HCCSCs were seeded at a density of

HCCSCs were seeded at a density of 2.0 × 106 cells per culture plate in HCCSC growth media for 24 hours. After 24 hours of incubation, the cells were treated with 5-fluorouracil (IC(50) 570 μM or 75 μg/mL) or methanol extract of triphala (MET, IC(50), 104 μg/mL) in HCCSC serum free media and incubated for 24 hours. Cells were used for nuclear and cytoplasmic proteins separation according to the protocol supplied by NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Cytoplasmic or nuclear protein extracts (40 μg) were incubated at 98°C for 5 minutes and separated by 4–12% Bis-Tris precast gels (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) at 120 V for 2 hours in MOPS running buffer (Bio-Rad) and electrophoretically transferred to PVDF Immobilon-FL membrane (Millipore, Billerica, MA) at 35 V for 95 minutes in TBS transfer buffer. PVDF membranes were incubated in superblock solution (Thermo Fisher Scientific) for 2 hours at room temperature. Membranes were then incubated with either PARP rabbit monoclonal antibody, Bax rabbit monoclonal antibody (1 : 1000; Cell Signaling Technology), rabbit anti-Bcl-2 antibody, mouse DNA topoisomerase IIβ, mouse polyclonal anti-cyclin D1 antibody, mouse polyclonal anti-c-Myc antibody, or goat polyclonal anti-β-actin antibody (1 : 500, Santa Cruz Biotechnology, Paso Robles, CA) for 2 hours at room temperature. Membranes were subsequently washed with TBS with 0.1% Tween 20 and then probed with IR dye conjugated secondary antibodies, donkey anti-goat, goat anti-rabbit, or goat anti-mouse IR dye 800 or IR dye 680 obtained from LICOR Biosciences, Lincoln (1 : 100,000). All antibody dilutions were made in superblock solution. The membranes were scanned using an Odyssey infrared image system (LICOR Biosciences, Lincoln, NE) and the band intensities were quantified using the Odyssey software and normalized to β-actin, a loading control for cytosolic proteins, or to DNA topoisomerase IIβ, a loading control for nuclear proteins.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

HCCSCs ถูก seeded ที่ความหนาแน่น 2.0 × 106 เซลล์ต่อจานวัฒนธรรมสื่อ HCCSC เติบโต 24 ชั่วโมง หลังจาก 24 ชั่วโมงของคณะทันตแพทยศาสตร์ เซลล์ได้รับการรักษา ด้วย 5-fluorouracil (IC(50) 570 μM หรือ μg 75 mL) หรือเมทานอลสารสกัดของ triphala (MET, IC(50), μg 104/mL) ในสื่อฟรีเซรั่ม HCCSC และ incubated ตลอด 24 ชั่วโมง เซลล์ที่ใช้สำหรับการแยกโปรตีน cytoplasmic และนิวเคลียร์ตามโพรโทคอลโดย NE-ต่อโปรตีน Cytoplasmic แยกชุด (เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์ ร็อคฟอร์ด IL) และนิวเคลียร์ (40 μg) สารสกัดจากโปรตีน cytoplasmic หรือนิวเคลียร์ได้ incubated ที่ 98° C 5 นาทีคั่น ด้วยเจสำเร็จทริสเรทติ้ง Bis 4-12% (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิส แคลิฟอร์เนีย) ที่ 120 V 2 ชั่วโมงใน MOPS ใช้บัฟเฟอร์ (ไบ-Rad) และ electrophoretically โอนย้ายไปเมมเบรน PVDF Immobilon-FL (มาก Billerica, MA) ที่ 35 V นาที 95 ในบัฟเฟอร์ TBS โอนย้าย สาร PVDF มี incubated ในการแก้ปัญหาช่าง (เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์) 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เข้าได้แล้ว incubated กับแอนติบอดีทั้ง PARP กระต่าย monoclonal, Bax กระต่าย monoclonal แอนติบอดี (1:1000 เซลล์เทคโนโลยี Signaling), แอนติบอดีต้าน Bcl 2 กระต่าย เมาส์ DNA topoisomerase IIβ เมาส์ polyclonal cyclin ต้านง 1 แอนติบอดี แอนติบอดี anti-c-Myc polyclonal เมาส์ หรือแพะ polyclonal ป้องกัน-β-แอกตินแอนติบอดี (1:500 ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ พาโซ Robles, CA) 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เข้ามาได้ถูกล้างกับ TBS ด้วย 0.1% Tween 20 และพิสูจน์แล้ว กับ IR ย้อมกลวงรองแอนตี้ ลาป้องกันแพะ แพะกระต่ายป้องกัน หรือแพะเมาส์ป้องกัน IR ย้อม 800 หรือ IR ย้อม 680 ได้จากเวลาออก LICOR ลินคอล์น (1:100000) Dilutions แอนติบอดีทั้งหมดที่เกิดขึ้นในการแก้ปัญหาช่าง สารถูกสแกนโดยใช้เป็นระบบภาพอินฟราเรดการโคลง (เวลาออก LICOR ลินคอล์น NE) และปลดปล่อยก๊าซวงถูก quantified โดยใช้ซอฟต์แวร์โคลง และตามปกติβ-แอกติ น ตัวควบคุมการโหลดสำหรับโปรตีน cytosolic หรือ DNA topoisomerase IIβ ควบคุมการโหลดสำหรับโปรตีนนิวเคลียร์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

HCCSCs เมล็ดในอัตราความหนาแน่น 2.0 × 106 เซลล์ต่อแผ่นวัฒนธรรมในสื่อการเจริญเติบโต HCCSC 24 ชั่วโมง หลังจาก 24 ชั่วโมงของการบ่มเซลล์ได้รับการรักษาด้วย 5-fluorouracil (IC (50) 570 ไมครอนหรือ 75 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) หรือสารสกัดจากเมทานอลของ triphala (MET ไอซี (50), 104 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) ใน HCCSC ซีรั่มสื่อฟรี และบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ที่ถูกใช้สำหรับโปรตีนนิวเคลียร์และนิวเคลียสแยกตามโปรโตคอลที่จัดทำโดย NE-PER นิวเคลียร์นิวเคลียสและโปรตีนสกัด Kit (เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์, ฟอร์ด, IL) สารสกัดจากโปรตีนนิวเคลียสหรือนิวเคลียร์ (40 ไมโครกรัม) ได้รับการบ่มที่ 98 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีและแยกจากกันโดย 4-12% Bis-ทริสเจลสำเร็จรูป (Bio-Rad ห้องปฏิบัติการ, ดาว, CA) ที่ 120 V 2 ชั่วโมงใน MOPS ทำงานบัฟเฟอร์ (Bio-Rad) และโอน electrophoretically เพื่อ PVDF เมมเบรน Immobilon ฟลอริดา (คบิลเลริกา, MA) ที่ 35 V 95 นาทีในบัฟเฟอร์โอน TBS เยื่อ PVDF ถูกบ่มในการแก้ปัญหา superblock (เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เยื่อถูกบ่มแล้วกับทั้งแอนติบอดีกระต่าย PARP โมโนโคลนอลแอนติบอดีกระต่ายโมโนโคลนอลแบ็กซ์ (1: 1000 การส่งสัญญาณโทรศัพท์มือถือเทคโนโลยี) กระต่ายต่อต้าน Bcl-2 แอนติบอดีดีเอ็นเอ topoisomerase IIβเมาส์, โพลีเมาส์ต่อต้าน cyclin D1 แอนติบอดี, โพลีเมาส์ต่อต้าน C-Myc แอนติบอดีหรือแพะโพลีแอนติบอดีต่อต้านβ-โปรตีน (1: 500, ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพโซโรเบิลส์) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เยื่อถูกล้างในภายหลังกับ TBS กับ Tween 0.1% ที่ 20 และการตรวจสอบแล้วกับ IR ย้อมแอนติบอดีรองผันลาต่อต้านแพะแพะต่อต้านกระต่ายหรือแพะต่อต้านเมาส์ IR ย้อม 800 หรือสีย้อม IR 680 ที่ได้รับจาก Licor ชีววิทยาศาสตร์ลิงคอล์น ( 1: 100,000) เจือจางแอนติบอดีทั้งหมดถูกสร้างขึ้นในการแก้ปัญหา superblock เยื่อถูกสแกนโดยใช้ระบบภาพอินฟราเรดโอดิสซี (Licor ชีววิทยาศาสตร์ลิงคอล์น, NE) และความเข้มของวงดนตรีที่ได้รับปริมาณการใช้ซอฟต์แวร์โอดิสซีและปกติเบต้าโปรตีนควบคุมโหลดโปรตีน cytosolic หรือดีเอ็นเอ topoisomerase IIβ, โหลด ควบคุมโปรตีนนิวเคลียร์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

hccscs ถูก seeded ในอัตราความหนาแน่น 2.0 × 106 เซลล์ต่อจานวัฒนธรรมในสื่อการเจริญเติบโต hccsc ตลอด 24 ชั่วโมง หลังจาก 24 ชั่วโมง 1 , เซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย 5-fluorouracil ( IC ( 50 ) 570  μ M หรือ 75  μ g / ml ) หรือ เมทานอล สารสกัดตรีผลา ( เจอ IC ( , 50 ) 104  μ g / ml ) ซีรั่ม hccsc สื่ออิสระและบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงเซลล์มีการใช้นิวเคลียร์ และพบโปรตีนแยกตามพิธีสารนี้จัดโดย ne-per นิวเคลียร์และชุดสกัดโปรตีน ( เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ , Rockford , อิลลินอยส์ ) พบสารสกัดจากโปรตีนหรือนิวเคลียร์ (  μ 40 กรัมอุณหภูมิ 98 ° C เป็นเวลา 5 นาทีและแยกจากกันโดย 4 – 12 % ทวิหรือเจล ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการสำเร็จรูป , Hercules ,แคลิฟอร์เนีย ) ที่ 120   V 2 ชั่วโมงในไม้ถูพื้นวิ่งบัฟเฟอร์ ( ไบโอ ราด ) และ electrophoretically ย้ายไป immobilon FL เมมเบรน PVDF ( มิลลิ , โตเกียว , MA ) ที่ 35   V 95 นาทีในการบัฟเฟอร์ TBS . PVDF คือ superblock membranes ) โซลูชั่น ( เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ ) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง เยื่อ แล้วบ่มด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดี parp กระต่าย ,แบ็กส์กระต่ายโมโนโคลนอลแอนติบอดี ( 1   :   1000 ; สัญญาณมือถือเทคโนโลยี ) , กระต่าย anti-bcl-2 แอนติบอดีเมาส์ดีเอ็นเอชนิด II บีตา เมาส์ใช้ที่มีแอนติบอดีต่อต้าน D1 , เมาส์ใช้ anti-c-myc แอนติบอดี หรือแพะใช้ anti - บีตา - actin แอนติบอดี ( 1   :   500 , Santa Cruz เทคโนโลยีชีวภาพ , Paso Robles , CA ) สำหรับ 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เยื่อ จัดการล้างกับ TBS กับ 01 tween 20 แล้วตรวจสอบและย้อมและแอนติบอดีต่อต้านรอง ลา แพะ แพะ กระต่าย แพะ ต่อต้าน หรือ ป้องกัน เมาส์และย้อม 800 หรือ IR สี 680 ที่ได้รับจาก licor ชีววิทยาศาสตร์ ลินคอล์น ( 1   :   100000 ) โดยวิธีการทั้งหมดถูกทำใน superblock โซลูชั่น เมมเบรนมีการสแกนโดยใช้ Odyssey อินฟราเรดระบบภาพ ( licor ชีววิทยา ลินคอล์น