Freeze Drying Process - Shelf Lyoph

Freeze Drying Process - Shelf Lyophilizer

Turn on the lyophilizer and start the condenser. If there is an external condenser using a dry ice/ethanol mixture then prepare this as well. The shelf can be set to 4°C.

Center the vials on the shelf. This placement is important so that the stoppering plate can evenly press on the stoppers following freeze drying.

Using either manual or programmed controls, freeze the samples down to -40°C. This step should take approximately 30-60 minutes and is very dependent upon the instrument. If the rate of freezing can be controlled, then a drop of 1°C per minute is a practical rate. Once the samples reach temperature, they should be visibly frozen (clear liquid turn opaque and skim milk appears solid).

Allow the sample to sit at -40°C for 1 hr to ensure complete freezing. Vials at the center of a cluster may freeze more slowly than those on the outside.

Turn on the vacuum pump. Within 10-20 minutes, the vacuum should be under 200 millitorr (mtorr). Depending on the instrument, pressure may be reported in mtorr, mbar, Pascal, or "inches Hg" on a vacuum gauge. For reference, 100 mtorr = 0.133 mbar = 13.3 Pascal = 29.9" Hg = 0.000132 atm = 99.99% vacuum.

Once the vacuum is below 200 mtorr, increase the temperature of the shelf for primary drying, the phase associated with water sublimation. The temperature of the shelf is dependent upon the lyophilization medium. For sucrose, keep the shelf temperature at -25°C. For Reagent 18 or Microbial Freeze Drying Buffer, the shelf can be as high as -15°C. In any case, the greater the difference in temperature between the shelf and the condenser/ice trap, the more efficient the primary drying process will be.

If melting of the samples occurs, then it might be necessary to empirically determine a shelf temperature. A practical means to do this involves placing a sample of the lyoprotective medium on a shelf and incrementally lowering the temperature every 15 minutes. At some point the sample freezes. Under vacuum with a cold trap, your sample will be safe and will remain frozen. This is a practical method and is certainly not necessarily the most efficient primary drying temperature, but it should work well enough.

Primary drying is the longest phase of the freeze drying process. The idea is to keep the sample colder than condenser (or ice trap) but still sufficiently warm so that water sublimes rapidly. The temperature of the shelf can be raised to above the melting temperature as long as the sublimation process removes the heat flowing into the sample sufficiently fast to prevent melting and sample collapse (where the matrix literally caves in). The time for primary drying will also depend upon the volume of the sample. For bacteria, samples rarely need to be large and typically are 0.25 to 0.5 ml. A limited number of samples (10-20) in a shelf dryer can be completed in just a couple of hours. A fully loaded dryer with several hundred samples will take longer. Safely, a primary drying period which is overnight should work, but test this first before you attempt to freeze dry large numbers of vials. As a standard guide, freeze dry overnight.

Samples still contain moisture following primary drying. The amount is debatable, but it somewhere between 2 and 4%. This moisture level needs to be reduced and that is done by pumping heat into the sample during the secondary drying phase. This phase is relatively short, lasting 1 to 2 hours, but important for long-term viability. However, over drying of the bacteria can be detrimental as well. Once again, based on the idiosyncrasies of your lyophilizer and samples, the ideal time for secondary drying needs to be determined experimentally. Generally, raise the shelf temperature to 20°C and dry for 2 hours.

With the vacuum in place, stopper the vials using the stoppering plate/mechanism. Release the vacuum, remove the vials, and further secure the rubber bungs/stoppers with foil crimp seals. It is best to store the vials at 4°C in the dark.

Test the freeze dried bacteria for viability as compared to the original culture (see link). Additionally, monitor the stability/viability of the freeze dried cultures by testing at 30, 90, 180 and 365 days. A good protocol will yield nearly 100% viable cells. Anything above 50% is considered acceptable by many labs. Skim milk will yield 10-20%. However, % viable after freeze drying is not as important as the number viable following storage. If viability starts to decline rapidly by a log or more per month, then modification of the protocol is probably necessary. Note that some strains are simply very difficult to freeze dry and no matter what, these may die off quickly following lyophilization.

ผลลัพธ์ (จีน) 1:

冷冻干燥过程的架子上冻干机在冻干机上翻，开始凝汽器。如果有外部的冷凝器，然后使用干冰/乙醇混合物准备这一样好。书架上可以设置到 4 ° c。中心在架子上的小瓶子。这个位置是很重要的这样 stoppering 板可以均匀地按以下冷冻干燥瓶塞。使用手动或编程控件，冻结的样品至-40 ° c。这一步应采取大约 30-60 分钟，并非常依赖于该文书。如果能够控制冻结率，那么实际率就是一滴每分钟 1 ° C。一旦样品达到温度，他们应该明显冻结 （透明液体变得不透明和脱脂牛奶为实线）。允许此示例将坐在-40 ° C 为 1 小时，以确保完全冻结。小瓶在星团的中心可能会慢慢地比那些在外面冻结。开启真空泵。在 10-20 分钟内真空应低于 200 millitorr （mtorr）。视该票据，压力可能会报告在 mtorr、 毫巴、 帕斯卡或"英寸汞柱"上真空计。供参考，100 mtorr = 0.133 毫巴 = 13.3 帕斯卡 = 29.9"Hg = 0.000132 atm = 99.99%真空。一旦真空是低于 200 mtorr，提高温度的原发性干燥架伴水升华的阶段。架子上的温度是取决于冷冻干燥介质。为蔗糖，保持搁板温度在-25 ° c。对于试剂 18 或微生物的冻结干燥缓冲区，架子上可以高达-15 ° c。在任何情况下，越大的架子和凝汽器/冰的温度差异陷阱，原发性干燥过程将会更有效率。如果样品的熔融发生，它可能需要根据经验确定搁板温度。实际的方式做到这涉及到将 lyoprotective 介质的样品放在架子上和增量降温每 15 分钟一班。在某一时刻的样品冻结。根据真空冷阱，你的样品将安全和仍将被冻结。这是一种实用方法，当然不一定是最有效的原发性干燥温度，但它应该工作得不够好。原发性干燥是冷冻干燥过程最长阶段。这个想法是保持一支比凝汽器 （或冰陷阱） 冷但仍然足够温暖样品，水迅速升华。只要升华过程中移除流入迅速，足以防止融化和样品的样品的热崩溃 （在那里矩阵从字面上洞穴） 架子上的温度可以熔化温度以上增至。原发性干燥时间还取决于样品的体积。细菌，样本很少需要很大，通常是 0.25 到 0.5 毫升。为数有限的样本 （10-20） 在一个干燥的架子可以在几小时内完成。与几个几百个样品的满载的烘干机需要更长时间。安全、 初级干燥阶段是一夜之间应该工作，但这第一次在你之前测试试图冻结干燥很大数量的小瓶。作为一名标准的导游，冻结干燥的一夜之间。样品仍然包含以下主要干燥的水分。金额是值得商榷，但它介于 2 和 4%。这个水分水平需要减少，这通过二次干燥阶段注入样品的热。这一阶段是相对较短，持续 1 到 2 个小时，但重要的长期生存能力。然而，在干燥的细菌能损以及。再次，基于您的冻干机和样品的特质，二次干燥的理想时间需要通过实验来确定。一般来说，提高到 20 ° C 的搁板温度和干了 2 个小时。在地方真空，塞瓶使用每个对 stoppering 的板。释放真空、 删除小瓶，并进一步确保赔本买卖/橡胶瓶塞的箔卷曲的封条。它是最好把它保存在 4 ° C 瓶在黑暗中。测试冻干菌的生存能力比原来的文化 （见链接）。另外，监视的冻干文化工作做一个稳定可行性通过测试在 30、 90、 180 和 365 天。一个好的协议将产生近 100%的活细胞。任何超过 50%是由许多实验室认为可以接受。脱脂牛奶会产生 10-20%。然而，%可行后冷冻干燥是不可行后存储数量一样重要。如果生存能力开始快速下跌日志或每个月多，则可能有必要修改议定书 》。注意有些菌株都只是很难冻结干燥，无论怎样，这些或许会死掉迅速后冻干。

ผลลัพธ์ (จีน) 2:

冷冻干燥过程-现有的冻干机打开冷冻干燥机，并开始冷凝器。如果存在使用干冰/乙醇混合物再准备这个问题，以及外部冷凝器。架子可以被设置为4℃。中心的架子上的小瓶中。这个位置是重要的，以使塞板可以均匀地按以下的冷冻干燥的塞子。使用手动或编程控制，冻结的样品下降到-40℃。这一步大约需要30-60分钟，非常依赖文书上。如果冷冻的速率是可以控制的，然后下降为每分钟1℃，是一种实用的速率。一旦样品达到温度时，它们应当是明显的冷冻（透明液体变成不透明和脱脂牛奶出现固体）。让样品坐在-40℃下1小时，以确保完全冷冻。小瓶在一个集群的中心可能会冻结比在外面更慢。打开真空泵。内10-20分钟，真空应低于200毫乇（毫乇）。取决于仪器，压力可以在毫托，毫巴，帕斯卡，或“英寸汞柱”关于真空计报告。为基准，100毫托= 0.133毫巴= 13.3帕斯卡= 29.9“汞柱= 0.000132大气压= 99.99％的真空。一旦真空度低于200毫托，增加搁板的初级干燥，加水升华相关联的相位的温度，该温度搁板的是依赖于冻干平台。对于蔗糖，保持架温度在-25℃。对于试剂18或微生物冷冻干燥缓冲液中，搁板可高达-15℃。在任何情况下，更大的在搁板和冷凝器/冰陷阱之间的温度差时，更高效的初级干燥过程中会。如果发生样品的熔化，那么它可能是必要的，以经验确定的搁板温度下进行。的实用手段做到这涉及把lyoprotective介质样品在货架上，并逐渐降低温度，每隔15分钟，在某些点上的样品冻结。在真空冷阱，样品将是安全的，并会继续冻结，这是一个实用的方法是当然不一定是最有效的初级干燥温度，但它应该足够好。初级干燥冷冻干燥过程中最长的阶段。该想法是保持样品温度低于冷凝器（或冰陷阱），但仍然足够暖和，使水升华迅速。搁板的温度可只要在升华过程中除去流入样品足够快，以防止熔化和样品崩溃（其中矩阵字面上洞穴中）的热量被升温至熔融温度以上。时间为初级干燥也将取决于样品的体积时。对于细菌，样品很少需要大，并且通常是0.25至0.5毫升 在货架机样本（10-20）数量有限，可以在短短几个小时内完成。完全装载的机数百样本将需要更长的时间。安全，初级干燥时间是在一夜之间应该工作，但您尝试冷冻干燥大批小瓶之前测试这第一。作为一个标准的指导，冷冻干燥过夜。样 ​​品仍含有水分下一次干燥。量介于2和4％是有争议的，但它。这种水分含量需要降低和由在次级干燥阶段泵送热到样品进行。这个相位是相对较短的，持续1至2小时，但对于长期生存重要。然而，随着干燥的细菌可能是有害的，以及。再次，根据您的冻干机和样品的特质，需要一个理想的时间进行二次烘干，以通过实验来确定。通常，提高搁板温度至20℃，干燥2小时。到位后抽真空，塞子用塞板/机构的小瓶中。释放真空，取出小瓶，并进一步确保橡皮塞/瓶塞带箔压密封。最好是在4℃下储存小瓶在黑暗中。测试冻干细菌存活率相比于原始培养物（见链接）。另外，通过在30，90，180 365天测试监测冷冻干燥培养物的稳定性/生存能力。一个好的协议，将产生近100％的活细胞。任何高于50％被认为是可接受的，许多实验室。脱脂牛奶会产生10-20％。然而，％冷冻干燥后存活并不像数存活以下存储一样重要。如果可行性开始以每月一个日志以上迅速下降，然后修改该协议的可能是必要的。请注意，某些菌株仅仅是非常困难的冷冻干燥，不管是什么，这些可能都死光了快速下冷冻干燥。

ผลลัพธ์ (จีน) 3:

冷冻干燥过程的现成的冻干机

打开冷冻干燥机和启动电容器。如果有使用干冰/乙醇混合物然后准备以及外部电容器。搁板可设置为4°C.

中心架上的瓶子。这个位置是非常重要的，可以均匀地按压加塞板后冷冻干燥

塞子。用手动或程序控制，冷冻样品下降到40°C.这一步应需要大约30-60分钟，是非常依赖的仪器。如果冷冻的速度是可以控制的，然后一滴每分钟1°C是一种实用率。一旦样品达到的温度，他们应该是明显的冷冻（清澈的液体变成不透明和脱脂牛奶固体

）。允许样品坐在40°C 1小时以确保完全冻结。在一个集群的中心瓶可能比外面更缓慢冷冻。

打开真空泵。在10-20分钟，真空度应在200毫乇（毫）。根据仪表，压力可能会报告在毫乇，毫巴，Pascal，或英寸汞对真空规。作为参考，100毫乇= 0。133毫巴＝13.3帕＝29.9“汞= 0.000132 ATM = 99.99%的真空。

一旦真空低于200毫乇，增加原发性干燥搁板的温度，与水有关的升华阶段。搁板的温度取决于冷冻干燥介质。蔗糖，保持架的温度在25°C.试剂18或微生物的冷冻干燥的缓冲区，搁板可高达15°C.在任何情况下，在陆架和冷凝器/冰陷阱之间的温差大，更有效的原发性干燥过程将。

如果融化的样品时，则可能需要根据经验确定的搁板温度。这样做的一个实用的方法是将一个货架上的作用的介质样品和逐步降低温度每15分钟。在一些点样品冻结。与冷阱真空的情况下，你的样品将安全仍将被冻结。这是一个实用的方法，当然不一定是最有效的原发性干燥温度，但它应该足够好的工作。

原发性干燥的冷冻干燥过程中最长的阶段。这样做是为了保持样品的冷凝汽器（或冰陷阱）但仍然足够的温度，使水迅速升华。搁板的温度可以提高到高于熔点温度只要升华过程除去热量流入样品足够快以防止熔化和样本崩溃（在矩阵上的洞穴中）。原发性干燥时间也取决于样品的体积。细菌样本，很少需要大的，通常是0.25到0。5毫升的样本数量有限（10-20）在一架机可在几小时内完成。满载干燥机几百个样本将需要更长的时间。安全，一次干燥期间，一夜之间应该工作，但测试这首当你尝试冻干大量瓶。作为一个指南，冻干

过夜。样品还含有水分的原发性干燥。量是有争议的，但它介于2和4%。这水分水平需要减少，是由抽热到样品的二次干燥阶段完成。本期相对较短，持续1～2小时，但重要的长期生存能力。然而，在干燥的细菌可以和有害。再次，基于你的冻干样品的特质，二次干燥需要实验确定的最佳时间。一般来说，提高°搁板温度20 C和干燥2小时。

在真空，塞小瓶加塞板/机构使用。释放真空，除去瓶，并进一步确保橡胶塞子/塞密封箔卷曲。最好是存储小瓶在4°C在黑暗中。

试验冻干细菌存活率较原始文化（见链接）。此外，监测冷冻稳定活性干制培养试验法，30，90，180和365天。一个很好的协议将产量近100%活细胞。50%以上的东西是由许多实验室被认为是可以接受的。脱脂牛奶产量将10-20 %。然而，%可行冷冻干燥后是不可行的存储数量同样重要。如果存活率开始迅速下降的日志或每一个月，然后修改的协议，可能是必要的。请注意，有些菌株是非常困难的冻干，不管什么，