Materials and MethodsAnimals and ex

Materials and Methods
Animals and experimental groups

In all experiments, 6-to 8-wk-old female wild mice (C57BL/6) were used. The animals were randomly divided into four groups: (a) Control, (b) Notexin, (c) L-NAME (Notexin+L-NAME) and (d) SNP (Notexin+SNP). Animals were anesthetized and subsequently injected with 10ul of Notexin (25μg/ml in 0.9% NaCl; Latoxan, Rosans, France) into tibialis anterior (TA) muscles except for the first group. Mice were sacrificed at day 4 and 7 after Notexin injection. Animals of the L-NAME and SNP groups respectively received a 100 mg/kg dose of L-NAME (Santa Cruz, USA) or a 0.5 mg/kg dose of SNP (Sigma, USA) i.p. one day after Notexin injection. For animals sacrificed at day 7, additional one dose of injection i.p. of L-NAME or SNP was performed on day 4 post-injury. All experiments were performed in accordance with the guidelines of the Animal Experimentation Ethics Committee of the Southern Medical University. Injured TA muscles were collected and snap frozen for NO levels, RNA and protein analyses. For histology, muscles were collected and directly frozen in liquid nitrogen-cool isopentane.

Measurement of NO levels of muscle tissue

The muscle samples were collected as described above and tissue homogenates were made. After centrifugation, the supernatant of muscle tissue homogenate were used for next treatment. Protein concentrations were evaluated using a BCA assay kit (KeyGEN, China). The total concentration of nitrate and nitrite in the muscle supernatant were determined by Nitric Oxide Metabolite Detection Kit (PanEra, China) and the absorbance of sample was measured at 550nm wavelength using Multiscan Go microplate reader (ThermoFisher, Finland). Finally, the NO concentration was calculated according to the manufacturer's instructions.

RNA extraction and quantitative real-time PCR analysis

Total RNA was extracted from muscle tissue using RNA extraction kit (DongSheng, China), following manufacturer's recommendations. Total RNA (1ug) was then used for reverse transcription (RT) with commercially available kit (Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas). Real-time polymerase chain reaction (PCR) was performed in triplicate with an ABI Step One Plus system (Applied Biosystems, USA) and a fluorescence-labeled SYBR Green/ROX qPCR Master Mix kit (Fermentas) using specific primers. Muscle autoantigens (Mi-2, HARS, Ku-70, DNA-pkcs), eNOS, iNOS, nNOS,TLR3, TLR7, TNF-α, IL-1, IL-10, IL-6, TGF-β, MCP-1, MCP-3, MIP-1α and with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) taken as an endogenous control (primer sequences and sizes of product are listed in table 1) were detected. The results were analyzed with SOS2.1 software (Applied Biosystems). Expression of the genes was calculated from the accurate threshold cycle (Ct), which is the PCR cycle at which an increase in fluorescence from SYBR Green probes above the baseline signal can first be detected. The Ct values for GAPDH were compared with those from Mi-2, HARS, Ku-70, DNA-pkcs, eNOS, iNOS, nNOS, TLR3, TLR7, TNF-α, IL-10, IL-1, IL-6, TGF-β, MCP-1, MCP-3 and MIP-1α and in each well to calculate ΔCt. Data of the treated conditions were expressed relative to the signal obtained for the average of the untreated controls by the ΔΔCt calculation. The triplicate ΔΔCt values for each sample were averaged.

Western blot analysis

Skeletal muscle protein extraction was performed according to the manufacturer's protocol (KeyGEN, China). Protein concentrations were evaluated using a BCA assay kit (KeyGEN, China). Equal amounts of proteins were electrophoresed on 6-12% SDS-polyacrylamide gel and transferred to Immobilon P membrane (Millipore, USA). Membranes were blocked in 5% non-fat dried milk in Tris-buffered saline/Tween-20 (TBS-T: 20mM Tris, pH7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) for 1h at RT. The following rabbit polyclonal or mouse monoclonal antibody were used for detection: Rabbit polyclonal anti-Mi-2 (1:2000, abcam, USA); Rabbit polyclonal anti-HARS (1:500, NOVUS, USA); Rabbit polyclonal anti-Ku-70 (1:800, NOVUS, USA); Rabbit polyclonal anti-DNA-PKcs (1:100, Santa Cruz, USA) ;Rabbit polyclonal anti-TLR3 (1:800, abcam, USA); Rabbit polyclonal anti-TLR7 (1:200, Santa Cruz, USA); mouse monoclonal anti-GAPDH (1:3000, KANGCHEN, China). Primary antibodies were incubated for 20h at 4℃ in 5% non-fat dried milk in TBS-T. The membrane was then washed three times in TBS-T and incubated for 1h at RT with horseradish peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG (1:4000, Fudebio, China) or goat anti-mouse IgG (1:2000, CST, USA), in 5% non-fat dried milk in TBS-T. After three washes in TBS-T, the protein bands were visualized by enhanced chemiluminescence (ECL) detection reagents (Applygen Technologic Inc., China). Immunoreactive bands was detected by the ECL detection system (Protein Simple, USA), and densitometric values were analyzed with Quantity One (Bio-Rad, USA). Relative expression of each immunoreactive band was calculated by comparison with GAPDH.

Histological and immunofluorescence detection

Snap-frozen whole TA muscle was transversely cryosectioned (8μm), and either stained with hematoxylin and eosin or prepared for immunofluorescence. For immunofluorescence, muscle was fixed with cold acetone and incubated with rat anti-mouse F4/80 (1:200, eBioscience, USA); rat anti-mouse CD11b (1:200, eBioscience, USA); rat anti-mouse CD8α (1:200, eBioscience, USA); rat anti-mouse H-2Kb (1:100, BD, USA); rabbit polyclonal anti-caspase3 (1:500, abcam, USA);rabbit polyclonal anti-dystrophin (1:200, Santa Cruz, USA); or rabbit polyclonal anti-CD3ε (1:200, Abcam, USA). Rhodamine-conjugated goat anti-rat IgG (1:200, Santa Cruz, USA), FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:200, Santa Cruz, USA) or Alexa 568-conjugated rat anti-mouse IgG (1:1000, Invitrogen, USA) were used as secondary antibodies. Nuclei were counterstained with DAPI. Slides were viewed with an Olympus BX51 fluorescence microscope (Olympus, Japan). For results analysis, the Image J software was performed to quantify the intensity of staining. The integrated optical density (IOD) and area of interest (AOI) of all the positive staining (intense red staining) were measured, respectively. The mean density (IOD/AOI) was then calculated. Cell apoptosis was determined by counting the number of CD11b+caspase-3+ cells and expressed as a percentage of total CD11b+cells counted.

Statistical Analysis

All data are expressed as mean ± standard deviation (SD). One-way ANOVA was used for multiple comparisons (Duncan's multiple range test) using SPSS ver.13.0 software. P values

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการสัตว์และกลุ่มทดลองในการทดลองทั้งหมด มีใช้ 6 กับ 8-wk-อายุเพศหญิงหนูป่า (C57BL/6) สัตว์ถูกสุ่มแบ่งออกเป็นสี่กลุ่ม: ควบคุม (ก) (b) Notexin, (c) -ชื่อ L (ชื่อ Notexin + L) และ (d) SNP (Notexin + SNP) สัตว์ด้วย และต่อมาฉีดกับ 10ul ของ Notexin (25μg/ml 0.9% NaCl Latoxan, Rosans ฝรั่งเศส) เป็น tibialis แอนทีเรียร์ (TA) กล้ามเนื้อยกเว้นกลุ่มแรก หนูได้เสียสละวัน 4 และ 7 หลังฉีด Notexin สัตว์ในกลุ่มชื่อ L และ SNP ตามลำดับปริมาณ 100 มิลลิกรัม/กิโลกรัมของ L ชื่อ (ซานตาครูซ สหรัฐอเมริกา) หรือยา 0.5 mg/kg ของ i.p. SNP (ซิก สหรัฐอเมริกา) หนึ่งวันหลังจากฉีด Notexin รับ สำหรับสัตว์ที่เสียสละวัน 7 ยาหนึ่งเพิ่มเติมของฉีด i.p. ของชื่อ L หรือ SNP ที่ดำเนินการในวันที่ 4 หลังบาดเจ็บ ทดลองทั้งหมดได้ดำเนินการตามแนวทางของคณะกรรมการจริยธรรมการทดลองสัตว์แพทย์มหาวิทยาลัยภาคใต้ กล้ามเนื้อตาบาดเจ็บถูกเก็บรวบรวม และจัดชิดแช่ไม่ระดับ อาร์เอ็นเอ และโปรตีนวิเคราะห์ สำหรับมิญชวิทยา กล้ามเนื้อถูกรวบรวม และแช่แข็งใน isopentane เย็นไนโตรเจนเหลวโดยตรงการวัดระดับไม่มีเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อตัวอย่างกล้ามเนื้อถูกเก็บรวบรวมตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และทำเนื้อเยื่อ homogenates หลัง centrifugation, supernatant ของ homogenate เนื้อเยื่อกล้ามเนื้อถูกใช้ในการรักษาต่อไป ความเข้มข้นของโปรตีนถูกประเมินโดยใช้ชุดทดสอบ BCA (KeyGEN จีน) ความเข้มข้นรวมของไนเตรตและไนไตรต์ในกล้ามเนื้อ supernatant ถูกกำหนด โดยชุดตรวจ Metabolite ไนตริกออกไซด์ (PanEra จีน) และมีวัด absorbance ของตัวอย่างที่ความยาวคลื่น 550nm ใช้ไป Multiscan microplate reader (ThermoFisher ฟินแลนด์) สุดท้าย ความเข้มข้นไม่ได้คำนวณตามคำแนะนำของผู้ผลิตเชิงปริมาณวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์และสกัดอาร์เอ็นเออาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อโดยใช้ชุดสกัดอาร์เอ็นเอ (ตงเฉิง จีน), ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต อาร์เอ็นเอทั้งหมด (1ug) แล้วใช้สำหรับย้อน transcription (RT) กับชุดใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ (กลับช่วยแรกเดอะ cDNA สังเคราะห์ชุด Fermentas) ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบเรียลไทม์ (PCR) ที่ดำเนินการใน triplicate ด้วย ABI ขั้นตอนเดียวพร้อมระบบการ (Biosystems ใช้ สหรัฐอเมริกา) และมีป้าย fluorescence SYBR Green/ROX qPCR ชุดผสมหลัก (Fermentas) ใช้เฉพาะไพรเมอร์ ฟื้นฟูกล้ามเนื้อ autoantigens (Mi-2, HARS, 70 มก. ดีเอ็นเอ-pkcs), eNOS, iNOS, nNOS, TLR3, TLR7, TNF-α IL-1, IL-10, MCP IL-6, TGF-β -1, MCP 3, MIP 1α dehydrogenase glyceraldehyde-3-ฟอสเฟต (GAPDH) มาเป็นตัวควบคุม endogenous และ (รองพื้นลำดับและขนาดของผลิตภัณฑ์แสดงในตาราง 1) พบ ผลลัพธ์ได้วิเคราะห์ ด้วยซอฟต์แวร์ SOS2.1 (Biosystems ใช้) ของยีนถูกคำนวณจากรอบขีดจำกัดที่ถูกต้อง (Ct), ซึ่งเป็นวงจร PCR ที่เพิ่มใน fluorescence จากคลิปปากตะเข้ SYBR Green ด้านบนสัญญาณพื้นฐานสามารถแรกพบ ค่าของ Ct GAPDH ถูกเทียบกับ Mi-2, HARS, 70 มก. ดีเอ็นเอ-pkcs, eNOS, iNOS, nNOS, TLR3, TLR7, TNF-α IL-10, IL-1, IL-6, TGF-β MCP 1, MCP-3 และ MIP 1α และ ในแต่ละดีคำนวณ ΔCt มีแสดงข้อมูลเงื่อนไขบำบัดสัมพันธ์กับสัญญาณที่ได้จากการคำนวณ ΔΔCt ของตัวควบคุมไม่ถูกรักษา ค่า triplicate ΔΔCt สำหรับแต่ละตัวอย่างถูก averagedวิเคราะห์ตะวันตกคืนในตามีดำเนินการสกัดโปรตีนกล้ามเนื้ออีกตามของโพรโทคอล (KeyGEN จีน) ความเข้มข้นของโปรตีนถูกประเมินโดยใช้ชุดทดสอบ BCA (KeyGEN จีน) จำนวนเท่าของโปรตีนถูก electrophoresed ใน 6-12% SDS polyacrylamide เจล และโอนย้ายไป Immobilon P เมมเบรน (มาก สหรัฐอเมริกา) เข้าบล็อกในนมแห้งไม่ใช่ไขมัน 5% ในทริสเรทติ้ง buffered น้ำ เกลือ/Tween-20 (TBS-t:กำลังตรี pH7.5, NaCl, 150 มม. 20 มม. 0.05% Tween-20) สำหรับ h 1 ที่ RT. ต่อไปนี้กระต่าย polyclonal หรือเมาส์ใช้สำหรับการตรวจหาแอนติบอดี monoclonal: กระต่าย polyclonal ป้องกัน-Mi-2 (1:2000, abcam สหรัฐอเมริกา); กระต่าย polyclonal ต่อต้าน-HARS (1: 500 โนวัส สหรัฐอเมริกา); กระต่าย polyclonal ป้องกัน-Ku-70 (1:800 โนวัส สหรัฐอเมริกา); กระต่าย polyclonal ป้องกัน-DNA-PKcs (1: 100 ซานตาครูซ สหรัฐอเมริกา);กระต่าย polyclonal ต่อต้าน-TLR3 (1:800, abcam สหรัฐอเมริกา); กระต่าย polyclonal ต่อต้าน-TLR7 (1: 200 ซานตาครูซ สหรัฐอเมริกา); เมาส์โมโนต่อต้าน-GAPDH (1:3000, KANGCHEN จีน) แอนตี้หลักถูก incubated สำหรับ 20h ที่ 4 ℃นมแห้งไม่ใช่ไขมัน 5% ในต. TBS เมมเบรนแล้วล้างสามครั้งใน TBS T และ incubated สำหรับ h 1 ที่ RT กับ horseradish peroxidase กลวงแพะป้องกันกระต่าย IgG (1:4000, Fudebio จีน) หรือแพะป้องกันเมาส์ IgG (1:2000, CST สหรัฐอเมริกา), 5% ไม่ใช่ไขมันแห้งนมในต. TBS หลังจาก washes สามใน TBS-T แถบโปรตีนมี visualized โดย reagents ตรวจพิเศษ chemiluminescence (ECL) (Applygen Technologic Inc. จีน) วง immunoreactive ตรวจพบ โดยระบบตรวจสอบ ECL (โปรตีนอย่างง่าย สหรัฐอเมริกา), และค่า densitometric ถูกวิเคราะห์ ด้วยปริมาณหนึ่ง (Bio Rad สหรัฐอเมริกา) มีคำนวณค่าสัมพัทธ์ของแต่ละวง immunoreactive by comparison with GAPDHตรวจสอบลักษณะทางสรีรวิทยา immunofluorescenceสแนปแช่แข็งกล้ามเนื้อตาทั้งหมดคือ transversely cryosectioned (8μm), และทั้งสี hematoxylin และ eosin หรือเตรียม immunofluorescence สำหรับ immunofluorescence กล้ามเนื้อถูกถาวร ด้วยอะซีโตนเย็น และ incubated กับหนูเมาส์ป้องกัน 80 F4 (1: 200, eBioscience สหรัฐอเมริกา); ราษฎร์ CD11b เมาส์ป้องกัน (1: 200, eBioscience สหรัฐอเมริกา); ราษฎร์ CD8α เมาส์ป้องกัน (1: 200, eBioscience สหรัฐอเมริกา); หนูป้องกันเมาส์ H - 2 Kb (1: 100, BD สหรัฐอเมริกา); กระต่าย polyclonal ต่อต้าน-caspase3 (1: 500, abcam สหรัฐอเมริกา) กระต่าย polyclonal ป้องกัน-dystrophin (1: 200 ซานตาครูซ สหรัฐอเมริกา); หรือกระต่าย polyclonal ต่อต้าน-CD3ε (1: 200, Abcam สหรัฐอเมริกา) หนูป้องกันแพะ rhodamine กลวง IgG (1: 200 ซานตาครูซ สหรัฐอเมริกา), แพะ FITC กลวงป้องกันกระต่าย IgG (1: 200 ซานตาครูซ สหรัฐอเมริกา) หรือเมาส์ป้องกันหนู Alexa 568 กลวง IgG (1:1000, Invitrogen สหรัฐอเมริกา) ที่เคยเป็นแอนตี้รอง แอลฟามี counterstained ด้วย DAPI ภาพนิ่งที่ดู ด้วยกล้องจุลทรรศน์การ fluorescence Olympus BX51 (โอลิมปัส ญี่ปุ่น) สำหรับการวิเคราะห์ผล ซอฟต์แวร์ภาพ J ที่ดำเนินการวัดปริมาณความเข้มของการย้อมสี ความหนาแน่นออปติคอลรวม(บริษัทไทย IOD) และพื้นที่ที่น่าสนใจ (AOI) ของทั้งหมดบวกย้อมสี (เข้มข้นสีแดงย้อมสี) ถูกวัด ตามลำดับ จากนั้นมีคำนวณความหนาแน่นเฉลี่ย (IOD AOI) กำหนด apoptosis ของเซลล์ โดยการนับจำนวนของ CD11b + caspase-3 + เซลล์ และแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของ CD11b + เซลล์นับรวมวิเคราะห์ทางสถิติข้อมูลทั้งหมดจะแสดงเป็นเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวสำหรับหลายเปรียบ (ของดันแคนหลายช่วงทดสอบ) โดยใช้โปรแกรมซอฟต์แวร์ ver.13.0 P ค่า < ได้ถืออย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ 0.05

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
สัตว์และกลุ่มทดลองในการทดลองทั้งหมด 6 ถึง 8 สัปดาห์หญิงอายุหนูป่า (C57BL / 6) ถูกนำมาใช้ สัตว์ที่ถูกแบ่งออกเป็นสี่กลุ่ม (ก) การควบคุม (ข) Notexin (ค) L-NAME (Notexin + L-NAME) และ (ง) SNP (Notexin + SNP) สัตว์ที่ถูกวางยาสลบและฉีดต่อมา 10ul ของ Notexin (25μg / ml ใน 0.9% NaCl; Latoxan, Rosans, ฝรั่งเศส) เป็น tibialis ล่วงหน้า (TA) กล้ามเนื้อยกเว้นกลุ่มแรก หนูถูกเสียสละในวันที่ 4 และ 7 หลังฉีด Notexin สัตว์ของ L-ชื่อและกลุ่ม SNP ตามลำดับที่ได้รับ 100 mg / kg ปริมาณของ L-NAME (ซานตาครูซ, ประเทศสหรัฐอเมริกา) หรือ 0.5 mg / kg ปริมาณของ SNP (Sigma, ประเทศสหรัฐอเมริกา) ip วันหนึ่งหลังจากที่ฉีด Notexin สำหรับสัตว์ที่เสียสละในวันที่ 7 ซึ่งเป็นหนึ่งในปริมาณที่เพิ่มขึ้นของ ip ฉีด L-ชื่อหรือ SNP ได้ดำเนินการในวันที่ 4 หลังการได้รับบาดเจ็บ การทดสอบทั้งหมดได้ดำเนินการตามแนวทางของคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยในสัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยเซาเทิร์การแพทย์ ได้รับบาดเจ็บกล้ามเนื้อ TA ถูกเก็บรวบรวมและแช่แข็งจนกว่าระดับ NO, RNA และการวิเคราะห์โปรตีน สำหรับจุลกล้ามเนื้อถูกเก็บรวบรวมและแช่แข็งโดยตรงในของเหลว Isopentane ไนโตรเจนเย็น. การวัดระดับ NO ของเนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อตัวอย่างกล้ามเนื้อถูกเก็บตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและ homogenates เนื้อเยื่อที่ถูกสร้างขึ้น หลังจากหมุนเหวี่ยงใสของ homogenate เนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อถูกนำมาใช้ในการรักษาต่อไป ความเข้มข้นของโปรตีนได้รับการประเมินโดยใช้ชุดทดสอบ BCA (Keygen, จีน) ความเข้มข้นรวมของไนเตรทไนไตรท์ในสารละลายของกล้ามเนื้อได้รับการพิจารณาโดยไนตริกออกไซด์ Metabolite ตรวจจับ Kit (Panera, จีน) และการดูดกลืนแสงของกลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการวัดที่ความยาวคลื่น 550nm ใช้ Multiscan ไปอ่าน microplate (ThermoFisher, ฟินแลนด์) ในที่สุดความเข้มข้น NO ที่คำนวณได้ตามคำแนะนำของผู้ผลิต. สกัดอาร์เอ็นเอและเชิงปริมาณแบบ real-time PCR วิเคราะห์รวมอาร์เอ็นเอเป็นสารสกัดจากเนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อโดยใช้ชุดการสกัดอาร์เอ็นเอ (DongSheng, จีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต รวมอาร์เอ็นเอ (1UG) ถูกนำมาใช้สำหรับการถอดความย้อนกลับ (RT) กับชุดใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ (Revert ปฐมพยาบาล Strand ยีนสังเคราะห์ชุด Fermentas) เรียลไทม์วิธี Polymerase chain reaction (PCR) ได้รับการดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่าด้วยระบบ ABI ขั้นตอนที่หนึ่งพลัส (Applied Biosystems, ประเทศสหรัฐอเมริกา) และการเรืองแสงที่มีสัญลักษณ์สีเขียว SYBR / ROX qPCR ชุด Master Mix (Fermentas) โดยใช้ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจง autoantigens กล้ามเนื้อ (Mi-2, HARS, Ku-70, ดีเอ็นเอ PKCS) eNOS, อิโนส์, NNOS, TLR3, TLR7, TNF-α, IL-1, IL-10, IL-6, TGF-β, MCP- 1, MCP-3, MIP-1αและ dehydrogenase glyceraldehyde-3-ฟอสเฟต (GAPDH) นำมาเป็นตัวควบคุมภายนอก (ลำดับไพรเมอร์และขนาดของผลิตภัณฑ์ที่ระบุไว้ในตารางที่ 1) ได้รับการตรวจพบ ผลที่ได้มาวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ที่ SOS2.1 (Applied Biosystems) การแสดงออกของยีนที่คำนวณได้จากวงจรที่ถูกต้องเกณฑ์ (กะรัต) ซึ่งเป็นวงจร PCR ที่เพิ่มขึ้นในการเรืองแสงจากยานสำรวจเขียว SYBR ข้างต้นสัญญาณพื้นฐานแรกที่สามารถตรวจพบได้ ค่ากะรัตสำหรับ GAPDH ถูกเมื่อเทียบกับผู้ที่มาจาก Mi-2, HARS, Ku-70, ดีเอ็นเอ PKCS, eNOS, อิโนส์, NNOS, TLR3, TLR7, TNF-α, IL-10, IL-1, IL-6, TGF-β, MCP-1, MCP-3 และ MIP-1αและในแต่ละดีในการคำนวณΔCt ข้อมูลของสภาพได้รับการรักษาที่ถูกแสดงเมื่อเทียบกับสัญญาณที่ได้รับค่าเฉลี่ยของการควบคุมได้รับการรักษาโดยการคำนวณΔΔCt ค่าΔΔCtเพิ่มขึ้นสามเท่าสำหรับแต่ละตัวอย่างถูกเฉลี่ย. วิเคราะห์ดวงตะวันสกัดโปรตีนกล้ามเนื้อโครงร่างที่ได้ดำเนินการตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (Keygen, จีน) ความเข้มข้นของโปรตีนได้รับการประเมินโดยใช้ชุดทดสอบ BCA (Keygen, จีน) ปริมาณที่เท่ากันของโปรตีนที่ถูก electrophoresed ใน 6-12% เจล SDS-polyacrylamide และโอนไปยัง Immobilon P เมมเบรน (ค, ประเทศสหรัฐอเมริกา) เยื่อถูกบล็อกใน 5% ไม่ไขมันนมแห้งในน้ำเกลือ Tris บัฟเฟอร์ / Tween-20 (TBS-T: 20mm Tris, pH7.5, 150 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 0.05% Tween-20) สำหรับ 1h ที่ RT โพลีกระต่ายต่อไปหรือเมาส์แอนติบอดีถูกนำมาใช้สำหรับการตรวจสอบ: โพลีกระต่ายต่อต้าน Mi-2 (1: 2000, Abcam สหรัฐอเมริกา); กระต่ายโพลีต่อต้าน HARS (1: 500, NOVUS สหรัฐอเมริกา); กระต่ายโพลีต่อต้าน Ku-70 (1: 800, NOVUS สหรัฐอเมริกา); กระต่ายโพลีต่อต้านดีเอ็นเอ PKCS (1: 100, ซานตาครูซ, ประเทศสหรัฐอเมริกา); กระต่ายโพลีต่อต้าน TLR3 (1: 800, Abcam สหรัฐอเมริกา); กระต่ายโพลีต่อต้าน TLR7 (1: 200, ซานตาครูซ, ประเทศสหรัฐอเมริกา); เมาส์โมโนโคลนอลต่อต้าน GAPDH (1: 3000, KANGCHEN, จีน) แอนติบอดีหลักถูกบ่มสำหรับ 20h ที่ 4 ℃ใน 5% ไม่ไขมันนมแห้งใน TBS-T เมมเบรนจากนั้นก็ล้างสามครั้งใน TBS-T และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ RT กับแพะผัน peroxidase มะรุม IgG ต่อต้านกระต่าย (1: 4000, Fudebio, จีน) หรือแพะ IgG ต่อต้านเมาส์ (1: 2000, CST, ประเทศสหรัฐอเมริกา) ใน 5% ไม่ไขมันนมแห้งใน TBS-T หลังจากสามล้างใน TBS-T, แถบโปรตีนที่ถูกมองเห็นโดยเพิ่ม chemiluminescence (ECL) น้ำยาตรวจจับ (Applygen Technologic Inc. , จีน) วง Immunoreactive ถูกตรวจพบโดยระบบการตรวจสอบ ECL (โปรตีน Simple, USA) และค่านิยม densitometric ถูกวิเคราะห์ด้วยจำนวนหนึ่ง (Bio-Rad, ประเทศสหรัฐอเมริกา) การแสดงออกของความสัมพันธ์ของแต่ละกลุ่ม immunoreactive ที่คำนวณได้จากการเปรียบเทียบกับ GAPDH. จุลกายวิภาคและการตรวจสอบ immunofluorescence Snap แช่แข็งทั้งกล้ามเนื้อ TA ถูก cryosectioned ขวาง (8μm) และทั้งย้อมด้วย hematoxylin และ Eosin หรือจัดเตรียมไว้สำหรับ immunofluorescence สำหรับ immunofluorescence กล้ามเนื้อได้รับการแก้ไขด้วยอะซีโทนเย็นและบ่มกับหนูต่อต้านเมาส์ F4 / 80 (1: 200, eBioscience สหรัฐอเมริกา); หนู CD11b ต่อต้านเมาส์ (1: 200, eBioscience สหรัฐอเมริกา); หนูCD8αต่อต้านเมาส์ (1: 200, eBioscience สหรัฐอเมริกา); หนูต่อต้านเมาส์ H-2Kb (1: 100, BD, ประเทศสหรัฐอเมริกา); กระต่ายโพลีต่อต้าน caspase3 (1: 500, Abcam สหรัฐอเมริกา); กระต่ายโพลีต่อต้าน dystrophin (1: 200, ซานตาครูซ, ประเทศสหรัฐอเมริกา); หรือกระต่ายโพลีต่อต้านCD3ε (1: 200, Abcam, ประเทศสหรัฐอเมริกา) โรดามีน-ผันแพะ IgG ต่อต้านหนู (1: 200, ซานตาครูซ, ประเทศสหรัฐอเมริกา), FITC-ผันแพะ IgG ต่อต้านกระต่าย (1: 200, ซานตาครูซ, ประเทศสหรัฐอเมริกา) หรือของ Alexa 568-ผันหนู IgG ต่อต้านเมาส์ (1: 1000, Invitrogen, ประเทศสหรัฐอเมริกา) ถูกนำมาใช้เป็นแอนติบอดี้ที่สอง นิวเคลียสถูก counterstained กับ DAPI ภาพนิ่งที่ถูกมองด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง Olympus BX51 (Olympus, ญี่ปุ่น) สำหรับการวิเคราะห์ผล, ซอฟแวร์ภาพ J ได้รับการดำเนินการเพื่อปริมาณความเข้มของการย้อมสี ความหนาแน่นของแสงแบบบูรณาการ (IOD) และพื้นที่ที่น่าสนใจ (AOI) ของทุกการย้อมสีที่เป็นบวก (รุนแรงย้อมสีแดง) วัดตามลำดับ ความหนาแน่นเฉลี่ย (IOD / AOI) ที่คำนวณแล้ว การตายของเซลล์ที่ถูกกำหนดโดยการนับจำนวนของ CD11b + caspase-3 เซลล์ + และแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์จากทั้งหมด CD11b + เซลล์นับ. สถิติวิเคราะห์ข้อมูลทั้งหมดจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) One-way ANOVA ถูกนำมาใช้สำหรับการเปรียบเทียบหลาย ๆ (ดันแคนทดสอบช่วงหลาย) โดยใช้โปรแกรม SPSS ver.13.0 ค่า p <0.05 ได้รับการพิจารณาเป็นนัยสำคัญทางสถิติ