2.4. Minimum inhibitory concentrati

2.4. Minimum inhibitory concentration (MIC)

2.4 . การแสดงนิทรรศการ ( MIC )

For the selected endophytes, MICs of the EtOAc extracts against the ginseng pathogens were determined by the modified agar diffusion method (Vinale et al., 2006). Ginseng pathogen plugs (0.5 cm diameter) were placed in the middle of petri dishes with a 6 cm diameter containing 10 mL of PDA. Two layers of sterile Whatman filter paper discs with a 0.6 cm diameter containing EtOAc extracts of endophytic fungi (100 μg/10 μL) at concentrations of 0.1, 1, 10 or 100 μg/10 μL and 10 μL controls of acetone:water (9:1, v/v) were then placed on the top of each plug. The plates were subsequently incubated at 25 °C for 5–7 days, during which time the colony diameter was measured daily. All experiments were replicated twice with three biological replications.

เพื่อเลือก endophytes mics ของ etoac สารสกัดจากโสมเชื้อโรคถูกกำหนดโดยวิธี agar diffusion ดัดแปลง ( vinale et al . , 2006 ) โสมเชื้อโรคปลั๊ก ( 0.5 ซม. ) มีค่าอยู่ในช่วงกลางของจานเลี้ยงเชื้อที่มี 6 ซม. บรรจุ 10 ml ของ PDA แผ่นดิสก์กระดาษกรอง 2 ชั้น whatman เป็นหมันด้วย 0.6 ซม. etoac ที่มีสารสกัดจากราเอนโดไฟต์ ( 100 μ g / 10 μ L ) ที่ความเข้มข้น 0.1 , 1 , 10 หรือ 100 μกรัม / ลิตรและ 10 ลิตร 10 μμการควบคุมสำหรับน้ำ ( 9 : 1 v / v ) แล้ววางไว้บนด้านบนของแต่ละปลั๊ก จานต่อมาอุณหภูมิ 25 ° C ( 5 – 7 วันในช่วงอาณานิคม เส้นผ่าศูนย์กลางวัดทุกวันเวลาที่ ทั้งหมดจำนวน 3 ซ้ำการทดลอง 2 ครั้งกับทางชีวภ

2.5. Inhibition of spore germination

2.5 การยับยั้งการงอกของสปอร์

Four concentrations of EtOAc extracts of the selected endophytes (0.1, 1, and 10 μg/μL) were tested for inhibitory activity against spore germination by the four ginseng pathogens (A. panax, B. cinerea, C. panacicola, C. destructans). Briefly, spore suspensions (105 spores/mL) of the pathogens were obtained from 7-day-old cultures in sterile distilled water. Three 50 μL aliquots of the spore suspensions were then spread on media containing 4.5 mL of extracts plus 4.5 mL of MIN 3% agar in 6 cm diameter plates. The plates were subsequently incubated at 25 °C until spore germination in the control reached more than 80% (approximately 4–10 h). Next, lactophenol-cotton blue was added to the spore suspension to stop germination and 10 μL aliquots were placed on a hemocytometer to measure germination. The percentage of spore germination was then calculated based on approximately 100 spores counted in three replicates.

4 ความเข้มข้นของ สารสกัดจาก etoac เลือก endophytes ( 0.1 , 1 และ 10 กรัม / ลิตรμμ ) ทำการทดสอบการยับยั้งการงอกของสปอร์ โดยกิจกรรมต่อต้านเชื้อโรค ( Panax โสมขาว เอ บี ซี panacicola , C . destructans ) สั้น , สปอร์แขวนลอย ( 105 สปอร์ / มิลลิลิตร ) ของเชื้อโรคได้จาก 7-day-old วัฒนธรรมในการเป็นหมัน น้ำกลั่น 3 50 μผมเฉยๆของสปอร์แขวนลอย แล้วกระจายในสื่อที่มี 4.5 มิลลิลิตรของสารสกัดพลัส 4.5 ml ของมิน 3% ใน 6 ซม. ต่อแผ่น จานต่อมาอุณหภูมิ 25 ° C ) จนกระทั่งสปอร์งอกในการควบคุมถึงกว่า 80% ( ประมาณ 4 – 10 ชั่วโมง ) ต่อไป แลคโตฟีนอล ผ้าฝ้าย สีน้ำเงิน เพิ่มให้สปอร์ระงับหยุดการงอกและ 10 μผมเฉยๆ ถูกวางอยู่บน hemocytometer วัดการงอก เปอร์เซ็นต์การงอกของสปอร์แล้ว ผลจากการประมาณ 100 ปอร์นับสาม ได้แก

2.6. Field emission-scanning electron microscopy (FE-SEM)

2.6 ข้อมูลกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด ( fe-sem ) ปล่อย

The effects of the EtOAc extracts on the morphology of the pathogens were observed by FE-SEM. The same culture method used in the disk diffusion was employed to obtain specimens for FE-SEM. A small piece of membrane filter (Sigma) was then placed between the pathogen inoculum and Whatman filter paper containing the EtOAc extract, after which the plate was incubated for 2–3 days at 25 °C. Mycelia on the membrane filter were subsequently fixed with 1% osmium tetroxide for 24 h at 4 °C. After fixation, the samples were dehydrated in serially diluted ethanol (50%, 70%, 80%, 90%, 95% and twice at 100%) for 20 min at each concentration. The samples were then placed in iso-amylacetate for 30 min twice, after which they were dried in a critical point dryer with CO2. Next, the fixed samples were mounted on stubs and coated with gold/palladium using an ion-sputterer in a high-vacuum chamber. Finally, the samples were examined by FE-SEM/energy-dispersive spectroscopy (EDS) (S-4100, Hitachi Ltd., Kabushiki, Kaisha, Japan).

ผลของ etoac สารสกัดในลักษณะของเชื้อโรคที่พบโดย fe-sem . วัฒนธรรมเดียวกัน วิธีการที่ใช้ในการแพร่กระจายในดิสก์เพื่อให้ได้ตัวอย่าง fe-sem . ชิ้นเล็ก ๆของไส้กรองเมมเบรน ( Sigma ) ก็อยู่ระหว่างเชื้อโรคเชื้อและกระดาษกรอง whatman ที่มี etoac สกัดหลังจากที่จานบ่มเป็นเวลา 2 – 3 วันที่ 25 ° C . เส้นใยบนแผ่นกรอง จัดการแก้ไขด้วย 1% tetroxide ออสเมียม 24 H ที่อุณหภูมิ 4 องศา หลังการตรึง , ตัวอย่างที่ขาดน้ำเจือจางเป็นเอทานอล ( 50% , 70% , 80% , 90% , 95% และสองครั้งที่ 100% ) 20 นาทีในแต่ละความเข้มข้น ตัวอย่างถูกวางไว้แล้วใน amylacetate ISO สำหรับ 30 นาที 2 ครั้ง หลังจากนั้นพวกเขาก็แห้งในตู้อบแห้งวิกฤตกับ CO2 ต่อไปคงจำนวนติดตั้งบนบัตรและเคลือบด้วยทอง / แพลเลเดียมใช้ไอออน sputterer ในห้องสูญญากาศสูง ในที่สุด ตัวอย่างที่ตรวจสอบโดย fe-sem / พลัง

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 เข้มข้น inhibitory ต่ำสุด (MIC)2.4 การแสดงนิทรรศการ (ไมโครโฟน)สำหรับ endophytes เลือก ไมโครโฟนของ EtOAc แยกกับโสมที่เชื้อถูกกำหนด โดยวิธีการกระจายอาหารแก้ไข (Vinale et al. 2006) ปลั๊กเชื้อโสม (เส้นผ่าศูนย์กลาง 0.5 ซม.) ถูกวางไว้ตรงกลางจาน petri เส้นผ่าศูนย์กลาง 6 ซม.ประกอบด้วย 10 mL ของ PDA สองชั้นของแผ่นดิสก์กระดาษกรอง Whatman ฆ่าเชื้อเส้นผ่าศูนย์กลาง 0.6 ซม.ประกอบด้วย EtOAc สารสกัดจากเชื้อ endophytic (100 ไมโครกรัม/10 μL) ที่ควบคุม 10 μL โตน: น้ำ (9:1, v/v) และความเข้มข้นของ 0.1, 1, 10 หรือ 100 ไมโครกรัม/10 μL แล้ววางอยู่ด้านบนของแต่ละปลั๊ก แผ่นต่อมาได้รับการกกที่ 25 ° C 5 – 7 วัน ช่วงเวลาซึ่งเส้นผ่าศูนย์กลางโคโลถูกวัดทุกวัน การทดลองทั้งหมดถูกจำลองแบบสองครั้งกับระยะทางชีวภาพ 3เพื่อเลือก endophytes ไมโครโฟนนั้น ๆ etoac สารสกัดจากโสมเชื้อโรคถูกกำหนดโดยวิธีอาหารแพร่ดัดแปลง (vinale et al., 2006) โสมเชื้อโรคปลั๊ก (0.5 ซม.) มีค่าอยู่ในช่วงกลางของจานเลี้ยงเชื้อที่มี 6 ซม บรรจุ 10 มล.นั้น ๆ PDA แผ่นดิสก์กระดาษกรอง 2 ชั้น whatman เป็นหมันด้วย 0.6 ซม etoac ที่มีสารสกัดจากราเอนโดไฟต์ (100 μ g / 10 μ L) ที่ความเข้มข้น 0.1, 1, 10 หรือ 100 μกรัม / ลิตรและ 10 ลิตร 10 μμการควบคุมสำหรับน้ำ (9:1 v / v) แล้ววางไว้บนด้านบนของแต่ละปลั๊กจานต่อมาอุณหภูมิ 25 ° C (5 – 7 วันในช่วงอาณานิคมเส้นผ่าศูนย์กลางวัดทุกวันเวลาที่ทั้งหมดจำนวน 3 ซ้ำการทดลอง 2 ครั้งกับทางชีวภ2.5 การยับยั้งการงอกของสปอร์2.5 การยับยั้งการงอกของสปอร์4 ความเข้มข้นของสารสกัดจาก EtOAc ของ endophytes เลือก (0.1, 1 และ 10 ไมโครกรัม/μL) ได้ทดสอบสำหรับกิจกรรม inhibitory กับการงอกของสปอร์ โดยเชื้อสี่โสม (A. panax, B. cinerea, C. panacicola, C. destructans) สั้น ๆ สารแขวนลอยสปอร์ (105 รามล) ของเชื้อโรคได้รับจากวัฒนธรรมเก่า 7 วันในน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อ จากนั้นได้แพร่กระจาย aliquots สาม 50 μL ของสารแขวนลอยสปอร์บนสื่อที่ประกอบด้วย 4.5 mL สกัดบวกอาหาร 3% นาทีในแผ่นเส้นผ่าศูนย์กลาง 6 ซม. 4.5 mL แผ่นมีต่อมบ่มเลี้ยงที่ 25 ° C จนถึงการงอกของสปอร์ในการควบคุมถึงกว่า 80% (ประมาณ 4-10 ชั่วโมง) ถัดไป สีฟ้าผ้าฝ้าย lactophenol ถูกเพิ่มเพื่อระงับสปอร์หยุดการงอกและ 10 μL aliquots ถูกวางไว้บน hemocytometer วัดการงอก เปอร์เซ็นต์การงอกของสปอร์ถูกคำนวณตามประมาณ 100 รานับในสามเหมือนกัน4 ความเข้มข้นของสารสกัดจาก etoac endophytes คลุม (0.1, 1 และ 10 น. / ลิตรμμ) ทำการทดสอบการยับยั้งการงอกของสปอร์โดยกิจกรรมต่อต้านเชื้อโรค (Panax โสมขาวเอบีซี panacicola, C. destructans) สั้น สปอร์แขวนลอย (105 สปอร์ / มิลลิลิตร) ของเชื้อโรคได้จาก 7 วันเก่าวัฒนธรรมในการเป็นหมันน้ำกลั่น 3 50 μผมเฉยๆของสปอร์แขวนลอยแล้วกระจายในสื่อที่มี 4.5 มิลลิลิตรของสารสกัดพลัส 4.5 ml ของมิน 3% ใน 6 ซม จานต่อมาอุณหภูมิต่อแผ่น 25 ° C) จนกระทั่งสปอร์งอกในการควบคุมถึงกว่า 80% (ประมาณ 4-10 ชั่วโมง) ต่อไปแลคโตฟีนอลผ้าฝ้ายสีน้ำเงินเพิ่มให้สปอร์ระงับหยุดการงอกและ 10 μผมเฉย ๆ ถูกวางอยู่บน hemocytometer วัดการงอกเปอร์เซ็นต์การงอกของสปอร์แล้วผลจากการประมาณ 100 ปอร์นับสามได้แก2.6. การสแกนของฟิลด์ปล่อยอิเล็กตรอน (FE SEM)ปล่อย 2.6 ข้อมูลกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (fe sem)ข้อสังเกต โดย FE sem.ผลของสารสกัด EtOAc สัณฐานวิทยาของเชื้อโรค วิธีวัฒนธรรมเดียวกันที่ใช้ในแพร่ดิสก์ถูกจ้างเพื่อขอรับตัวอย่างสำหรับ FE sem ชิ้นเล็กที่กรองเมมเบรน (Sigma) วางระหว่าง inoculum ของเชื้อโรคและกระดาษกรอง Whatman ที่ประกอบด้วยสารสกัดจาก EtOAc หลังจากที่แผ่นรับได้รับการกก 2 – 3 วันที่ 25 องศาเซลเซียส ต่อมาถูกแก้ไข mycelia ตัวกรองเมมเบรนกับเทโตรไซด์ออสเมียม 1% สำหรับ 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจากเพ่ง ตัวอย่างจะถูกอบแห้งในเอทานอล serially เจือจาง (50%, 70%, 80%, 90%, 95% และครั้งที่สอง ที่ 100%) สำหรับ 20 นาทีที่ความเข้มข้นแต่ละ ตัวอย่างนั้นถูกวางไว้ใน iso-amylacetate 30 นาทีสองครั้ง หลังจากที่พวกเขาได้แห้งในจุดสำคัญเป่ากับ CO2 ถัดไป ตัวอย่างถาวรที่ติดค่าย และเคลือบ ด้วยเครื่องใช้ที่ไอออน sputterer ในห้องสุญญากาศสูงเดียมทอง ในที่สุด ตัวอย่างได้ถูก examined โดยมิก FE-SEM/พลังงาน-dispersive (EDS) (S-4100 ฮิตาชิ จำกัด Kabushiki, Kaisha ญี่ปุ่น)ผลของ etoac สารสกัดในลักษณะของเชื้อโรคที่พบโดย fe-sem . วัฒนธรรมเดียวกัน วิธีการที่ใช้ในการแพร่กระจายในดิสก์เพื่อให้ได้ตัวอย่าง fe-sem . ชิ้นเล็ก ๆของไส้กรองเมมเบรน ( Sigma ) ก็อยู่ระหว่างเชื้อโรคเชื้อและกระดาษกรอง whatman ที่มี etoac สกัดหลังจากที่จานบ่มเป็นเวลา 2 – 3 วันที่ 25 ° C . เส้นใยบนแผ่นกรอง จัดการแก้ไขด้วย 1% tetroxide ออสเมียม 24 H ที่อุณหภูมิ 4 องศา หลังการตรึง , ตัวอย่างที่ขาดน้ำเจือจางเป็นเอทานอล ( 50% , 70% , 80% , 90% , 95% และสองครั้งที่ 100% ) 20 นาทีในแต่ละความเข้มข้น ตัวอย่างถูกวางไว้แล้วใน amylacetate ISO สำหรับ 30 นาที 2 ครั้ง หลังจากนั้นพวกเขาก็แห้งในตู้อบแห้งวิกฤตกับ CO2 ต่อไปคงจำนวนติดตั้งบนบัตรและเคลือบด้วยทอง / แพลเลเดียมใช้ไอออน sputterer ในห้องสูญญากาศสูง ในที่สุด ตัวอย่างที่ตรวจสอบโดย fe-sem / พลัง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การแสดงนิทรรศการ ( MIC )2.4 . การแสดงนิทรรศการ ( MIC )เพื่อเลือก endophytes mics ของ etoac สารสกัดจากโสมเชื้อโรคถูกกำหนดโดยวิธี agar diffusion ดัดแปลง ( vinale et al . , 2006 ) โสมเชื้อโรคปลั๊ก ( 0.5 ซม. ) มีค่าอยู่ในช่วงกลางของจานเลี้ยงเชื้อที่มี 6 ซม. บรรจุ 10 ml ของ PDA แผ่นดิสก์กระดาษกรอง 2 ชั้น whatman เป็นหมันด้วย 0.6 ซม. etoac ที่มีสารสกัดจากราเอนโดไฟต์ ( 100 μ g / 10 μ L ) ที่ความเข้มข้น 0.1 , 1 , 10 หรือ 100 μกรัม / ลิตรและ 10 ลิตร 10 μμการควบคุมสำหรับน้ำ ( 9 : 1 v / v ) แล้ววางไว้บนด้านบนของแต่ละปลั๊ก จานต่อมาอุณหภูมิ 25 ° C ( 5 – 7 วันในช่วงอาณานิคม เส้นผ่าศูนย์กลางวัดทุกวันเวลาที่ ทั้งหมดจำนวน 3 ซ้ำการทดลอง 2 ครั้งกับทางชีวภาพเพื่อเลือก endophytes ไมค์ของ etoac สารสกัดจากโสมเชื้อโรคถูกกำหนดโดยวิธีวุ้นกระจายดัดแปลง ( vinale et al . 2006 ) โสมเชื้อโรคปลั๊ก ( 0.5 ซม ) มีค่าอยู่ในช่วงกลางของจานเลี้ยงเชื้อที่มี 6 ซม . บรรจุ 10 PDA ของ ml แผ่นดิสก์กระดาษกรอง 2 ชั้น whatman เป็นหมันด้วย 0.6 ซม . etoac ที่มีสารสกัดจากราเอนโดไฟต์ ( 100 μ g / 10 μ L ) ที่ความเข้มข้น 0.1 , 1 , 10 / 100 μกรัมค็อคลิตรและ 10 ลิตร 10 μμการควบคุมสำหรับน้ำ ( 9 : 1 v / v ) แล้ววางไว้บนด้านบนของแต่ละปลั๊กจานต่อมาอุณหภูมิ 25 ° C ( 5 – 7 วันในช่วงอาณานิคมเส้นผ่าศูนย์กลางวัดทุกวันเวลาที่ทั้งหมดจำนวน 3 ซ้ำการทดลอง 2 ครั้งกับทางชีวภ2.5 การยับยั้งการงอกของสปอร์2.5 การยับยั้งการงอกของสปอร์4 ความเข้มข้นของ สารสกัดจาก etoac เลือก endophytes ( 0.1 , 1 และ 10 กรัม / ลิตรμμ ) ทำการทดสอบการยับยั้งการงอกของสปอร์ โดยกิจกรรมต่อต้านเชื้อโรค ( Panax โสมขาว เอ บี ซี panacicola , C . destructans ) สั้น , สปอร์แขวนลอย ( 105 สปอร์ / มิลลิลิตร ) ของเชื้อโรคได้จาก 7-day-old วัฒนธรรมในการเป็นหมัน น้ำกลั่น 3 50 μผมเฉยๆของสปอร์แขวนลอย แล้วกระจายในสื่อที่มี 4.5 มิลลิลิตรของสารสกัดพลัส 4.5 ml ของมิน 3% ใน 6 ซม. ต่อแผ่น จานต่อมาอุณหภูมิ 25 ° C ) จนกระทั่งสปอร์งอกในการควบคุมถึงกว่า 80% ( ประมาณ 4 – 10 ชั่วโมง ) ต่อไป แลคโตฟีนอล ผ้าฝ้าย สีน้ำเงิน เพิ่มให้สปอร์ระงับหยุดการงอกและ 10 μผมเฉยๆ ถูกวางอยู่บน hemocytometer วัดการงอก เปอร์เซ็นต์การงอกของสปอร์แล้ว ผลจากการประมาณ 100 ปอร์นับสาม ได้แก่4 ความเข้มข้นของสารสกัดจาก etoac เลือก endophytes ( 0.1 , 1 และ 10 กรัม / ลิตรμμ ) ทำการทดสอบการยับยั้งการงอกของสปอร์โดยกิจกรรมต่อต้านเชื้อโรค ( Panax โสมขาวเอบีซี panacicola , C . destructans สั้นสปอร์แขวนลอย ( 105 ) , สปอร์ / มิลลิลิตร ) ของเชื้อโรคได้จาก 7-day-old วัฒนธรรมในการเป็นหมันน้ำกลั่น 3 50 μผมเฉยๆของสปอร์แขวนลอยแล้วกระจายในสื่อที่มี 4.5 มิลลิลิตรของสารสกัดพลัส 4.5 ml ของมิน 3% the 6 ซม . ต่อแผ่นจานต่อมาอุณหภูมิ 25 ° C ) จนกระทั่งสปอร์งอกในการควบคุมถึงกว่า 80% ( ประมาณ 4 – 10 ชั่วโมง ) ต่อไปแลคโตฟีนอลผ้าฝ้ายสีน้ำเงินเพิ่มให้สปอร์ระงับหยุดการงอกและ 10 μผมเฉยๆถูกวางอยู่บน hemocytometer วัดการงอกเปอร์เซ็นต์การงอกของสปอร์แล้วผลจากการประมาณ 100 ปอร์นับสามได้แก2.6 ข้อมูลกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด ( fe-sem ) ปล่อย