TUNEL assaysA DeadEnd colorimetric

TUNEL assays
A DeadEnd colorimetric TUNEL assay kit (Promega, Madison,
WI, USA) was used to detect apoptotic cells in situ [17]. Briefly, the
tissue sections were deparaffinized and rehydrated by sequentially
immersing the slides through graded ethanol washes, fixed with 4%
paraformaldehyde in PBS, and washed with PBS. TUNEL-positive
cells with dark brown staining were observed and counted under
a light microscope.
Electron microscopy
In addition to the biochemical measurement of autophagy activity
with the LC3 assays, morphologic studies were performed
using electron microscopy. For autophagosome observation, an
electron microscope was used as previously described [10]. Mice on
postpartum Day 1 (PP1), postpartum Day 2 (PP2), and postpartum
Day 7 (PP7) were anesthetized with pentobarbital (50 mg/kg
intraperitoneal injection) and sacrificed. Tissue fixation with
continued perfusion with a modified pulsatile roller pump (10 mL/
minute; pulsation rate 90/minute) with a fixative (2% paraformaldehyde
and 1.25% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer,
pH 7.2) through the left heart ventricles was performed [18]. The
uteri were removed and postfixed in the same fixative for 2 hours.
The myometria were blocked into 1 mm3 cubes and fixed in a 1%
aqueous solution of OsO4for 1 hour. The specimens were washed
with double distilled H2O for 30 minutes three times and were
dehydrated in increasingly powerful graded ethanol from 50% to
100% and pure propylene oxide. The samples were embedded in
Epon at room temperature for 12 hours and polymerized in an oven
at 55
C for 1 day. Ultrathin sections of the samples (80 nm) were
then cut from the blocks and then contrasted with lead citrate and
uranyl acetate. The samples were examined with a Hitachi 7650
electron microscope (Hitachi, Tokyo, Japan).
Statistical analysis
The results are expressed as the mean ± standard deviation.
Statistically significant differences among the groups were evaluated
with the use of an analysis of variance (ANOVA) or a KruskalWallis
test. The Newman-Keuls test was used for post-ANOVA individual
comparison of the means. A value of p < 0.05 was
considered significant.
Fig. 1. Uterine growth and myometrial weight changes during pregnancy. (A) Gross
pictures of mouse uterine horns at various gestational and postpartum days.
Bar ¼ 1 cm. P0 indicates nonpregnancy; P2, P7, P14 and P21 indicate Day 1, Day 7, Day
14, and Day 21 of gestation respectively; PP1 and PP7 indicate postpartum at Day 1 and
Day 7 respectively. (B) Weight changes of a segment of the uterine horn (indicated
between red arrows in Fig. 1A) during pregnancy and postpartum. After carefully
removing the endometrium, mouse fetus as well as placenta under dissecting microscopy,
the remaining myometrium tissues were weighed. The myometrium weight
reached a peak at term, Day 21 of pregnancy, a statistically significant difference
compared with the other time points (***p < 0.01). Its weight returned to prepregnancy
levels on approximately PP7.
K.-F. Hsu et al. / Taiwanese Journal of Obstetrics & Gynecology 53 (2014) 293e302 295
Results
Uterine enlargement and myometrial weight increase as pregnancy
progresses
Pregnancy was associated with a dramatic increase in uterine
size (Fig. 1A), which was obviously reversed on postpartum Day 1.
We determined the myometrial weight of each specific segment of
the uterine horn (indicated by the red arrows in Fig.1A) at particular
time points. The weight at P2 was 18.0 ± 0.5 mg (mean ± standard
deviation). The weight was 36.3 ± 3.9 mg at P7, 79.6 ± 3.8 mg at P14,
105.7 ± 5.0 mg at P21, 65.9 ± 5.3 mg at PP1, and 13.7 ± 1.6 mg at PP7,
respectively (Fig. 1B). The weight of the segment had reached a peak
at term Day 21, with a statistically significant difference in weight
compared with the other time points (***p < 0.01). It returned to
pregestational status before PP7.
Progressive hypertrophy and increase in organelle proteins of the
uterine myocytes during pregnancy
We determined cellular hypertrophy morphologically with hematoxylin
and eosin staining of the cross-section of the uterine
horns at various gestational days. As seen in Fig. 2A, there is a progressive
increase in myocyte size as pregnancy progresses and a
decrease in the postpartum period. In addition, myocyte organelle
protein expression also progressively increased with pregnancy and
decreased in the postpartum period. As seen in Fig. 2B, the expression
of various organelle proteins, including b-actin (cytoskeleton),
prohibin (mitochondria), calnexin (endoplasmic reticulum), and
golgin-97 (Golgi apparatus) were determined by Western blotting,
and the expression of all these proteins increased as pregnancy
progressed but decreasedin the postpartum period. As the content of
calponin, a smooth muscle-specific protein associated with the thin
Fig. 2. Cellular hypertrophy and increased organelle protein expression of the

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

TUNEL assaysการ DeadEnd เคียง TUNEL assay kit (Promega เมดิสันWI สหรัฐอเมริกา) ถูกใช้เพื่อตรวจหาเซลล์ apoptotic ในแหล่งกำเนิด [17] สั้น ๆ การเนื้อเยื่อส่วน deparaffinized และ rehydrated ตามลำดับแช่ภาพนิ่งผ่านล้างจัดระดับเอทานอล คงที่ 4%paraformaldehyde ใน PBS และล้าง ด้วย PBS บวก TUNELสังเกต และนับว่าเซลล์ที่ มีการย้อมสีน้ำตาลเข้มกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงชาวดัตช์นอกจากการประเมินทางชีวเคมีของกิจกรรม autophagyดำเนินการกับ LC3 assays, morphologic ศึกษาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน สำหรับ autophagosome สังเกต การกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนถูกใช้ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [10] หนูบนหลังคลอด 1 วัน (PP1) หลังคลอดวันที่ 2 (PP2), และหลังคลอด7 วัน (PP7) ถูกด้วยกับ pentobarbital (50 มิลลิกรัม/กิโลกรัมฉีด intraperitoneal) และการเสียสละ ตรึงเนื้อเยื่อด้วยยังคงกำซาบ ด้วยปั๊มแบบลูกกลิ้ง pulsatile แก้ไข (10 mL /นาที อัตราการเต้น 90/นาที) กับตรึง (2% paraformaldehydeและ 1.25% glutaraldehyde ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.1 MpH ที่ 7.2) ผ่านหัวใจหัวใจซ้ายถูกดำเนินการ [18] การuteri ถูกลบออก และ postfixed ในตรึงเดียว 2 ชั่วโมงMyometria ที่ถูกบล็อกเป็นเดือน 3 1 ก้อน และคงที่ใน 1%ละลายของ OsO4for 1 ชั่วโมง ชิ้นงานทดสอบถูกล้างพร้อมเตียงใหญ่กลั่น H2O 30 นาทีสามครั้ง และถูกอบแห้งในเอทานอจัดระดับมีประสิทธิภาพมากขึ้นจาก 50% ไป100% และบริสุทธิ์นางรวิฐาพงศ์นุชิต ตัวอย่างที่ถูกฝังอยู่ในEpon ที่อุณหภูมิห้อง 12 ชั่วโมง และ polymerized ในเตาที่ 55C 1 วัน ส่วนบางเฉียบตัวอย่าง (80 nm) ได้แล้ว ตัดจากบล็อกแล้ว ต่างกับตะกั่วซิเตรต และอะซิเตท uranyl ตัวอย่างตรวจสอบได้กับ Hitachi 7650กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (ฮิตาชิ โตเกียว ญี่ปุ่น)การวิเคราะห์ทางสถิติผลลัพธ์จะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างกลุ่มที่ประเมินด้วยการใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) หรือ KruskalWallisการทดสอบ ใช้สำหรับบุคคลโพสต์ ANOVA ทดสอบ Keuls นิวแมนการเปรียบเทียบหมายถึง ค่าของ p < 0.05ถือว่าสำคัญรูปที่ 1 มดลูกเจริญเติบโตและ myometrial น้ำหนักเปลี่ยนแปลงในระหว่างตั้งครรภ์ (ก) รวมรูปภาพของเมาส์แตรมดลูกขณะตั้งครรภ์ และหลังคลอดวันต่าง ๆบาร์¼ 1 ซม.. P0 บ่งชี้ nonpregnancy P2, P7, P14 และ P21 ระบุ 1 วัน 7 วัน วัน14 และวันที่ 21 ของการตั้งครรภ์ตามลำดับ PP1 และ PP7 ระบุหลังคลอด 1 วัน และ7 วันตามลำดับ (ข) น้ำหนักการเปลี่ยนแปลงของส่วนของฮอร์นในมดลูก (ระบุระหว่างลูกศรสีแดงในรูป 1A) ใน ระหว่างตั้งครรภ์ และหลังคลอด หลังอย่างระมัดระวังเอาเยื่อบุโพรงมดลูก เมาส์ทารกในครรภ์ เป็นรกภายใต้กล้องจุลทรรศน์ พดี ๆเนื้อเยื่อ myometrium เหลือถูกชั่งน้ำหนัก น้ำหนัก myometriumถึงสูงสุดที่ระยะ วันที่ 21 ของการตั้งครรภ์ ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเทียบกับจุดเวลาอื่น ๆ (*** p < 0.01) น้ำหนักกลับมา prepregnancyระดับบนประมาณ PP7เคเอฟ Hsu ร้อยเอ็ด / ไต้หวันของสูตินรีเวช 53 293e302 (2014) 295ผลลัพธ์มดลูกขยายขนาดและน้ำหนัก myometrial เพิ่มเป็นการตั้งครรภ์คืบหน้าตั้งครรภ์ถูกเชื่อมโยงกับการเพิ่มขึ้นอย่างมากในมดลูกขนาด (รูปที่ 1A), ซึ่งเห็นได้ชัดกลับรายใน 1 วันหลังคลอดเรากำหนดน้ำหนัก myometrial ของแต่ละส่วนเฉพาะของฮอร์นมดลูก (แสดง ด้วยลูกศรสีแดงใน Fig.1A) ที่เฉพาะจุดเวลา น้ำหนักที่ P2 คือ 18.0 ± 0.5 mg (เฉลี่ย±มาตรฐานความเบี่ยงเบน) น้ำหนัก 36.3 ± 3.9 มิลลิกรัมที่ P7, 79.6 ± 3.8 มิลลิกรัมที่ P14 ถูก105.7 ± 5.0 มิลลิกรัมที่ P21, 65.9 ± 5.3 มิลลิกรัมที่ PP1 และ 13.7 ± 1.6 mg ที่ PP7ตามลำดับ (รูปที่ 1B) น้ำหนักของเซ็กเมนต์ได้ถึงสูงสุดที่ระยะ 21 วัน กับความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในน้ำหนักเมื่อเทียบกับจุดเวลาอื่น ๆ (*** p < 0.01) จะส่งกลับไปสถานะ pregestational ก่อน PP7Hypertrophy ก้าวหน้าและเพิ่มขึ้นในออร์แกเนลล์โปรตีนของตัวmyocytes มดลูกในระหว่างตั้งครรภ์เรากำหนดเซลล์ hypertrophy morphologically กับ hematoxylinและย้อม eosin ของขวางของตัวมดลูกแตรที่ต่าง ๆ ระหว่างวัน เท่าที่เห็นในรูป 2A มีความก้าวหน้าเพิ่มขนาด myocyte เป็นยะตั้งครรภ์ และการลดลงในช่วงหลังคลอด นอกจากนี้ myocyte ออร์แกเนลล์แสดงออกของโปรตีนยังความก้าวหน้าเพิ่มขึ้นกับการตั้งครรภ์ และลดลงในช่วงหลังคลอด เท่าที่เห็นในรูป 2B นิพจน์โปรตีนออร์แกเนลล์ต่าง ๆ รวมทั้งบีแอกติน (ประ),prohibin (mitochondria), calnexin (ลัม endoplasmic), และgolgin-97 (กอลจิคอมเพล็กซ์) ดำเนินการ โดย blotting วิธีตะวันตกและการแสดงออกของโปรตีนเหล่านี้เพิ่มขึ้นเป็นการตั้งครรภ์ความก้าวหน้าแต่ decreasedin ระยะเวลาหลังคลอด เป็นเนื้อหาของcalponin โปรตีนกล้ามเนื้อเรียบเฉพาะที่เกี่ยวข้องกับแบบบางรูป 2 Hypertrophy เซลล์และออร์แกเนลล์เพิ่มโปรตีนนิพจน์ของการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

TUNEL การตรวจ
หมดหนทางชุดสี TUNEL ทดสอบ (Promega, Madison,
WI, USA) ถูกใช้ในการตรวจหาเซลล์ที่เกิด apoptosis ในแหล่งกำเนิด [17] ในเวลาสั้น ๆ ที่
ส่วนเนื้อเยื่อ deparaffinized และคืนรูปโดยลำดับ
แช่ภาพนิ่งผ่านอย่างช้าล้างเอทานอลคงที่ 4%
paraformaldehyde ในพีบีเอสและล้างด้วยพีบีเอส TUNEL บวก
เซลล์ที่มีการย้อมสีน้ำตาลเข้มถูกตั้งข้อสังเกตและนับภายใต้
แสงกล้องจุลทรรศน์.
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน
นอกจากนี้ยังมีการตรวจวัดทางชีวเคมีของกิจกรรม autophagy
กับการตรวจ LC3 การศึกษารูปร่างได้ดำเนินการ
โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน สำหรับการสังเกต autophagosome เป็น
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนถูกนำมาใช้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [10] หนูใน
วันหลังคลอด 1 (PP1) วันหลังคลอด 2 (PP2) และหลังคลอด
วันที่ 7 (PP7) ได้รับการดมยาสลบกับ Pentobarbital (50 mg / kg
ฉีดเข้าช่องท้อง) และเสียสละ ตรึงเนื้อเยื่อที่มี
เลือดไปเลี้ยงอย่างต่อเนื่องกับปั๊มปรับเปลี่ยนการเต้นของชีพจรลูกกลิ้ง (10 มิลลิลิตร /
นาทีอัตราการเต้น 90 / นาที) พร้อมตรึง (2% paraformaldehyde
และ glutaraldehyde 1.25% ใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์,
ค่า pH 7.2) ผ่านโพรงหัวใจซ้ายที่ได้ดำเนินการ [18]
มดลูกถูกถอดออกและหลังค่าเงินในตรึงเดียวกันสำหรับ 2 ชั่วโมง.
myometria ถูกบล็อกเป็น 1 mm3 ก้อนและการแก้ไขใน 1%
สารละลายของ OsO4for 1 ชั่วโมง ตัวอย่างที่ถูกล้าง
ด้วย H2O กลั่นสองครั้งเป็นเวลา 30 นาทีสามครั้งและมี
การคายน้ำในเอทานอลที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นอย่างช้า ๆ จาก 50% ถึง
100% และโพรพิลีนออกไซด์บริสุทธิ์ กลุ่มตัวอย่างที่ถูกฝังอยู่ใน
เพ่ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 12 ชั่วโมงและ polymerized ในเตาอบ
ที่ 55
องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 วัน ส่วน Ultrathin ของกลุ่มตัวอย่าง (80 นาโนเมตร) ถูก
ตัดออกจากบล็อกและเทียบกับซิเตรตนำแล้ว
uranyl acetate กลุ่มตัวอย่างที่มีการตรวจสอบกับ บริษัท ฮิตาชิ 7650
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (ฮิตาชิกรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น).
การวิเคราะห์ทางสถิติ
ผลที่จะได้แสดงถึง±ค่าเฉลี่ยส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน.
ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างกลุ่มได้รับการประเมิน
ที่มีการใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนนั้น (ANOVA) หรือ KruskalWallis
ทดสอบ การทดสอบนิวแมน Keuls ถูกนำมาใช้สำหรับบุคคลที่โพสต์ ANOVA
เปรียบเทียบหมายถึง ค่า p <0.05
ถือว่ามีนัยสำคัญ.
รูป 1. การเจริญเติบโตในมดลูกและน้ำหนัก myometrial การเปลี่ยนแปลงในระหว่างตั้งครรภ์ (A) มวลรวม
ภาพของแตรเมาส์มดลูกที่วันขณะตั้งครรภ์และหลังคลอดต่างๆ.
Bar ¼ 1 ซม. P0 บ่งชี้ nonpregnancy; P2, P7, P14 และ P21 บ่งบอกถึงวันที่ 1 วัน 7 วัน
14 วันและ 21 ของการตั้งครรภ์ตามลำดับ PP1 และ PP7 บ่งบอกถึงหลังคลอดในวันที่ 1 และ
วันที่ 7 ตามลำดับ (ข) การเปลี่ยนแปลงน้ำหนักของส่วนของฮอร์นมดลูกที่ (แสดง
ระหว่างลูกศรสีแดงในรูป. 1A) ในระหว่างตั้งครรภ์และหลังคลอด อย่างระมัดระวังหลังจากที่
เอามดลูกทารกในครรภ์เมาส์เช่นเดียวกับรกภายใต้ผ่ากล้องจุลทรรศน์
ที่เหลือเนื้อเยื่อ myometrium ชั่ง น้ำหนัก myometrium
ถึงจุดสูงสุดในระยะเป็นวันที่ 21 ของการตั้งครรภ์, ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ
เมื่อเทียบกับจุดเวลาอื่น ๆ (*** p <0.01) น้ำหนักของมันกลับไป prepregnancy
ระดับบนพื้นที่ประมาณ PP7.
K.-F. Hsu, et al / ไต้หวันวารสารสูตินรีเวชกรรม 53 (2014) 293e302 295
ผล
การขยายตัวในมดลูกและเพิ่มน้ำหนัก myometrial การตั้งครรภ์
ดำเนินไป
การตั้งครรภ์มีความสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นอย่างมากในมดลูก
ขนาด (รูป. 1A) ซึ่งเป็นตรงกันข้ามอย่างเห็นได้ชัดในวันหลังคลอด 1.
เรากำหนด น้ำหนัก myometrial ของแต่ละส่วนงานที่เฉพาะเจาะจงของ
ฮอร์นมดลูก (แสดงโดยลูกศรสีแดงใน Fig.1A) โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่
จุดเวลา น้ำหนักที่ P2 เป็น 18.0 ± 0.5 mg (หมายถึง±มาตรฐาน
เบี่ยงเบน) รับน้ำหนักได้ 36.3 ± 3.9 มิลลิกรัมที่ P7, 79.6 ± 3.8 มิลลิกรัมที่ P14,
105.7 ± 5.0 มิลลิกรัมที่ P21, 65.9 ± 5.3 มิลลิกรัมที่ PP1 และ 13.7 ± 1.6 มิลลิกรัมที่ PP7,
ตามลำดับ (รูปที่ 1B.) น้ำหนักของกลุ่มได้ถึงจุดสูงสุด
ในวันที่ 21 คำที่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในน้ำหนัก
เมื่อเทียบกับจุดเวลาอื่น ๆ (*** p <0.01) มันกลับไป
pregestational สถานะก่อน PP7.
ยั่วยวนก้าวหน้าและการเพิ่มขึ้นของโปรตีน organelle ของ
myocytes มดลูกในระหว่างตั้งครรภ์
เรากำหนดยั่วยวนโทรศัพท์มือถือที่มีสัณฐาน hematoxylin
และ Eosin การย้อมสีของข้ามส่วนของมดลูก
แตรที่วันครรภ์ต่างๆ เท่าที่เห็นในรูป 2A มีความก้าวหน้า
เพิ่มขนาด myocyte การตั้งครรภ์ดำเนินไปและ
ลดลงในระยะหลังคลอด นอกจากนี้ myocyte organelle
การแสดงออกของโปรตีนที่เพิ่มขึ้นนอกจากนี้ยังมีความก้าวหน้ากับการตั้งครรภ์และ
ลดลงในระยะหลังคลอด เท่าที่เห็นในรูป 2B, การแสดงออก
ของโปรตีน organelle ต่าง ๆ รวมทั้ง B-โปรตีน (โครงร่าง)
prohibin (mitochondria) calnexin (ร่างแหเอนโดพลาซึม) และ
golgin-97 (กอลไจอุปกรณ์) ถูกกำหนดโดยซับตะวันตก
และการแสดงออกของโปรตีนทั้งหมดเหล่านี้เพิ่มขึ้น การตั้งครรภ์
ก้าวหน้า แต่ decreasedin ระยะหลังคลอด เป็นเนื้อหาของ
calponin เป็นโปรตีนของกล้ามเนื้อเฉพาะที่เกี่ยวข้องกับการเรียบบาง
มะเดื่อ 2. ยั่วยวนมือถือและเพิ่มการแสดงออกของโปรตีนของเนลล์