป็นผู้รับเรื่อง ด้วยเข็มใส่ 27-วัดTip3: อากาศเอาฟองก่อนฉีด และติดเข็มเข้าไปในร่างกายลึกเกินไป ทำการฉีดยาช้ากับมุม 30-45 องศาเซลเซียสเพื่อหลีกเลี่ยงการฉีดยาใต้ เลือกไซต์ฉีด จากตับ และแกน ventral เพื่อหลีกเลี่ยงความเสียหายไตย้ายสัตว์กลับเข้ากรงและวัดเลือดน้ำตาลในระดับที่ 15, 30, 60, 90 และ 120 นาที (หรือ 30, 60, 90, 120 และ 240 นาที) ควรใช้สัตว์ replicate น้อย 3-4 ครั้งแต่ละจุดข้อมูลพนักงานรูปที่ 1 รูปนี้ดัดแปลงจากต้นฉบับ (Zhang et al., 2002) ได้ หนู B6 เชื่อถูกฉีดที่เวลาเป็นศูนย์กับกลูโคส และตรวจสอบระดับน้ำตาลในเลือด และตามปกติค่าของเวลาเป็นศูนย์ แต่ละจุดข้อมูลแสดงถึงค่าเฉลี่ยของหนูละสามถึงห้า ค่าพื้นฐานของน้ำตาลในเลือดโดยปกติ ~ 100 mg/dl แสดงข้อมูลพนักงานที่นี่หมายเหตุโปรดทราบว่า เมาส์ผสานระหว่างเพศทั้งที่แตกต่างกัน อายุ และพื้นหลัง inbred สามารถแสดงคำตอบต่าง ๆ กลูโคส สามารถพบข้อมูลบางอย่างต้องใช้เฉพาะ phenotype ที่หลักสูตร http://phenome.jax.org/db/q?rtn=meas/สูตรPBS (pH 7.4) 0.8% NaCl0.02% kCl12 มม.โซเดียมฟอสเฟต ตอบโพรโทคอลนี้ถูกดัดแปลงจากงานที่ทำ โดย Dr. Maureen Gannon ที่ศูนย์การแพทย์มหาวิทยาลัยเวนเดอร์บิลธ์ PZ รับการสนับสนุนจากอาจารย์วิจัยในห้องปฏิบัติการ Cavener ที่มหาวิทยาลัยแห่งรัฐเพนซิลวาเนียการอ้างอิงเตียว P., McGrath, B., Li, s ได้ ตรงไปตรงมา อ. Zambito, F., Reinert, J., Gannon เมตร Ma คุณ McNaughton, Cavener, D. R. และคุณ (2002) Kinase อัลฟาปัจจัย 2 ตัวเริ่มต้น eukaryotic เงยเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการพัฒนาของระบบ postnatal เติบ โต และฟังก์ชันและชีวิตของตับอ่อน โมลของเซลล์ Biol 22(11): 3864-3874วิธีการโพรโทคอลนี้: เตียว P. (2011) การทดสอบยอมรับกลูโคสในหนู โพรโทคอลไบโอ 1(19): e159 http://www.bio-protocol.org/e159

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การทดสอบความอดทนกลูโคส [ บทคัดย่อ ] เป็นขั้นตอนมาตรฐานที่อยู่ภายนอกสามารถล้างได้อย่างรวดเร็วกลูโคสจากเลือด โดยเฉพาะ การดูดซึมของกลูโคสจากเลือดโดยเซลล์ถูกควบคุมโดยฮอร์โมนอินซูลิน ผลของความอดทนกลูโคส ( อาทิ เวลาล้างให้ปริมาณกลูโคส พบว่าปัญหากับการบำรุงรักษาของ homeostasis กลูโคสเมแทบอลิซึมของคาร์โบไฮเดรต ( ความต้านทานอินซูลินโรคเบาหวาน ฯลฯ )
ตามใครในช่องปากกลูโคสทดสอบความอดทนมาตรฐาน ( วิธี ) , ระดับน้ําตาลควรด้านล่าง 7.8 mmol / L ( 140 มิลลิกรัม / เดซิลิตร ) ระดับที่ 2 ชั่วโมง ระหว่างนี้และ 11.1 mmol / L ( 200 มก. / ดล. ) ระบุว่า " ความอดทน " กลูโคสบกพร่อง และระดับใด ๆข้างต้น 11.1 mmol / l ( 200 มก. / ดล. ) ยืนยันการวินิจฉัยโรคเบาหวาน

วัสดุและสารเคมี

หนู ( ~ 20 c57bl / 6j ( B6 ) ( 2-3 เดือน )
70% beta-d เอทานอล
( ) - กลูโคส ( ซิกม่า Aldrich หมายเลขบัญชีรายชื่อ : g8270 NaCl KCl )



เกลือฟอสเฟตโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( PBS ) ( ดูสูตร )

แอคคิวเช็คอุปกรณ์ความสะดวกสบายโค้ง glucometer ( โรชวินิจฉัย , รายการหมายเลข : 03537536001 ) ( ผลิตภัณฑ์นี้ได้ถูกยกเลิกไป ผลิตภัณฑ์ใหม่ของแอคคิวเช็คน่าจะใช้ได้ดีเช่นกัน )
อุปกรณ์เช่น quantifies กลูโคส amperometrically โดยการวัดปัจจุบันผลิตต่อออกซิเดชันของกลูโคสกรดกลูโคนิกโดยเอนไซม์กลูโคส หรือ กลูโคโนแล็กโทนโดยเนส .
27 วัดเข็ม ( เข็มเดียวใช้จัดโดยบริษัท Imcopa BD การแพทย์ รายการเลขที่ : bd305109 )
microvette cb300 ซีเซรั่มตัวคั่น ( Sarstedt , รายการหมายเลข : 16.440.100 )
acrodisc เข็มตัวกรอง 25 มม. w / 02 μ M HT tuffryn เมมเบรน ( พอล คอร์ปอเรชั่น , รายการหมายเลข : 41.92 )

หมายเหตุ : ขั้นตอนทดลองกระบวนงานที่เกี่ยวข้องกับสัตว์ต่อไปนี้ ( หนู ) ต้องได้รับความเห็นชอบจากคณะกรรมการ iacuc หรือเทียบเท่า การรักษาอย่างมีมนุษยธรรมของสัตว์ควรฝึกซ้อมตลอดเวลา
ใน cavener Lab ที่เราใช้ทดสอบความอดทนกลูโคสอย่างกว้างขวางในลักษณะของหนูขาดเป็ก / เงย ,การ eif2alpha ไคเนสที่สำคัญในการควบคุมสมดุลและการเข้ารหัสสำหรับ ER ( Zhang et al . , 2002 ) .
ขอรับ ~ 20 c57bl / 6j ( B6 ) ตัวผู้ 2-3 เดือน จากแจ็คสันในห้องปฏิบัติการ หรือ ฮาร์แลน teklad เอามาเลี้ยงในอาหารปกติประมาณ 2 สัปดาห์
เคล็ดลับที่ 1 : ผู้ชาย ถ้าไม่ได้จาก ครอกเดียวกันมีแนวโน้มที่จะต่อสู้กับแต่ละอื่น ๆ เพิ่มเพียง 3-4 สัตว์ต่อกระชัง และตรวจสอบพฤติกรรมก้าวร้าวใด ๆ .
สัตว์อย่างรวดเร็ว O / N ในกระชังสดด้วยน้ำ ~ 16 H วันก่อนการทดลอง
ตรวจสอบน้ำหนักรวมทั้งระดับน้ำตาลในเลือด รักษาสัตว์แต่ละ .
เคล็ดลับ 2 : ทำความสะอาดหางด้วยเอทานอล 70% และนวดให้หมุนเวียนดีขึ้นก่อนการตัดด้วยกรรไกร
ในขั้นตอนปลายไม่ปลอดเชื้อ รวบรวมปริมาณที่เพียงพอของเลือด ( เช่น~ 30 μ L ) จากหลอดเลือดดำซาฟีนัสเซรั่มอินซูลินและการแยกโดย radioimmunoassay ( RIA ) เพื่อลดการสลายของเม็ดเลือดแดงทำให้หลายรอยเจาะบนหลอดเลือดดำซาฟีนัสด้วยเข็มขนาดเล็ก และเก็บเลือดโดยใช้ microvette cb300 ซีเซรั่ม คั่น
เตรียมกลูโคสร้อยละ 10 ใน 1X PBS และฆ่าเชื้อโซลูชั่น 0.2 μ m-filtration .
เตรียมสารละลายฉีดใน 05 ml หลอดเพนดอร์ฟสำหรับสัตว์แต่ละตัว ( 2 mg glucose / กรัมน้ำหนักตัว ) ปริมาณ ( μ L ) = น้ำหนักตัว ( G ) x 20 ใช้ 20 % กลูโคสแทน ควรมีน้ำหนักตัวจะมากกว่า 30 G .
ฆ่าเชื้อช่องท้องของสัตว์กับแอลกอฮอล์ 70 % และทำความสะอาดกับลูกฝ้ายแห้ง จับด้านหลังของสัตว์ แน่น และฉีดกลูโคส พบเป็นผู้รับเรื่องด้วย 27 วัดฆ่าเชื้อเข็ม
tip3 :เอาฟองอากาศก่อนฉีด และไม่ติดเข็มเข้าไปในร่างกายลึกเกินไป การฉีดอย่างช้าๆด้วยมุม 30 45 ° C เพื่อหลีกเลี่ยงการฉีดใต้ผิวหนัง รับฉีดยาห่างจากตับ และใกล้ชิดกับแกน ) เพื่อหลีกเลี่ยงความเสียหายของไต
ใส่สัตว์ในกรง และวัดระดับน้ำตาลในเลือดที่เวลา 15 , 30 , 60 , 90 และ 120 นาที ( หรือ 30 , 60 , 90120 และ 240 นาที ) อย่างน้อย 3-4 ทำซ้ำสัตว์ควรจะใช้สำหรับแต่ละจุดเวลา ตัวแทนข้อมูล




รูปที่ 1 รูปนี้ถูกดัดแปลงจากต้นฉบับ ( Zhang et al . , 2002 ) อดอาหาร B6 หนูฉีดในเวลาที่ศูนย์กับกลูโคส และระดับกลูโคสในเลือดตรวจวัดและ Normalized ค่าของเวลาที่ศูนย์ แต่ละจุดข้อมูลเป็นค่าเฉลี่ยของหนูแต่ละสามถึงห้า