Isolation and Phylogenetic Analysis

Isolation and Phylogenetic Analysis of Two Thermotolerant, Fermentative Yeast Strains from Liquid Tapé Ketan (Indonesian Rice Wine)
Win aung, Yuka WaTanabe* and Fumio HasHinaga
Department of Biochemical Science & Technology, Faculty of Agriculture, Kagoshima University, 1-21-24 Korimoto, Kagoshima 890-0065, Japan
Received June 20, 2011; Accepted November 29, 2011
A total of 34 yeast strains were isolated from rice wines pressed from tapé ketan, Indonesian tradition- al fermented-glutinous rice. Among them, two strains that grew and fermented above 42°C were selected for further analysis. Fermentation was carried out in medium containing 15% (w/v) glucose at 40°C, and ethanol productivity was measured after 48 h of incubation. The two strains, TB2-1 and TW1-3, were found to have upper temperature limit of 46 and 47°C, and higher ethanol productivity of 5.9% and 6.4% (w/v), respectively. These two yeast strains were identified by traditional and molecular techniques. In the molecular technique, 18S rDNA and internal transcribed spacer 1 (ITS1) rDNA genes were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers. The sequences of these two regions for the two strains were phylogenetically analyzed, and the yeast strains TB2-1 and TW1-3 were identified as Issatch- enkia orientalis and Saccharomyces cerevisiae, respectively.
Keywords: rice wine, thermotolerant and fermentative yeasts, 18S rDNA, ITS1 rDNA
*To whom correspondence should be addressed. E-mail: [e-mail]
Introduction The production of ethanol by yeast fermentation in tropical countries, especially during the summer season, is not economically feasible because of the high energy input required to cool the fermenters. Thermotolerant yeasts of- fer potential advantages in the alcohol industry by reducing cooling costs and by having faster fermentation rates, there- by making the process more economical (Kiransree et al., 2000; Pasha et al., 2007). There have been a limited number of attempts to obtain yeasts from non-food sources that are capable of growth and fermentation at or above 40℃, with some researchers genetically modifying fermentative yeasts to be thermotolerant (Hong et al., 2007; Kawamura, 1999). Apart from these approaches, screening of yeasts from vari- ous environments, including soil in hot regions (Kiran Sree et al., 2000), appears to be the major way of identifying suit- able strains for commercial production and reducing the cost of the process. To the best of our knowledge, there has been no report on the characteristics of thermotolerant, fermenta- tive yeasts from rice wines. In this study, we used Indonesian
rice wines pressed from tapé ketan to identify thermotoler- ant, fermentative yeasts. Tapé ketan is a traditional Indonesian fermented food prepared from glutinous rice, which has been steamed, in- oculated, and allowed to ferment for 24 to 48 h or longer at ambient temperatures (25 to 30℃) (Cronk et al., 1979). The alcohol content of tapé ketan inoculated with different starter cultures ranges from 2.6 to 3.7% (v/v) after fermentation for 48 h and 4.2 to 7.4% (v/v) after 96 h (Law et al., 2011). In tapé ketan fermentation, reducing sugars increase from less than 1% to approximately 5% in 24 h and reach a maximum concentration, 16 to 17%, between 36 and 48 h (Cronk et al., 1977). Rice wines like the liquid portions of tapé ketan are pop- ular alcoho130lic beverage in Asian countries (Dung et al., 2006; Jeyaram et al., 2008). Most countries that make rice wines are situated in tropical and subtropical regions; there- fore, we expected that thermotolerant, fermentative yeasts may exist in the fermented foods.
Materials and Methods (1)Sample collection Rice wines, the liquid portions of the tapé ketan used in this study, were white, red and green.
tion above 42℃ were selected and used to prepare seed cul- tures. Each strain was inoculated into a test tube containing 10 mL of YPD liquid medium and cultured at 37℃ for 8 to 10 h by reciprocal shaking at 120 rpm. A 200-µL volume of the culture was re-inoculated into a 300-mL shaking flask containing 100 mL YPD medium and cultured at 37℃ to the early stationary phase. The culture was then centrifuged at 3000 × g for 5 min at 4℃, washed twice and resuspended in sterile tap water containing 0.1% glucose. A 100-mL volume of Tyndalized (Vaughan-Martini and Martini, 1998) YPD screening medium containing 15% glucose was dispensed into a 300-mL Erlenmeyer flask and inoculated with 5 g of wet seed culture. The fermentation flasks were fitted with stoppers to vent CO2 through a water trap and incubated in a Bio Shaker BR-15LF incubator at 40℃ with shaking (130 rpm). A 10-mL sample was withdrawn from each flask after 48 h and centrifuged at 6000 × g for 10 min at 4℃ to remove cells. The supernatants were used for ethanol determination as described by Suresh et al. (1999). (5) Identification of yeasts by conventional technique Conventional identification of yeast was carried out accord- ing to the criteria described by Kurtzman and Fell (1998) based on morphological and physiological characteristics. Furthermore, additional tests for starch formation, urea hy- drolysis and Diazomium Blue B (DBB) color reaction tests were also carried out as described by Yarrow (1998). The Kurtzman and Fell (1998) and Barnett et al. (2000) keys for yeast identification were used. (6) Identification of yeasts by molecular techniques a) DNA isolation, amplification and sequencing All the selected yeast strains were grown in 5 mL YPD liquid media at 30℃ for 24 h in a shaker incubator (150 rpm). DNA isola- tion was performed using the method described by Makimura et al. (1994). Polymerase chain reaction (PCR) amplification of the 18S rDNA region was carried out in 50-µL reaction mixtures containing 50 ng DNA, 0.5 µM of each primer (NS1, 5'-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TC-3', Schabereiter- Gurtner et al., 2001; and FR1, 5'-AIC CAT TCA ATC GGT AIT-3', where I represents inosine, Cook et al., 2008; Pasha et al., 2007), 5 µL of 10 × buffer, 4 µL of dNTP mixture (each dNTP at 2.5 mM) and 1.25 U TaKaRa Taq DNA polymerase (Takara, Shiga, Japan). PCR amplification was performed in a GeneAmp® PCR system 7900 thermocycler (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The thermal cycling profile was an initial denaturation at 95℃ for 8 min, fol- lowed by 35 cycles of 95℃ for 30 s, 47℃ for 45 s and 72℃ for 3 min, and a single final extension step at 72℃ for 10 min. Amplification of the ITS1 rDNA region was carried out as described above in 50-µL reaction mixtures but using
The process of making tapé ketan has been described previ- ously (Steinkraus, 1996). All samples were collected from Solo, in Central Java (Indonesia). (2)Isolation of yeasts Bottles containing 500 mL of sample were shaken well, and a 0.5-mL aliquot of each sample was inoculated into 5 mL of autoclaved yeast extract- malt extract broth (YM broth) containing 0.3% yeast extract (Difco, Detroit, MI, USA), 0.3% malt extract (Difco) and 0.5% polypeptone (Wako Pure Chemical Co. Ltd., Japan). To these YM broths, 2, 25 or 50% glucose were added and labeled YM2, YM25 or YM50, respectively. The pH was ad- justed to 3.7 and 4.5 for YM2 and YM25 media, respectively, using 1 M HCl. The pH of YM50 was 5.9. Inoculated broth cultures were incubated in a shaker incubator (200 rpm) at 30℃ for 7 days. All YM agar media (2, 1.5 and 1.2% agar added to YM2, YM25 and YM50 media, respectively) were streak inoculated from the suspension cultures as described by Kurtzman et al. (2001). Streaked plates were incubated at 25℃ for 7 days. Colonies were plated again onto the cor- responding agar media, and pure cultures were maintained on yeast extract-peptone-glucose (YPD) agar slants contain- ing 0.5% yeast extract, 1% polypeptone, 2% glucose and 2% agar at 4℃. (3) Screening of thermotolerant, fermentative yeasts a) Fermentation activity test at 40℃ YPD screening medium containing 1% yeast extract, 2% polypeptone and 2% glucose was used. Each of the isolated strains was grown on YM agar (24 − 48 h at 25℃) and then inoculated into 5 mL of YPD screening medium in a test tube containing a Durham tube and incubated at 40℃ for 5 days. The yeast fermentation activity was scored by the accumulation of gas in the Durham tubes. Strains fermenting glucose and produc- ing gas in the Durham tubes within 24 h were selected for further tests. b) Upper temperature limit test Selected strains were tested to determine the upper temperature limit for fermen- tation. A fresh culture grown at 37℃ was inoculated into 5 mL of YPD screening medium in a test tube containing a Durham tube. The test tubes were incubated in three Bio Shaker BR-15LF incubators (Taitec Co. Ltd., Tokyo, Japan) with gentle shaking twice a day. The incubators were kept at a constant temperature, and each was increased in intervals of 1℃ per day. The accumulation of gas in the Durham tube was observed daily. The upper temperature limit for fer- mentation was considered to be located between the lowest temperature at which no fermentation occurred after 5 days and the next lowest temperature at which fermentation had occurred as described by Walt and Yarrow (1984). (4) Ethanol production by thermotolerant, fermentative yeasts Strains with upper temperature limits for fermenta- W. aung et al.144
Results Isolation of yeasts We were able to isolate pure yeast strains even though the rice wines had been prepared using indigenous alcohol starters that are known to contain mixed cultures of microorganisms (Aung et al., 2004). Thirty-four yeast strains isolated from three types of traditional rice wines are shown in Table 1. Screening and upper temperature limit of thermotoler- ant, fermentative yeasts The six strains, TW1-2, TW1-3, TW3-3, TW3-4, TB2-1 and TG2-1, showed strong fermenta- tion and produced gas at 44℃ within 2 days of incubation. However, acco

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แยกและ Phylogenetic วิเคราะห์ของสอง Thermotolerant, Fermentative ยีสต์จากของเหลว Tapé Ketan (อินโดนีเซียข้าวไวน์)
ชนะอองซาน ยูกะมาเบะ * และ Fumio HasHinaga
กรมวิทยาศาสตร์ชีวเคมี&เทคโนโลยี คณะเกษตร มหาวิทยาลัยคาโงชิมะ 1-21-24 Korimoto คาโงชิมะ 890-0065 ญี่ปุ่น
รับ 20 มิถุนายน 2554 รับ 29 พฤศจิกายน 2011
จำนวน 34 ยีสต์ที่แยกจากไวน์ข้าวกดจาก tapé ketan อินโดนีเซียประเพณีอัลหมักข้าวเหนียว ในหมู่พวกเขา สายพันธุ์ที่สองที่เพิ่มขึ้น และหมักสูงกว่า 42° C ถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม หมักทำออกในกลูโคส 15% (w/v) ที่มีขนาดกลางที่ 40° C และมีวัดผลผลิตเอทานอลหลัง 48 h ของคณะทันตแพทยศาสตร์ สายพันธุ์สอง TW1-3 และ TB2-1 พบว่ามีจำนวน 46 และ 47 ° C อุณหภูมิสูงสุด และเอทานอลผลผลิตที่สูงขึ้น 5.9% และ 6.4% (w/v), ตามลำดับ ยีสต์เหล่านี้สองที่ระบุ โดยเทคนิคดั้งเดิม และโมเลกุล ในเทคนิคโมเลกุล 18S rDNA และเป็นตัวเว้นวรรคใช้ทับภายใน 1 (ITS1) ยีน rDNA ถูกขยาย โดยพอลิเมอเรสปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) ใช้เฉพาะไพรเมอร์ Phylogenetically ได้วิเคราะห์ลำดับของสองภูมิภาคนี้สำหรับสายพันธุ์สอง และยีสต์ TB2-1 และ TW1 3 ระบุ Issatch enkia orientalis และ Saccharomyces cerevisiae ตามลำดับ.
คำสำคัญ: ข้าวไวน์ thermotolerant และ fermentative yeasts, 18S rDNA, ITS1 rDNA
* ควรได้รับการติดต่อ อีเมล์: [e-mail]
แนะนำการผลิตเอทานอล โดยยีสต์หมักในประเทศร้อน โดยเฉพาะอย่างยิ่งในฤดูร้อน ไม่เป็นไปได้ทางเศรษฐกิจเนื่องจากการป้อนพลังงานสูงต้องเย็นที่ fermenters Thermotolerant yeasts ของ fer เป็นประโยชน์ในอุตสาหกรรมเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ โดยการลดต้นทุนการทำความเย็น และการหมักเร็วราคาพิเศษ มี- โดยทำการประหยัดมากขึ้น (Kiransree et al., 2000 พาชา et al., 2007) ได้มีความพยายามรับ yeasts จากแหล่งที่ไม่ใช่อาหารที่มีความสามารถในการเจริญเติบโตและหมักที่ หรือเหนือ กว่า 40℃ มีนักวิจัยบางแปลงพันธุกรรมแก้ไข fermentative yeasts เป็น thermotolerant (Hong et al., 2007 Kawamura, 1999) นอกจากวิธีเหล่านี้ คัดกรองของ yeasts จากสภาพแวดล้อม vari ous ดินรวมในภูมิภาคร้อน (รานสรี et al., 2000), แล้วเป็น วิธีสำคัญระบุชุด - สามารถสายพันธุ์สำหรับการผลิตเชิงพาณิชย์ และลดต้นทุนของกระบวนการ กับความรู้ของเรา มีแล้วไม่รายงานในลักษณะของ thermotolerant, fermenta-tive yeasts จากไวน์ข้าว ในการศึกษานี้ เราใช้อินโดนีเซีย
ข้าวไวน์กดจาก tapé ketan thermotoler-มด fermentative yeasts ระบุ Tapé ketan เป็นอินโดนีเซียร้าอาหารซึ่งทำจากข้าวเหนียว ซึ่งมีการนึ่ง ใน oculated และอนุญาตให้หมัก ใน 24 ถึง 48 h หรืออีกที่อุณหภูมิแวดล้อม (25 เพื่อ 30℃) (Cronk et al., 1979) เนื้อหาแอลกอฮอล์ของ tapé ketan inoculated กับช่วงวัฒนธรรมเริ่มต้นแตกต่างจาก 2.6 3.7% (v/v) หลังจากหมักสำหรับ 48 h และ 4.2-7.4% (v/v) หลังจาก h 96 (กฎหมาย et al., 2011) ใน tapé ketan หมัก ลดน้ำตาลเพิ่มขึ้นจากน้อยกว่า 1% ประมาณ 5% ใน 24 ชมและการเข้าถึงความเข้มข้นสูงสุด 16-17% ระหว่าง 36 และ 48 h (Cronk et al., 1977) ไวน์ข้าวเช่นส่วนของเหลวของ tapé ketan เป็นเครื่องดื่ม alcoho130lic ular ป๊อปในประเทศเอเชีย (ดังและ al., 2006 Jeyaram et al., 2008) ประเทศส่วนใหญ่ที่ทำให้ไวน์ข้าวตั้งอยู่ในภูมิภาค ร้อน มีลำเลียงสา คิดว่า thermotolerant, fermentative yeasts อาจอยู่ในร้าอาหาร
วัสดุและวิธีการ (1) ตัวอย่างชุดข้าวไวน์ ส่วนของเหลวของ ketan tapé ที่ใช้ในการศึกษานี้ มีสีขาว สีแดงและสีเขียว
เลือก และใช้ในการเตรียมเมล็ด cul-tures สเตรชันเหนือ 42℃ ต้องใช้แต่ละ inoculated ลงในหลอดทดสอบประกอบด้วย 10 มล.ของเหลวตัวกลาง YPD และอ่างที่ 37℃ สำหรับ h 8 ถึง 10 โดยการสั่นที่ 120 รอบต่อนาทีซึ่งกันและกัน ปริมาตร 200 µL ของวัฒนธรรมใหม่ inoculated เป็นแบบ 300-มลสั่นหนาวประกอบด้วยกลาง 100 มล YPD และอ่างที่ 37℃ เครื่องเขียนระยะแรก ๆ ได้ วัฒนธรรมมี centrifuged แล้วที่ 3000 × g ใน 5 นาทีที่ 4 ℃ ล้างสองครั้ง และ resuspended ในน้ำประปาผ่านการฆ่าเชื้อที่ประกอบด้วยน้ำตาลกลูโคส 0.1% ปริมาตร 100 mL ของ Tyndalized (วอนมาร์ตินี่และมาร์ตินี่ สื่อคัดกรอง YPD 1998) ประกอบด้วยกลูโคส 15% คำเป็นแบบ 300 mL Erlenmeyer หนาว และ inoculated กับ 5 g ของเมล็ดเปียก น้ำหมักได้อาบจุกเพื่อระบาย CO2 ผ่านกับดักน้ำ และ incubated ในการบ่มเพาะวิสาหกิจเชคเกอร์ไบ BR-15LF ที่ 40℃ กับสั่น (130 รอบต่อนาที) ตัวอย่าง 10 mL ถูกถอนจากหนาวแต่ละหลัง 48 h และ centrifuged ที่ 6000 × g ใน 10 นาทีที่ 4 ℃เอาเซลล์ Supernatants ถูกใช้สำหรับการกำหนดเอทานอลตามที่อธิบายไว้โดย Suresh et al. (1999) (5) ระบุ yeasts โดยรหัสทั่วไปเทคนิคทั่วไปของยีสต์ที่ทำกำลังสอดคล้องกับเงื่อนไขที่อธิบายไว้ โดย Kurtzman และตก (1998) ตามสัณฐาน และสรีรวิทยาลักษณะ นอกจากนี้ ทดสอบเพิ่มเติมสำหรับผู้แต่งแป้ง ยูเรียฮี drolysis และทดสอบปฏิกิริยาสี B สีน้ำเงินของ Diazomium (DBB) ก็ยังดำเนินการตามที่อธิบายไว้ โดย Yarrow (1998) Kurtzman และตก (1998) และใช้คีย์บาร์เนต et al. (2000) สำหรับรหัสยีสต์ (6) ระบุ yeasts โดยเทคนิคโมเลกุลเป็น) การแยกดีเอ็นเอ ขยายและลำดับเบสทั้งหมดที่เลือกยีสต์ได้ปลูกใน 5 mL YPD สื่อของเหลวที่ 30℃ ใน 24 ชมในการบ่มเพาะวิสาหกิจเชคเกอร์ (150 รอบต่อนาที) ดีเอ็นเออิโซล่าสเตรชันที่ดำเนินการโดยใช้วิธีอธิบายโดย Makimura et al. (1994) พอลิเมอเรสปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) ขยายของภูมิภาค 18S rDNA ถูกดำเนินในน้ำยาผสมปฏิกิริยา 50 µL ประกอบด้วย 50 ng DNA, 0.5 µM (NS1 แต่ละพื้น 5'CCA GTA GTC ATA TGC TTG TC-3', Schabereiter - Gurtner et al., 2001 และ FR1, 5'-AIC CAT TCA ATC GGT เอง-3', ที่ฉันแสดง inosine, Cook et al., 2008 พาชา et al., 2007), 5 µL บัฟเฟอร์× 10, 4 µL ผสม dNTP (ละ dNTP ที่ 2.5 mM) และ 1.25 U TaKaRa Taq DNA พอลิเมอเรส (Takara ชิงะ ญี่ปุ่น) ทำ PCR ขยายใน GeneAmp ® PCR ระบบ 7900 thermocycler (Biosystems ใช้ PE ฟอสเตอร์ City, CA, USA) โพรไฟล์การขี่จักรยานความร้อนถูก denaturation เป็นครั้งแรกที่ 95℃ สำหรับ 8 นาที fol - lowed 35 รอบของ 95℃ s, 47℃ 30 45 s และ 72℃ สำหรับ 3 นาที และขั้นตอนสุดท้ายขยายเดียวที่ 72℃ สำหรับ 10 นาที ขยายภาค rDNA ITS1 ทำออกเป็นข้างในน้ำยาผสมปฏิกิริยา 50 µL แต่ใช้
การทำ tapé ketan ได้อธิบาย previ-ously (Steinkraus, 1996) ตัวอย่างทั้งหมดถูกรวบรวมจากโซ ในชวากลาง (อินโดนีเซีย) (2)แยกของ yeasts ขวดขนาด 500 มล.ของตัวอย่างที่ประกอบด้วยถูกเขย่าดี และการส่วนลงตัว 5 mL ของแต่ละอย่างถูก inoculated ใน 5 mL ของยีสต์ autoclaved มอลต์สกัดสารสกัดซุป (ซุป YM) 0.3% สารสกัดจากยีสต์ (Difco ดีทรอยต์ MI สหรัฐอเมริกา), 0.3% มอลต์สกัด (Difco) และ 0.5% polypeptone (Wako เพียวเคมี จำกัด ญี่ปุ่น) การ broths YM เหล่านี้ 2, 25 หรือ 50% กลูโคสถูกเพิ่ม และป้าย YM2, YM25 หรือ YM50 ตามลำดับ PH ถูกโฆษณา-justed 3.7 และ 45 สื่อ YM2 และ YM25 ตามลำดับ ใช้ 1 M HCl PH ของ YM50 เป็น 5.9 ซุป inoculated วัฒนธรรมถูก incubated ในการบ่มเพาะวิสาหกิจเชคเกอร์ (200 รอบต่อนาที) ที่ 30℃ 7 วัน สื่อทั้งหมด YM agar (2, 1.5 และ 1.2% agar เพิ่มสื่อ YM2, YM25 และ YM50 ตามลำดับ) มีแนว inoculated จากแขวนตามที่อธิบายไว้โดย Kurtzman และ al. (2001) แผ่นลายถูก incubated ที่ 25℃ 7 วัน อาณานิคมถูกชุบอีกครั้งบนการประกอบ-agar สื่อ และวัฒนธรรมล้วนมีอยู่ในยีสต์สกัด-peptone-กลูโคส (YPD) ตอบสนอง agar เอียงสารสกัดจากยีสต์ 0.5% ประกอบด้วยกำลัง polypeptone 1%, 2% กลูโคส และ agar 2% ที่ 4 ℃ (3) คัด thermotolerant fermentative yeasts เป็น) ใช้หมักกิจกรรมทดสอบที่ 40℃ YPD คัดกรองยีสต์ 1% ที่มีขนาดกลางแยก polypeptone 2% และ 2% กลูโคส แต่ละสายพันธุ์แยกปลูกใน agar YM (24 − h 48 ที่ 25℃) แล้ว inoculated ใน 5 mL ของ YPD คัดกรองสื่อในหลอดทดสอบประกอบด้วยหลอดเดอรัม และ incubated ที่ 40℃ 5 วัน กิจกรรมการหมักยีสต์ได้คะแนน โดยการสะสมของแก๊สในหลอดเดอรัม สายพันธุ์ fermenting กลูโคสและผลิตภัณฑ์เซรามิคกำลังแก๊สในหลอดเดอรัมภายใน 24 ชมได้เลือกทดสอบเพิ่มเติม สายพันธุ์ b) ทดสอบขีดจำกัดของอุณหภูมิบนเลือกถูกทดสอบเพื่อกำหนดขีดจำกัดด้านอุณหภูมิ fermen-tation วัฒนธรรมสดโตที่ 37℃ ถูก inoculated ใน 5 mL ของกลางตรวจ YPD ในหลอดทดสอบประกอบด้วยหลอดเดอรัม หลอดทดสอบมี incubated ในการผลิตและชีวภาพเชคเกอร์ BR-15LF สาม (Taitec Co. Ltd. โตเกียว ญี่ปุ่น) กับสามีสั่นเบา ๆ การผลิตและถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิคง และแต่ละเพิ่มขึ้นในช่วงของ 1℃ ต่อวัน สะสมของก๊าซในหลอดเดอรัมถูกตรวจสอบทุกวัน ขีดจำกัดอุณหภูมิบน fer เอกสารเขาก็จะอยู่ระหว่างที่หมักไม่เกิดขึ้นหลังจากวันที่ 5 อุณหภูมิต่ำและอุณหภูมิต่ำสุดถัดไปที่หมักได้เกิดขึ้นดังที่วอล์และ Yarrow (1984) (4) เอทานอลผลิต โดย thermotolerant ขีดจำกัดอุณหภูมิสูงสุด สำหรับ fermenta- ปริมาณอองซานเงีย fermentative yeasts et al.144
Results แยก yeasts ที่เราไม่สามารถแยกยีสต์บริสุทธิ์แม้ว่ามีการเตรียมไวน์ข้าวใช้อย่าเหล้าพื้นเมืองที่ทราบว่าประกอบด้วยวัฒนธรรมผสมของจุลินทรีย์ (อองซาน et al., 2004) 4 ยีสต์แยกต่างหากจากไวน์ข้าวโบราณ 3 ชนิดแสดงในตารางที่ 1 การตรวจกรอง และชั้นบนอุณหภูมิขีดจำกัดของ thermotoler-มด fermentative yeasts หกสายพันธุ์ TW1-2, TW1 3, TW3-3, TW3-4, TB2-1 และ TG2-1 แสดงให้เห็นว่ารัดกุม fermenta-สเตรชัน และผลิตแก๊สที่ 44℃ ภายในวันที่ 2 ของคณะทันตแพทยศาสตร์ อย่างไรก็ตาม acco

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแยกและการวิเคราะห์วิวัฒนาการของสองทนร้อน, พันธุ์ยีสต์หมักจากของเหลวเทป Ketan (อินโดนีเซียไวน์ข้าว)
วิน aung, ยูกะวาตานาเบะ * และฟูมิโอะ HasHinaga
กรมชีวเคมีวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีคณะเกษตร, Kagoshima มหาวิทยาลัย 1-21-24 Korimoto, คาโกชิ 890-0065, ญี่ปุ่น
ได้รับ 20 มิถุนายน 2011; ยอมรับ 29 พฤศจิกายน 2011
ทั้งหมด 34 สายพันธุ์ยีสต์ที่แยกได้จากไวน์ข้าวกดจากเทป Ketan ข้าวอินโดนีเซียประเพณีอัลหมักเหนียว ในหมู่พวกเขาทั้งสองสายพันธุ์ที่เติบโตและหมักเหนือ 42 ° C ถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์ต่อไป การหมักถูกหามออกในสื่อที่มี 15% (w / v) น้ำตาลกลูโคสที่ 40 ° C และการผลิตเอทานอลเป็นวัดหลังจาก 48 ชั่วโมงของการบ่ม สองสายพันธุ์ TB2-1 และ TW1-3 ที่พบว่ามีขีด จำกัด บนของอุณหภูมิ 46 และ 47 ° C และการผลิตเอทานอลที่สูงขึ้น 5.9% และ 6.4% (w / v) ตามลำดับ ทั้งสองสายพันธุ์ยีสต์ถูกระบุโดยใช้เทคนิคแบบดั้งเดิมและโมเลกุล ในเทคนิคโมเลกุล 18S rDNA และถ่ายทอดยีน spacer ภายใน 1 (ITS1) rDNA ถูกขยายจากปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) โดยใช้ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจง ลำดับของทั้งสองภูมิภาคทั้งสองสายพันธุ์ถูกนำมาวิเคราะห์ phylogenetically และยีสต์สายพันธุ์ TB2-1 และ TW1-3 ถูกระบุว่าเป็น orientalis Issatch-enkia Saccharomyces cerevisiae และตามลำดับ
คำสำคัญ: ไวน์ข้าวทนร้อนและการหมักยีสต์, 18S rDNA , ITS1 rDNA
* ในการติดต่อผู้ที่ควรได้รับการแก้ไข E-mail: [e-mail]
บทนำการผลิตเอทานอลโดยการหมักยีสต์ในประเทศเขตร้อนโดยเฉพาะอย่างยิ่งในช่วงฤดูร้อนที่ไม่ได้เป็นไปได้ทางเศรษฐกิจเพราะเข้าพลังงานสูงที่จำเป็นในการหมักเย็น . ยีสต์ทนร้อนของข้อได้เปรียบที่มีศักยภาพ Fer ในอุตสาหกรรมเครื่องดื่มแอลกอฮอล์โดยการลดค่าใช้จ่ายในการทำความเย็นและโดยมีอัตราที่เร็วหมักโดยมีการดำเนินการที่ประหยัดมากขึ้น (Kiransree และคณะ, 2000;.. มหาอำมาตย์และคณะ, 2007) มีการ จำกัด จำนวนของความพยายามที่จะได้รับยีสต์จากแหล่งที่ไม่ใช่อาหารที่มีความสามารถในการเจริญเติบโตและการหมักหรือสูงกว่า 40 ℃ที่มีนักวิจัยบางคนแก้ไขพันธุกรรมยีสต์หมักที่จะทนร้อน (Hong et al, 2007;. Kawamura, 1999 ) นอกเหนือจากวิธีการเหล่านี้การคัดกรองของยีสต์จากสภาพแวดล้อมตัวแปรภายใต้กฎระเบียบรวมทั้งดินในภูมิภาคร้อน (รานซรีเอตอัล. 2000) ที่ดูเหมือนจะเป็นวิธีที่สำคัญในการระบุสายพันธุ์ที่เหมาะสมสามารถสำหรับการผลิตเชิงพาณิชย์และการลดค่าใช้จ่ายของ กระบวนการ ที่ดีที่สุดของความรู้ของเราได้มีการรายงานในลักษณะของทนร้อนยีสต์ fermenta-tive จากไวน์ข้าว ในการศึกษานี้เราใช้อินโดนีเซีย
ไวน์ข้าวกดจาก Ketan เทปเพื่อระบุ thermotoler มดยีสต์หมัก เทป Ketan เป็นอาหารแบบดั้งเดิมของอินโดนีเซียหมักที่ทำจากข้าวเหนียวซึ่งได้รับการนึ่งใน oculated และได้รับอนุญาตในการหมักกับ 24 ถึง 48 ชั่วโมงหรือนานกว่าที่อุณหภูมิห้อง (25-30 ℃) (Cronk และคณะ. 1979) . ปริมาณแอลกอฮอล์ของเทป Ketan เชื้อด้วยเชื้อจุลินทรีย์เริ่มต้นที่แตกต่างกันในช่วง 2.6-3.7% (v / v) หลังจากการหมักเป็นเวลา 48 ชั่วโมงและ 4.2-7.4% (v / v) หลัง 96 ชั่วโมง (กฎหมายและคณะ. 2011) ในเทป Ketan หมักน้ำตาลเพิ่มขึ้นจากการลดน้อยกว่า 1% ประมาณ 5% ใน 24 ชั่วโมงและเข้าถึงความเข้มข้นสูงสุด 16-17% ระหว่าง 36 และ 48 ชั่วโมง (Cronk et al,. 1977) ไวน์ข้าวเช่นส่วนที่เป็นของเหลวของเทป Ketan เป็นป๊อปแล้วก็คลาย alcoho130lic เครื่องดื่มในประเทศแถบเอเชีย (ดัง et al, 2006;.. Jeyaram et al, 2008) ประเทศส่วนใหญ่ที่ทำให้ไวน์ข้าวที่ตั้งอยู่ในภูมิภาคเขตร้อนและกึ่งเขตร้อนนั้นมี-ก่อนเราคาดว่าทนร้อนที่ยีสต์หมักอาจมีอยู่ในอาหารหมักดอง
วัสดุและวิธีการ (1) ไวน์ข้าวเก็บตัวอย่างบางส่วนของของเหลว Ketan เทป ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้เป็นสีขาว, สีแดงและสีเขียว
ข้างต้น tion 42 ℃และถูกเลือกใช้ในการเตรียมเมล็ดตรอกคัมภีร์ ของแต่ละสายพันธุ์เชื้อลงในหลอดทดสอบที่มี 10 มิลลิลิตร YPD เหลวและเพาะเลี้ยงที่ 37 ℃เพื่อ 8 ถึง 10 ชั่วโมงซึ่งกันและกันโดยการเขย่าที่ 120 รอบต่อนาที ปริมาณ 200 ไมโครลิตรของวัฒนธรรมเป็นอีกครั้งที่เชื้อเข้าไปในขวด 300 มิลลิลิตรเขย่าที่มีขนาด 100 มิลลิลิตร YPD และเพาะเลี้ยงที่ 37 ℃การเฟสแรก วัฒนธรรมถูกปั่นแล้วที่ 3000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 ℃, ล้างสองครั้งและ resuspended ในน้ำประปาผ่านการฆ่าเชื้อที่มีกลูโคส 0.1% ปริมาณ 100 มิลลิลิตร Tyndalized (วอห์น-Martini และ Martini, 1998) YPD กลางตรวจคัดกรองที่มีน้ำตาลกลูโคส 15% ได้รับการจ่ายเป็นขวด 300 มิลลิลิตร Erlenmeyer และเชื้อด้วย 5 กรัมของวัฒนธรรมเมล็ดเปียก ขวดหมักถูกติดตั้งเพื่อระบาย Stoppers CO2 ผ่านกับดักน้ำและบ่มในตู้ Bio ปั่น BR-15LF ที่ 40 ℃เขย่า (130 รอบต่อนาที) ตัวอย่าง 10 มิลลิลิตรถูกถอนออกจากแต่ละขวดหลังจาก 48 ชั่วโมงและหมุนเหวี่ยงที่ 6000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 ℃เพื่อขจัดเซลล์ supernatants ถูกนำมาใช้สำหรับการกำหนดเอทานอลตามที่อธิบายไว้โดย Suresh ตอัล (1999) (5) บัตรประจำตัวของยีสต์โดยทั่วไปเทคนิคการระบุการชุมนุมของยีสต์ถูกหามออกไปตามไอเอ็นจีเกณฑ์ที่อธิบายโดยเคิร์ทซ์และตก (1998) ขึ้นอยู่กับลักษณะทางสัณฐานวิทยาและสรีรวิทยา นอกจากนี้การทดสอบเพิ่มเติมสำหรับการสร้างแป้งยูเรีย HY-drolysis และ Diazomium Blue B (DBB) การทดสอบปฏิกิริยาสีนอกจากนี้ยังได้ดำเนินการตามที่อธิบายโดยยาร์โรว์ (1998) เคิร์ทซ์และตก (1998) และบาร์เน็ตต์และอัล (2000) คีย์ในการจำแนกยีสต์ถูกนำมาใช้ (6) บัตรประจำตัวของยีสต์โดยใช้เทคนิคโมเลกุล) การแยกดีเอ็นเอขยายและลำดับทั้งหมดยีสต์สายพันธุ์ที่เลือกมาปลูกใน 5 มิลลิลิตร YPD สื่อของเหลว ณ วันที่ 30 ℃เวลา 24 ชั่วโมงในตู้อบเครื่องปั่น (150 รอบต่อนาที) ดีเอ็นเอ isola ชั่นได้รับการดำเนินการโดยใช้วิธีการที่อธิบายโดย Makimura ตอัล (1994) ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (PCR) การขยายของภูมิภาค 18S rDNA ถูกหามออกใน 50 ไมโครลิตรผสมปฏิกิริยาที่มี 50 ดีเอ็นเอ ng, 0.5 ไมครอนของแต่ละไพรเมอร์ (NS1, 5'-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TC-3 ', Schabereiter- GURTNER et al, 2001;. และ FR1, 5'-AIC CAT TCA ATC GGT AIT-3 'ที่ฉันแสดง inosine, คุก et al, 2008;.. มหาอำมาตย์และคณะ, 2007), 5 ไมโครลิตรจาก 10 ×กันชน 4 ไมโครลิตรส่วนผสม dNTP (แต่ละ dNTP ที่ 2.5 มม. ) และ 1.25 U TAKARA Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Takara, จังหวัดเมืองชิ, ญี่ปุ่น) ขยาย PCR ได้ดำเนินการใน GeneAmp ® PCR ระบบ thermocycler 7900 (PE Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, สหรัฐอเมริกา) รายละเอียดการขี่จักรยานเป็นความร้อน denaturation เริ่มต้นที่ 95 ℃เป็นเวลา 8 นาที, FOL-lowed 35 รอบจาก 95 ℃เป็นเวลา 30 วินาที, 47 ℃เป็นเวลา 45 และ 72 ℃เป็นเวลา 3 นาทีและขั้นตอนการขยายเดียวสุดท้ายที่ 72 ℃เพื่อ 10 นาที การขยายของพื้นที่บริเวณ ITS1 rDNA ถูกหามออกตามที่อธิบายไว้ข้างต้นใน 50 ไมโครลิตรผสมปฏิกิริยา แต่ใช้
กระบวนการในการทำเทป Ketan ได้รับการอธิบายอย่างก่อนหน้าถ้าข่าวสาร (Steinkraus, 1996) ตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บมาจากคนเดียวในชวากลาง (อินโดนีเซีย) (2) การแยกยีสต์ที่มีขวด 500 มิลลิลิตรของตัวอย่างถูกสั่นดีและหาร 0.5 มิลลิลิตรของแต่ละตัวอย่างเป็นเชื้อเป็น 5 มิลลิลิตรของสารสกัดจากยีสต์เบา-มอลต์สกัดน้ำซุป (YM น้ำซุป) ที่มีสารสกัดจากยีสต์ 0.3% (Difco, ดีทรอยต์, มิชิแกน, สหรัฐอเมริกา), สารสกัดจากมอลต์ 0.3% (Difco) และ 0.5% polypeptone (Wako Pure เคมี จำกัด , ญี่ปุ่น) เหล่านี้ซุปมิโสะ YM, 2, 25 หรือ 50% กลูโคสถูกเพิ่มและติดป้าย YM2, YM25 หรือ YM50 ตามลำดับ พีเอชที่ได้รับการโฆษณา justed ถึง 3.7 และ 4.5 เพื่อ YM2 และ YM25 สื่อตามลำดับโดยใช้ 1 M HCl pH ของ YM50 5.9 หัวเชื้อน้ำซุปวัฒนธรรมที่ถูกบ่มในตู้อบเครื่องปั่น (200 รอบต่อนาที) วันที่ 30 ℃เป็นเวลา 7 วัน สื่อ YM วุ้น (2, 1.5 และ 1.2% วุ้นเพิ่ม YM2, YM25 และ YM50 สื่อตามลำดับ) มีแนวเชื้อจากวัฒนธรรมระงับตามที่อธิบายไว้โดยเคิร์ทซ์และอัล (2001) แผ่นลายถูกบ่มที่ 25 ℃เป็นเวลา 7 วัน อาณานิคมถูกชุบอีกครั้งบนครตอบสนองสื่อวุ้นและวัฒนธรรมที่บริสุทธิ์ได้รับการเก็บรักษาไว้ในสารสกัดจากยีสต์-เปปโตนกลูโคส (YPD) วุ้น slants มีไอเอ็นจีสารสกัดจากยีสต์ 0.5%, 1% polypeptone, น้ำตาล 2% และ 2% วุ้นที่ 4 ℃ (3) การคัดเลือกทนร้อนยีสต์หมัก) การทดสอบกิจกรรมการหมักที่ 40 ℃ YPD กลางตรวจคัดกรองที่มีสารสกัดจากยีสต์ 1%, 2% polypeptone และน้ำตาล 2% ถูกนำมาใช้ แต่ละสายพันธุ์ที่แยกได้รับการปลูกใน YM วุ้น (24 - 48 ชั่วโมงที่ 25 ℃) แล้วเชื้อเป็น 5 มิลลิลิตร YPD กลางการตรวจคัดกรองในหลอดทดลองที่มีหลอดเดอร์แฮมและบ่มที่ 40 ℃เป็นเวลา 5 วัน กิจกรรมยีสต์หมักได้คะแนนจากการสะสมของก๊าซในหลอดเดอร์แฮม สายพันธุ์หมักน้ำตาลกลูโคสและก๊าซ produc ไอเอ็นจีในหลอดเดอร์ภายใน 24 ชั่วโมงถูกเลือกสำหรับการทดสอบเพิ่มเติม ข) การทดสอบขีด จำกัด บนอุณหภูมิสายพันธุ์ที่เลือกได้มีการทดสอบเพื่อตรวจสอบขีด จำกัด อุณหภูมิบนสำหรับ fermen-ช่อ วัฒนธรรมสดเติบโตที่ 37 ℃เป็นเชื้อเป็น 5 มิลลิลิตร YPD กลางการตรวจคัดกรองในหลอดทดลองที่มีหลอดเดอร์แฮม หลอดทดลองบ่มในสามไบโอปั่น BR-15LF ตู้อบ (Taitec จำกัด , โตเกียว, ญี่ปุ่น) ที่มีความอ่อนโยนสั่นวันละสองครั้ง ตู้อบที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิคงที่และแต่ละคนได้รับการเพิ่มขึ้นในช่วงเวลา 1 ℃ต่อวัน การสะสมของก๊าซในหลอดเดอร์แฮมถูกพบในชีวิตประจำวัน จำกัด อุณหภูมิบนสำหรับ Fer-mentation ได้รับการพิจารณาจะอยู่ระหว่างอุณหภูมิต่ำสุดที่ไม่มีการหมักเกิดขึ้นหลังจากที่ 5 วันและอุณหภูมิต่ำสุดถัดไปที่การหมักเกิดขึ้นตามที่อธิบายไว้โดยวอลท์และยาร์โรว์ (1984) (4) การผลิตเอทานอลโดยทนร้อนยีสต์หมักสายพันธุ์กับข้อ จำกัด อุณหภูมิบนสำหรับ fermenta-aung ดับบลิวเอ al.144
ผลลัพธ์การแยกยีสต์เราก็สามารถที่จะแยกสายพันธุ์ยีสต์บริสุทธิ์แม้ว่าไวน์ข้าวที่ได้รับการเตรียมการใช้เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ในประเทศเริ่มที่ เป็นที่รู้จักกันจะมีวัฒนธรรมผสมของเชื้อจุลินทรีย์ (อองตอัล. 2004) สามสิบสี่สายพันธุ์ยีสต์ที่แยกได้จากสามประเภทของไวน์ข้าวแบบดั้งเดิมที่แสดงในตารางที่ 1 การตรวจคัดกรองและ จำกัด อุณหภูมิบนของ thermotoler มด, การหมักยีสต์หกสายพันธุ์ TW1-2, TW1-3, Tw3-3, Tw3-4, TB2-1 และ TG2-1 แสดงให้เห็นความแข็งแกร่ง fermenta-tion และก๊าซผลิตที่ 44 ℃ภายใน 2 วันของการบ่ม แต่ acco

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแยกและวิเคราะห์สารต่างๆของวิศวกรรมเคมี 2 , สายพันธุ์ยีสต์จากของเหลวและแตะ ketan ( ไวน์ข้าวอินโดนีเซีย )
วินอ่อง ยูกะ ฟุมิโอะ วาตานาเบะ และ hashinaga
ภาควิชาเทคโนโลยี&วิทยาศาสตร์ชีวเคมี คณะเกษตรศาสตร์ มหาวิทยาลัย 1-21-24 korimoto โกชิโกชิ , , 890-0065 ญี่ปุ่น
ได้รับ 20 มิถุนายน , 2011 ; ยอมรับพฤศจิกายน 29 2011
ทั้งหมด 34 สายพันธุ์ยีสต์ที่แยกได้จากไวน์ข้าวสกัดจากก๊อกโดย ketan ประเพณี - อินโดนีเซีย อัล ข้าวหมาก . ในหมู่พวกเขา สองสายพันธุ์ที่เติบโตและหมัก ข้างต้น 42 ° C มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิเคราะห์ต่อไป หมักได้ดําเนินการในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี 15 % ( w / v ) กลูโคสที่ 40 ° C และการผลิตเอทานอลจะถูกวัดหลังจาก 48 ชั่วโมงของการบ่ม สองสายพันธุ์และ tb2-1 tw1-3 พบว่ามีขีด จำกัด ของ 46 และ 47 ° C อุณหภูมิด้านบนและผลผลิตเอทานอลที่สูงขึ้นของ 5.9 % และ 4 % ( w / v ) ตามลำดับ ทั้งสองสายพันธุ์ยีสต์ที่ถูกระบุโดยดั้งเดิมและระดับเทคนิค ในเทคนิคระดับโมเลกุลและ 18S rDNA spacer 1 ( ภายในและ its1 ) ด้วยการขยายยีนโดยปฏิกิริยาลูกโซ่ ( PCR ) โดยใช้ไพร์เมอร์จำเพาะลำดับของทั้งสองภูมิภาคสำหรับสองสายพันธุ์ phylogenetically วิเคราะห์ และยีสต์สายพันธุ์ tb2-1 tw1-3 และถูกระบุว่าเป็น issatch - enkia orientalis และ Saccharomyces cerevisiae ตามลำดับ
คำสำคัญ : ไวน์ข้าว , ยีสต์และสาร 18S rDNA วิศวกรรมเคมี , its1 rDNA
* ที่จดหมายควรจะ addressed [e-mail]
e - mail :แนะนำการผลิตเอทานอลจากการหมักยีสต์ในประเทศเขตร้อน โดยเฉพาะในช่วงฤดูร้อน ไม่ใช่เศรษฐกิจเป็นไปได้เพราะของพลังงานสูงที่ใส่ต้องให้เย็น fermenters . ยีสต์ทนร้อนของ - เพื่อประโยชน์ในศักยภาพอุตสาหกรรมแอลกอฮอล์ โดยการลดต้นทุน โดยมีอัตราการหมักและเย็นเร็วขึ้น- โดยการทำให้กระบวนการที่ประหยัดมากขึ้น ( kiransree et al . , 2000 ; ปาชา et al . , 2007 ) มีจำนวน จำกัด ของความพยายามเพื่อให้ได้ยีสต์จากอาหารและไม่ใช่อาหาร แหล่งที่สามารถเจริญและการหมักที่ขึ้นไป 40 ℃กับนักวิจัยวิศวกรรมเคมี การปรับเปลี่ยนพันธุกรรมยีสต์จะทน ( Hong et al . , 2007 ; คาวามูระ , 1999 ) นอกจากวิธีการเหล่านี้การคัดเลือกยีสต์จาก vari ous สภาพแวดล้อมรวมทั้งดินในภูมิภาคร้อน ( คิราซรี et al . , 2000 ) ที่ดูเหมือนจะเป็นวิธีที่สำคัญของชุด - สามารถระบุสายพันธุ์เพื่อการผลิตเชิงพาณิชย์ และการลดต้นทุนของกระบวนการ เพื่อที่ดีที่สุดของความรู้ของเรามีการรายงานในลักษณะของสาร fermenta , - tive ยีสต์จากไวน์ข้าว ในการศึกษานี้เราใช้ภาษาไทย
ข้าวไวน์กดจากก๊อกโดย ketan ระบุ thermotoler - มด วิศวกรรมเคมี ยีสต์ แตะและ ketan เป็นอินโดนีเซียแบบดั้งเดิม อาหารหมักที่เตรียมจากข้าวเหนียว ซึ่งมีนึ่ง , - oculated ในและอนุญาตให้หมักเป็นเวลา 24 ถึง 48 ชั่วโมงหรือนานกว่าที่อุณหภูมิแวดล้อม ( 25 ถึง 30 ℃ ) ( คร็องก์ et al . , 1979 )แอลกอฮอล์ของผู้ ketan แตะใส่เชื้อบริสุทธิ์เริ่มต้นที่แตกต่างกันตั้งแต่ 2.6 ถึง 3.7 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) หลังจากหมัก 48 ชั่วโมงและ 4.2 ถึง 7.4 % ( v / v ) หลัง 96 H ( กฎหมาย et al . , 2011 ) ใน ketan แตะจากการหมักลดน้ำตาลเพิ่มขึ้นจากน้อยกว่า 1% ถึงประมาณร้อยละ 5 ใน 24 ชั่วโมง และถึงความเข้มข้นสูงสุดที่ 16 ถึง 17 เปอร์เซ็นต์ ระหว่าง 36 และ 48 ชั่วโมง คร็องก์ et al . , 1977 )ไวน์ข้าว เช่น ส่วนของของเหลวและจะปรากฏ ketan แตะเครื่องดื่ม alcoho130lic ular ในประเทศเอเชีย ( มูลสัตว์ et al . , 2006 ; jeyaram et al . , 2008 ) ประเทศส่วนใหญ่ที่ทำไวน์ข้าวตั้งอยู่ในภูมิภาคเขตร้อนและกึ่งเขตร้อน มี ก่อน คาดว่าสารวิศวกรรมเคมี , ยีสต์อาจมีอยู่ในอาหารหมัก .
วัสดุและวิธีการ ( 1 ) การเก็บตัวอย่างข้าวไวน์ส่วนของเหลวของ ketan แตะและใช้ในการศึกษา คือ สีขาว สีแดง และสีเขียว
tion ข้างต้น 42 ℃ถูกเลือกและใช้เพื่อเตรียมเมล็ด CUL - ตูเรส . แต่ละสายพันธุ์ เป็นเชื้อในหลอดทดลองบรรจุ 10 ml ของ ypd อาหารเหลวและเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 ℃สำหรับ 8 ถึง 10 ชั่วโมง โดยแบบสั่นที่ 120 รอบต่อนาที200 - µ L ปริมาณของวัฒนธรรมเป็นอีกครั้งแต่เป็น 300 มล. เขย่าขวดบรรจุ 100 ml ypd ขนาดกลางและเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 ℃ที่จะเฟสอยู่กับที่ก่อน วัฒนธรรมเป็นระดับที่ 3000 × G สำหรับ 5 นาทีที่ 4 ℃ ล้างหน้าสองครั้งและ resuspended ในหมันน้ำประปาประกอบด้วย 0.1% กลูโคส 100 ml ปริมาณ tyndalized ( วอห์นและมาร์ตินี่ มาร์ตินี่1998 ) การคัดเลือกอาหารที่มีกลูโคส 15% ypd คือจ่ายเป็น 300 ml ขวดเชื้อเออร์เลนเมเยอร์และ 5 กรัมของวัฒนธรรมเมล็ดเปียก การหมักขวดถูกติดตั้งกับ stoppers เพื่อระบาย CO2 ผ่านกับดักน้ำและบ่มในไบโอ ปั่น br-15lf ฟัก 40 ℃เขย่า ( 130 รอบต่อนาที )10 ml ตัวอย่างถูกถอนจากแต่ละขวดหลังจาก 48 ชั่วโมงไฟฟ้า 6000 × G สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ℃ลบเซลล์ การ supernatants ใช้เอทานอลกำหนดตามที่อธิบายไว้โดย Suresh et al . ( 1999 )( 5 ) วินิจฉัยชนิดของยีสต์ โดยใช้เทคนิคแบบธรรมดารหัสของยีสต์ได้ดำเนินการสอดคล้อง - อิงกับเกณฑ์ที่อธิบายโดยเคิร์ทแมนและลดลง ( 1998 ) ตามลักษณะทางสัณฐานวิทยาและสรีรวิทยา . นอกจากนี้ การทดสอบเพิ่มเติมเพื่อการสร้างแป้งยูเรีย HY - drolysis diazomium สีฟ้าและ B ( DBB ) ทดสอบปฏิกิริยาการเกิดสี ก็ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยโรว์ ( 1998 ) ส่วนเคิร์ทแมนและลดลง ( 1998 ) และ บาร์เน็ตต์ et al . ( 2000 ) กุญแจชนิดยีสต์มาใช้ ( 6 ) การวินิจฉัยชนิดของยีสต์ที่โมเลกุลด้วยเทคนิค ) การแยกดีเอ็นเอเครื่องขยายเสียงและลำดับทั้งหมดคัดเลือกสายพันธุ์ยีสต์เติบโตใน 5 ml ypd เหลวที่อุณหภูมิ 30 ℃ 24 H ในเครื่องปั่นเครื่องฟักไข่ ( 150 รอบต่อนาที ) โซลา ดีเอ็นเอ - tion ได้ดําเนินการโดยใช้วิธีการที่อธิบายโดยมากิมูระ et al . ( 1994 ) ปฏิกิริยาลูกโซ่ ( PCR ) ( 18S rDNA ของเขตข้อมูลใน 50 - µ L ปฏิกิริยาผสมที่มี 50 นาโนดีเอ็นเอ 0.5 M ของแต่ละสี ( 1 µ ,5 ' - CCA GTA GTC ATA TGC ทีทีจี tc-3 ' schabereiter - gurtner et al . , 2001 ; และ fr1 5 ' - AIC แมว TCA ATC ไม่ ait-3 ' ที่ผมเป็นตัวแทนอินโนปรุง et al . , 2008 ; ปาชา et al . , 2007 ) , 5 µ L 10 ×บัฟเฟอร์ 4 µลิตรผสม dntp ( แต่ละ dntp 2.5 มม. ) และ 1.25 ยูทาการะ ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( ทาคาระงะ , ญี่ปุ่น )PCR ( แสดงใน geneamp ® PCR ระบบใหม่เทอมอไซเคล ์ ( PE Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา โดยจักรยานโปรไฟล์เป็น ( เริ่มต้นที่ 95 ℃ 8 มิน สีขาว - lowed 35 รอบ 95 ℃ 30 , 45 และ 47 ℃ 72 ℃นาน 3 นาที และสุดท้ายเดียวขยายขั้นตอนที่ 72 ℃นาน 10 นาทีการเพิ่มปริมาณของ its1 rDNA เขตได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้นใน 50 - µ L ปฏิกิริยาผสมแต่ใช้
ขั้นตอนการทําแตะ . . . ketan ได้รับการอธิบาย previ - ously ( steinkraus , 1996 ) ตัวอย่างทั้งหมดจะถูกเก็บรวบรวมจากเดี่ยวในชวา ( อินโดนีเซีย ) ( 2 ) การแยกยีสต์ขวดบรรจุ 500 มิลลิลิตร จำนวนสะเทือนได้ดี และ 05-ml ส่วนลงตัวของแต่ละตัวอย่างเป็นเชื้อ 5 มิลลิลิตร สารสกัดจากยีสต์ สารสกัดจากมอลต์สังเคราะห์ - น้ำซุป ( ซุป ) ) ประกอบด้วยสารสกัดจากยีสต์ 0.3% ( difco ดีทรอยท์ มิ , USA ) , สารสกัดจากมอลต์ 0.3% ( difco ) และ 0.5% polypeptone ( Wako เพียวเคมี จำกัด ประเทศญี่ปุ่น ) าการเหล่านี้เพื่อ , 2 , 25 หรือ 50 % กลูโคสเพิ่มป้าย ym2 ym25 , หรือได้ตามลำดับ ค่า pH คือโฆษณา - justed ราคา 4 .5 ym2 ym25 ตามลำดับ และสื่อที่ใช้ 1 M HCl . ค่า pH ได้คือ 5.9 . หัวเชื้อน้ำซุปวัฒนธรรมถูกบ่มในตู้อบ ( เขย่า 200 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 30 ℃ ) เป็นเวลา 7 วัน สื่อต่างๆ ) ( 2 , 1.5 และ 1.2% วุ้นเพิ่ม ym2 ym25 ได้ , และสื่อ , ตามลำดับ ) เป็นริ้ว หัวเชื้อจากการระงับวัฒนธรรมตามที่อธิบายไว้โดย เคิร์ทแมน et al . ( 2001 )ลายแผ่นอุณหภูมิ 25 ℃เป็นเวลา 7 วัน อาณานิคมได้ถูกชุบอีกครั้งเข้าสู่หัวใจ - สนองอาหารวุ้น และเชื้อบริสุทธิ์ถูกรักษายีสต์สกัด ( extract glucose agar slants ypd ) ประกอบด้วย - ไอเอ็นจีสารสกัดจากยีสต์ 0.5% , 1% polypeptone กลูโคสร้อยละ 2 และ 2 % Agar 4 ℃ . การคัดกรองสาร ( 3 ) ,วิศวกรรมเคมี ) การหมักยีสต์กิจกรรมทดสอบที่ 40 ℃ ypd การคัดเลือกอาหารที่มียีสต์สกัดร้อยละ 1 polypeptone 2% และกลูโคสร้อยละ 2 ใช้ ของแต่ละสายพันธุ์ก็โต ) สามารถแยกได้ ( − 48 ชั่วโมง 24 25 ℃ ) จากนั้นเชื้อ 5 มิลลิลิตร ypd คัดกรองสื่อในหลอดทดลองที่มีท่อเดอแรม บ่มที่ 40 ℃เป็นเวลา 5 วันหมักยีสต์โดยมีคะแนนโดยการสะสมของก๊าซใน เดอแรม หลอด สายพันธุ์หมักกลูโคสและ produc - ไอเอ็นจีใน เดอแรม ท่อก๊าซภายใน 24 ชั่วโมงได้ถูกเลือกสำหรับการทดสอบต่อไป B ) ตอนบนอุณหภูมิจำกัดทดสอบเลือกสายพันธุ์ทดสอบเพื่อกำหนดขอบเขตอุณหภูมิด้านบน fermen - tation .วัฒนธรรมสดที่ปลูกที่ 37 ℃เป็นเชื้อ 5 มิลลิลิตร ypd คัดกรองสื่อในหลอดทดลองที่มีเดอร์แฮมหลอด หลอดทดสอบถูกเลี้ยงในตู้ ( taitec br-15lf ปั่นสามไบโอ จำกัด โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น กับอ่อนโยนสั่น 2 ครั้งต่อวัน มีตู้เก็บที่อุณหภูมิคงที่และเพิ่มขึ้นในแต่ละช่วงเวลา 1 ℃ต่อวันการสะสมของก๊าซในหลอด Durham พบทุกวัน ขีดจำกัดอุณหภูมิด้านบนเพื่อ - mentation ถือเป็นตั้งอยู่ระหว่าง อุณหภูมิต่ําสุดที่ไม่มีการหมักเกิดขึ้นหลังจาก 5 วันถัดไปอุณหภูมิต่ําสุดที่หมักได้เกิดขึ้นตามที่อธิบายไว้โดยวอลท์ โรว์ ( 1984 ) ( 4 ) การผลิตเอทานอล โดยอุณหภูมิสูง ,วิศวกรรมเคมี ยีสต์สายพันธุ์กับอุณหภูมิบนข้อ จำกัด สำหรับ fermenta - W . อ่อง et al . แยก 144
ผลของยีสต์เราสามารถแยกสายพันธุ์ยีสต์บริสุทธิ์ ถึงแม้ว่าข้าวไวน์ได้เตรียมเหล้าพื้นเมืองที่ใช้เริ่มเป็นที่รู้จักกันเพื่อให้ประกอบด้วยเชื้อผสมของจุลินทรีย์ ( อ่อง et al . , 2004 )สามสิบสี่สายพันธุ์ยีสต์ที่แยกจากสามประเภทของไวน์ข้าวแบบดั้งเดิมจะแสดงในตารางที่ 1 การคัดกรองและขีด จำกัด ของ thermotoler - มด อุณหภูมิบน วิศวกรรมเคมี ยีสต์ 6 สายพันธุ์ tw1-2 tw1-3 tw3-3 tw3-4 , , , , และ tb2-1 tg2-1 ให้แข็งแรง fermenta - tion และผลิตก๊าซที่ 44 ℃ภายใน 2 วันของการบ่ม อย่างไรก็ตาม ซีโอ