The plant apoplast is the intercell

The plant apoplast is the intercellular space that surrounds plant cells. This is a dynamic environment in which many metabolic and transport processes take place. The major structural component of the apoplast is the cell wall, which is assembled and modified by enzymes, structural proteins and metabolites located within the apoplast. In healthy plant cells the apoplast is generally maintained in an acidic state allowing amino acids, sugars and other nutrients to be imported from the apoplast to the cytoplasm by H+ symport1. During sucrose transport, sucrose moves from photosynthetic sources through the apoplast and into phloem vasculature; sucrose is then transported by an osmotic potential maintained by apoplastic invertases cleaving sucrose in the sink organs2. Sugars and other nutrients can also be transported upwards and accumulate in stomatal cavities through the transpiration stream3. The apoplast also represents an environmental niche where many pathogens establish their parasitic lifestyle. Bacterial plant pathogens have the ability to multiply to high densities in the apoplast, which they access through natural openings such as stomata or through wounds4. The concentration of amino acids and other nitrogen compounds in tomato apoplast have been shown to be sufficient to support the nutritional requirements of bacterial and fungal pathogens5,6. Primary defense responses towards microbial pathogens also occur in the apoplast, namely the production of reactive oxygen species by extracellular peroxidases and oxidases and the strengthening of the cell wall through cross- linking and callose deposition7. The plant cell wall is rich in secondary metabolites with anti-microbial activities; the biochemical nature of these secondary metabolites varies between species8. As a result of the above-mentioned and other processes, leaf apoplastic fluid contains a variety of proteins, sugars, organic acids, amino acids, secondary metabolites, metals and other cations (e.g., Mg2+, K+, Na+, Ca2+, Fe2/3+). Solute concentrations in the apoplast of shoots are controlled largely by the balance of transport processes occurring between the apoplast and the xylem, phloem and cytoplasm9. However, metabolic reactions and microbial growth also consume or produce apoplastic solutes. The composition of the apoplast is known to differ between plant species and genotypes and in response to changing environmental conditions including light, nutrition and biotic and abiotic stresses9. By studying the composition of the apoplast and how it changes, including properties such as redox and osmotic potential, pH, nutrient/metabolite availability and enzymatic activities, one can gain novel insights into how plants respond to their environment. Understanding or characterizing the molecular changes that occur in the apoplast solution is complicated because it is a spatially structured and dynamic compartment in which metabolites and/or ions may be volatile, transient or associated with the cell wall and plasma membrane. Furthermore, different analytical techniques are required to cover the range of different chemical types.To study the composition of the soluble apoplast, fluid usually needs to be extracted from the tissue. Several methods exist to extract apoplast fluid from various tissues, including a newly proposed filter strip method10, but the most established extraction method for leaves is infiltration- centrifugation. This technique has been evaluated previously11-13 and Lohaus et al. 200114 provide a thorough examination of many of the method’s technical parameters. As implied by the name, the infiltration-centrifugation technique is a two-step method that essentially involves replacement of the apoplastic air space with an aqueous infiltration fluid, which mixes with the native apoplastic fluid, followed by recovery of the infiltration/apoplastic fluid mixture by gentle centrifugation of the leaves. As the recovered fluid is diluted and does not contain all compounds present in the apoplast (see below), this fluid is commonly known as apoplast washing fluid (AWF), or sometimes intercellular washing fluid, rather than apoplastic fluid. The infiltration-centrifugation technique is easily scalable allowing single or pooled AWF samples of adequate volume to be generated and subjected to a wide range of downstream biochemical and analytical techniques (e.g., protein electrophoresis, enzyme activity measurement, NMR, many types of chromatography and mass spectrometry). Leaf AWF is also useful as an apoplast mimicking growth medium for studying the interaction of plant colonizing microbes with their environment 5. In the following protocols we describe how to perform the infiltration-centrifugation technique using Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen leaves, and provide some examples of downstream analyses with a focus on metabolomics. Importantly, methods to assess the quality of AWF are provided along with advice to optimize the pro

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

apoplast โรงงานเป็นพื้นที่ที่ล้อมรอบอยู่ระหว่างเซลล์พืช นี่คือสภาพแวดล้อมแบบไดนามิกซึ่งในจำนวนมากการเผาผลาญอาหารและการขนส่งกระบวนการใช้สถานที่ องค์ประกอบที่สำคัญของโครงสร้าง apoplast เป็นผนังเซลล์ซึ่งเป็นที่ประกอบและแก้ไขโดยเอนไซม์โปรตีนและสารที่อยู่ภายใน apoplast ในเซลล์พืชเพื่อสุขภาพ apoplast จะยังคงอยู่โดยทั่วไปอยู่ในสภาพที่เป็นกรดที่ช่วยให้กรดอะมิโนน้ำตาลและสารอาหารอื่น ๆ ที่จะนำเข้าจาก apoplast เพื่อพลาสซึมโดย H + symport1 ในระหว่างการขนส่งน้ำตาลซูโครสย้ายจากแหล่งสังเคราะห์แสงผ่าน apoplast และเข้าไปในเส้นเลือด phloem; ซูโครสจะถูกส่งแล้วโดยมีศักยภาพในการออสโมติกดูแลโดย invertases apoplastic ฝ่าน้ำตาลซูโครสใน organs2 อ่างล้างจาน น้ำตาลและสารอาหารอื่น ๆ นอกจากนี้ยังสามารถเคลื่อนย้ายขึ้นไปและสะสมในโพรงปากใบผ่าน stream3 คาย apoplast ยังแสดงให้เห็นถึงช่องด้านสิ่งแวดล้อมที่เชื้อโรคหลายสร้างวิถีการดำเนินชีวิตของพวกเขากาฝาก เชื้อสาเหตุโรคพืชแบคทีเรียมีความสามารถในการคูณความหนาแน่นสูงใน apoplast ซึ่งพวกเขาเข้าถึงผ่านช่องเปิดธรรมชาติเช่นปากใบหรือผ่าน wounds4 ความเข้มข้นของกรดอะมิโนและสารประกอบไนโตรเจนอื่น ๆ ในมะเขือเทศ apoplast ได้รับการแสดงให้เห็นว่าเพียงพอที่จะสนับสนุนความต้องการทางโภชนาการของ pathogens5,6 แบคทีเรียและเชื้อรา การตอบสนองต่อการป้องกันประถมเชื้อโรคจุลินทรีย์นอกจากนี้ยังเกิดขึ้นใน apoplast คือการผลิตออกซิเจนโดย peroxidases extracellular และ oxidases และสร้างความเข้มแข็งของผนังเซลล์ที่ผ่านการเชื่อมโยงข้ามและ callose deposition7 ที่ ผนังเซลล์พืชที่อุดมไปด้วยสารทุติยภูมิที่มีกิจกรรมต่อต้านจุลินทรีย์; ลักษณะทางชีวเคมีของสารทุติยภูมิเหล่านี้แตกต่างกันระหว่าง species8 ในฐานะที่เป็นผลมาจากกระบวนการดังกล่าวข้างต้นและอื่น ๆ ที่ใบของเหลว apoplastic มีความหลากหลายของโปรตีนน้ำตาลกรดอินทรีย์กรดอะมิโนสารทุติยภูมิ, โลหะและไพเพอร์อื่น ๆ (เช่น Mg2 +, K +, Na + Ca2 + Fe2 / 3 +) ความเข้มข้นของตัวละลายใน apoplast ของหน่อจะถูกควบคุมโดยส่วนใหญ่ความสมดุลของกระบวนการขนส่งที่เกิดขึ้นระหว่าง apoplast และท่อน้ำ, ใยเปลือกไม้และ cytoplasm9 อย่างไรก็ตามปฏิกิริยาการเผาผลาญอาหารและการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ยังใช้หรือผลิตสาร apoplastic องค์ประกอบของ apoplast เป็นที่รู้จักกันแตกต่างกันระหว่างพันธุ์พืชและพันธุ์และการตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงสภาพแวดล้อมรวมทั้งแสงโภชนาการและไบโอติกและ stresses9 abiotic โดยการศึกษาองค์ประกอบของ apoplast และวิธีการที่มันเปลี่ยนแปลงรวมทั้งคุณสมบัติเช่นอกซ์และศักยภาพในการออสโมติกกรดด่างสารอาหาร / ห้องว่าง metabolite และกิจกรรมของเอนไซม์หนึ่งสามารถรับข้อมูลเชิงลึกนวนิยายในวิธีการที่พืชตอบสนองต่อสภาพแวดล้อมของพวกเขา ความเข้าใจหรือลักษณะการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลที่เกิดขึ้นในการแก้ปัญหา apoplast มีความซับซ้อนเพราะมันเป็นช่องตำแหน่งที่มีโครงสร้างและแบบไดนามิกซึ่งสารและ / หรือไอออนอาจจะผันผวนชั่วคราวหรือเกี่ยวข้องกับผนังเซลล์และเยื่อหุ้มพลาสม่า นอกจากนี้เทคนิคการวิเคราะห์ที่แตกต่างกันจะต้องครอบคลุมช่วงของสารเคมีที่แตกต่างกัน types.To ศึกษาองค์ประกอบของ apoplast ที่ละลายน้ำได้ของเหลวมักจะต้องมีการสกัดจากเนื้อเยื่อ มีหลายวิธีที่จะดึง apoplast ของเหลวจากเนื้อเยื่อต่างๆรวมทั้งเสนอใหม่ method10 กรองแถบ แต่วิธีการสกัดที่ยอมรับมากที่สุดสำหรับใบคือการหมุนเหวี่ยง infiltration- เทคนิคนี้จะได้รับการประเมินและ previously11-13 Lohaus et al, 200114 ให้ตรวจสอบอย่างละเอียดของหลายพารามิเตอร์ทางเทคนิคของวิธีการ ในฐานะที่เป็นนัยโดยชื่อเทคนิคการแทรกซึม-หมุนเหวี่ยงเป็นวิธีที่สองขั้นตอนที่เป็นหลักที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนพื้นที่อากาศ apoplastic กับของเหลวแทรกซึมน้ำซึ่งผสมกับของเหลว apoplastic พื้นเมืองตามการฟื้นตัวของการแทรกซึม / สารผสมของเหลว apoplastic โดยการหมุนเหวี่ยงที่อ่อนโยนของใบ ในฐานะที่เป็นของเหลวที่กู้คืนเป็นเจือจางและไม่ได้มีสารทั้งหมดอยู่ใน apoplast (ดูด้านล่าง) ของเหลวนี้เป็นที่รู้จักกันทั่วไปว่าเป็น apoplast ซักผ้าของเหลว (AWF) หรือของเหลวซักผ้าบางครั้งระหว่างเซลล์มากกว่าของเหลว apoplastic เทคนิคการแทรกซึม-หมุนเหวี่ยงสามารถปรับได้อย่างง่ายดายช่วยให้เดียวหรือ pooled ตัวอย่าง AWF ของปริมาณเพียงพอที่จะสร้างขึ้นและภายใต้ความหลากหลายของเทคนิคทางชีวเคมีและการวิเคราะห์ปลายน้ำ (เช่น electrophoresis โปรตีนวัดกิจกรรมของเอนไซม์, NMR หลายประเภทโคและมวล spectrometry) ใบ AWF ยังมีประโยชน์เป็น apoplast ลอกเลียนแบบสื่อการเจริญเติบโตสำหรับการศึกษาปฏิสัมพันธ์ของพืชอาณานิคมจุลินทรีย์กับสภาพแวดล้อมของพวกเขา 5. ในโปรโตคอลต่อไปนี้เราจะอธิบายวิธีการดำเนินการเทคนิคการแทรกซึม-หมุนเหวี่ยงโดยใช้พันธุ์ถั่วแขก Tendergreen ใบและให้ตัวอย่างบางส่วนของการวิเคราะห์ปลายน้ำให้ความสำคัญกับ metabolomics ที่สำคัญวิธีการในการประเมินคุณภาพของ AWF มีให้พร้อมกับคำแนะนำเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพโปร

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โรงงานแอโพพลาสต์คือ intercellular พื้นที่ที่ล้อมรอบเซลล์พืช นี้เป็นสภาพแวดล้อมแบบไดนามิกที่กระบวนการเผาผลาญอาหารและการขนส่งหลายเอาสถานที่ ส่วนประกอบโครงสร้างหลักของ โพพลาสต์เป็นผนังเซลล์ซึ่งประกอบและดัดแปลงโดยเอนไซม์ , โครงสร้างโปรตีนและสารตั้งอยู่ภายในแอโพพลาสต์ . ในเซลล์พืชมีสุขภาพดีโดยทั่วไปการรักษาในกรดโพพลาสต์รัฐให้กรดอะมิโน น้ำตาลและสารอาหารอื่น ๆที่จะนำเข้าจากโพพลาสต์ใน cytoplasm โดย H + symport1 . ในระหว่างการขนส่งน้ำตาลทรายซูโครส ย้ายจากแหล่งแสงผ่านแอโพพลาสต์และโฟลเอ็ม vasculature ; ซูโครสถูกขนส่ง โดยมีศักยภาพการรักษาโดย apoplastic นเวอเทส cleaving ซูโครสในอ่าง organs2 . น้ำตาลและสารอาหารอื่น ๆยังสามารถเคลื่อนย้ายขึ้นและสะสมอยู่ในโพรงปากผ่านการคายน้ำ stream3 . การแอโพพลาสต์ยังหมายถึงสิ่งแวดล้อมที่เชื้อโรคสร้างโพรงหลายวิถีชีวิตปรสิตของพวกเขา เชื้อโรคพืชแบคทีเรียมีความสามารถคูณสูงความหนาแน่นในโพพลาสต์ ซึ่งพวกเขาเข้าถึงผ่านทางช่องเปิดธรรมชาติ เช่น ใบ หรือ ผ่าน wounds4 . ความเข้มข้นของกรดอะมิโนและสารประกอบไนโตรเจนอื่นๆโพพลาสต์มะเขือเทศได้รับการแสดงเพื่อให้เพียงพอที่จะรองรับความต้องการทางโภชนาการของเชื้อแบคทีเรียและเชื้อรา pathogens5,6 . หลักป้องกันการตอบสนองต่อจุลินทรีย์เชื้อโรคยังเกิดขึ้นในโพพลาสต์คือการผลิตของชนิดออกซิเจนปฏิกิริยาโดยเพอร์ กซิเดส และ oxidases ภายนอกและการสร้างความเข้มแข็งของผนังเซลล์ผ่านข้าม - เชื่อมต่อและแคลโล deposition7 . เซลล์พืชผนังที่อุดมไปด้วยสาร secondary metabolites ที่มีกิจกรรมต้านจุลชีพ ; ลักษณะทางชีวเคมีของสารทุติยภูมิเหล่านี้แตกต่างกันระหว่าง species8 . ผลของกระบวนการดังกล่าว และ อื่น ๆ , ใบ apoplastic ของเหลวที่มีความหลากหลายของโปรตีน น้ำตาล กรดอินทรีย์ กรดอะมิโน สาร secondary metabolites และโลหะชนิดอื่น ๆ ( เช่น mg2 + , K + , + แคลเซียม + fe2 / 3 + ) ความเข้มข้นของตัวถูกละลายในโพพลาสต์ของยอดถูกควบคุมส่วนใหญ่โดยความสมดุลของการขนส่งกระบวนการที่เกิดขึ้นระหว่างแอโพพลาสต์และไซเลมและโฟลเอ็ม , cytoplasm9 . อย่างไรก็ตาม ปฏิกิริยาการเผาผลาญอาหารและการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ยังบริโภคหรือผลิต apoplastic ตัวถูกละลาย . องค์ประกอบของ โพพลาสต์เป็นที่รู้จักกันจะแตกต่างกันระหว่างพืชชนิดและสายพันธุ์ และในการตอบสนองการเปลี่ยนแปลงสภาวะแวดล้อม รวมทั้งแสง โภชนาการ และการ stresses9 สิ่งมีชีวิต . จากการศึกษาองค์ประกอบของแอโพพลาสต์และวิธีการเปลี่ยนแปลง รวมทั้งคุณสมบัติเช่นการรีดอกซ์และศักยภาพการใช้ธาตุอาหาร อุณหภูมิ pH , กิจกรรมเอนไซม์ / และหนึ่งสามารถได้รับข้อมูลเชิงลึกใหม่เป็นวิธีการที่พืชตอบสนองต่อสภาพแวดล้อม ความเข้าใจหรือลักษณะโมเลกุลเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นในโพพลาสต์แก้ปัญหาซับซ้อน เพราะมันเป็นแบบโครงสร้างและแบบไดนามิกเปลี่ยนช่องในที่หลายชนิด และ / หรือ ไอออนอาจจะเปลี่ยนแปลงได้ ชั่วคราว หรือเกี่ยวข้องกับผนังเซลล์และพลาสมาเมมเบรน นอกจากนี้เทคนิคการวิเคราะห์ที่แตกต่างกันจะต้องครอบคลุมช่วงของชนิดของสารเคมีที่แตกต่างกัน เพื่อศึกษาองค์ประกอบของแอโพพลาสต์ละลายของเหลวมักจะต้องถูกแยกจากเนื้อเยื่อ หลายวิธีที่มีอยู่เพื่อสกัดแอโพพลาสต์ของเหลวจากเนื้อเยื่อต่าง ๆ รวมทั้งเสนอแถบ method10 กรองใหม่ แต่ส่วนใหญ่สร้างขึ้นวิธีสกัดใบคือการแทรกซึม - ปั่น . เทคนิคนี้ได้รับการประเมินและ previously11-13 lohaus et al . 200114 ให้ตรวจสอบอย่างละเอียดของหลายพารามิเตอร์ทางเทคนิคของวิธีการ เป็นโดยนัย โดยชื่อ การแทรกซึม ปั่นเป็นวิธีที่ 2 เทคนิคหลักที่เกี่ยวข้องกับการแทนที่ของอากาศ apoplastic ที่มีของเหลวซึมน้ำซึ่งผสมกับของเหลว apoplastic พื้นเมืองตามการฟื้นตัวของการแทรกซึม / apoplastic ของเหลวผสม โดยการปั่นเหวี่ยงที่อ่อนโยนของใบ เป็นกู้ของเหลวเจือจาง และไม่มีส่วนผสมของสารประกอบทั้งหมดที่มีอยู่ในโพพลาสต์ ( ดูด้านล่าง ) , ของเหลวนี้เป็นที่รู้จักกันโดยทั่วไปเป็นแอโพพลาสต์ซักผ้าของเหลว ( awf ) หรือบางครั้ง intercellular ซักผ้าของเหลวมากกว่า apoplastic ของไหล แทรกซึมได้อย่างยืดหยุ่นช่วยให้เทคนิคปั่นเดี่ยวหรือรวม awf ตัวอย่างปริมาณที่เพียงพอที่จะถูกสร้างขึ้น และ ภายใต้ความหลากหลายของเทคนิคทางชีวเคมีและวิเคราะห์ต่อเนื่อง ( เช่น โปรตีน เอนไซม์ การวัดเอ็นไซม์ NMR , หลายประเภทและโครมาโทกราฟีแมสสเปกโทรเมทรี ) awf ใบยังเป็นประโยชน์เป็นแอโพพลาสต์เลียนแบบอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อศึกษาปฏิสัมพันธ์ของพืช colonizing จุลินทรีย์กับสภาพแวดล้อมของพวกเขา 5 ในต่อไปนี้โปรโตคอลที่เราอธิบายวิธีการดำเนินการโดยใช้เทคนิคแทรกซึมปั่น phaseolus vulgaris cv . tendergreen ใบและให้ตัวอย่างบางส่วนของการวิเคราะห์ต่อเนื่อง โดยมุ่งเน้นเมตะโบโลมิก . ที่สำคัญ วิธีการประเมินคุณภาพของ awf จะมาพร้อมกับคำแนะนำในการเพิ่มประสิทธิภาพ Pro