2.4. Nested-PCR for detecting S. ag

2.4. Nested-PCR for detecting S. agalactiae DNA in red tilapia tissue
The 375 bp fragment from the 16S-23S rRNA intergene region was
amplified first with forward 5′ AGTCGTAACAAGTGAAGCCG3′ and reverse
5′C T/C A/G T/C TGCCAAGCATCCACT 3′ primers to obtain high
PCR sensitivity with the DNA obtained from fish tissue. The amplified
products were then used as a template in a second PCR reaction for
amplifying a 192 bp S. agalactiae-specific DNA fragment with forward
5′ AGGGAAACCTGCCATTTGCG 3′ and reverse 5′ CAATCTATTTCTAGATCGTGG
3′ primers (Berridge et al., 2001). A 135 bp fragment
amplified from the tilapia (O. niloticus) β-actin gene using forward
5′ CGGAATAACCACCTACGACCA 3′ and reverse 5′ ATCTCCTTCTGCATCCTGTCA
3′ primers, was used as an internal PCR control (Chang et al.,
2007).
Each PCR reaction was performed in 25 μL volume containing
2.5 mM MgCl2, 0.8 mM forward primer, 0.8 mM reverse primer,
0.15 mM of each dNTP (Promega Corp, WI, USA), 1×PCR buffer,
0.1 U/μL Taq polymerase (Tucantaq DNA polymerase, Corpogen,
Colombia), 100 ng total DNA template and up to 25 μL H2O. Optimal
amplification was obtained with initial denaturing at 94 °C×3 min,
followed by 30 cycles of denaturing at 94 °C×30 s, annealing at
58 °C (external) or 60 °C (internal)×30 s, an extension step at
72 °C×30 s followed by a final extension step at 72 °C×3 minutes. A
PxE Thermal Cycler was used for the PCR (Thermo Electron Corporation,
USA). Aliquots of amplified products were analyzed by electrophoresis
on 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide
(Agarose Sigma, USA), in 1× TBE buffer for 1 hour at 70 V. Gels were
visualized under a UV transilluminator (Spectroline, USA) and photographed.
A 100 bp DNA ladder was used as molecular weight marker
(Promega, WI, USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. Nested-PCR สำหรับการตรวจสอบ S. agalactiae DNA ในเนื้อเยื่อปลานิลแดงส่วน bp 375 จาก 16S 23S rRNA intergene ภูมิภาคได้ขยายกับ AGTCGTAACAAGTGAAGCCG3′ ที่ 5′ ไปข้างหน้า และย้อนกลับไพรเมอร์ 3′ TGCCAAGCATCCACT T/C A/G T/C 5′C รับสูงความไวของ PCR กับดีเอ็นเอที่ได้จากเนื้อเยื่อของปลา ที่เอาต์ผลิตภัณฑ์แล้วใช้เป็นแม่แบบในปฏิกิริยา PCR ที่สองสำหรับมือ 192 bp S. agalactiae เฉพาะดีเอ็นเอส่วนกับไปข้างหน้า5′ AGGGAAACCTGCCATTTGCG 3′ และ 5′ กลับ CAATCTATTTCTAGATCGTGG3′ ไพรเมอร์ (Berridge และ al., 2001) ส่วน bp 135ขยายจากยีนβ-แอกตินนิล (โอ niloticus) ที่ใช้ไป5′ CGGAATAACCACCTACGACCA 3′ และ 5′ กลับ ATCTCCTTCTGCATCCTGTCAไพรเมอร์ 3′ ถูกใช้เป็นตัวควบคุมภายในของ PCR (ช้าง et al.,2007)ทำใน μL 25 ประกอบด้วยปริมาณแต่ละปฏิกิริยา PCRMgCl2, 0.8 มม.รองพื้นไปข้างหน้า รองพื้นกลับ 0.8 mM, 2.5 mM0.15 มม.ของแต่ละ dNTP (Promega Corp, WI สหรัฐอเมริกา), 1 × PCR บัฟเฟอร์0.1 พอลิเมอเรส Taq U/μL (Tucantaq ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส Corpogenโคลัมเบีย), 100 ng รวมดีเอ็นเอต้นแบบ ถึง 25 μL H2O ดีที่สุดขยายกล่าวกับ denaturing เริ่มต้นที่ 94 ° C × 3 minตามรอบ 30 ของ denaturing ที่ 94 ° C × 30 s การอบเหนียวที่นามสกุล 58 ° C (ภายนอก) หรือ 60 ° C (ภายใน) × 30 s ขั้นตอนที่ตามขั้นตอนต่อขั้นสุดท้ายที่ 72 ° C × 3 นาที s 72 ° C × 30 Aใช้ PxE Cycler ร้อนสำหรับ PCR (เทอร์โมอิเล็กตรอน คอร์ปอเรชั่นสหรัฐอเมริกา) Aliquots เอาต์ผลิตภัณฑ์ถูกวิเคราะห์ โดย electrophoresisใน 1.5% agarose เจลสีกับโบรไมด์ ethidium(Agarose ซิก สหรัฐอเมริกา), ใน 1 × TBE บัฟเฟอร์สำหรับ 1 ชั่วโมงที่ 70 V. เจได้visualized ภายใต้ transilluminator UV (Spectroline สหรัฐอเมริกา) และถ่ายภาพมีใช้บันได 100 bp ดีเอ็นเอเป็นน้ำหนักโมเลกุลเครื่องหมาย(Promega, WI สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 PCR-ซ้อนสำหรับการตรวจสอบ S. agalactiae
ดีเอ็นเอในเนื้อเยื่อของปลานิลแดงชิ้น375 bp จาก 16S-23S rRNA ภูมิภาค intergene
ถูกขยายไปข้างหน้าครั้งแรกกับ5 'AGTCGTAACAAGTGAAGCCG3' และย้อนกลับ
5'CT / CA / GT / C TGCCAAGCATCCACT ไพรเมอร์ 3 'เพื่อ
ได้รับสูงไวPCR กับดีเอ็นเอที่ได้จากเนื้อเยื่อปลา ขยายผลิตภัณฑ์ที่ถูกนำมาใช้แล้วเป็นแม่แบบในปฏิกิริยา PCR ที่สองสำหรับการขยาย192 bp S. agalactiae ชิ้นดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงกับไปข้างหน้า5 'AGGGAAACCTGCCATTTGCG 3' และย้อนกลับ 5 'CAATCTATTTCTAGATCGTGG ไพรเมอร์ 3 (Berridge et al., 2001) ส่วน bp 135 ขยายจากปลานิล (ทุม niloticus) ยีนβ-โปรตีนโดยใช้ไปข้างหน้า5 'CGGAATAACCACCTACGACCA 3' และย้อนกลับ 5 'ATCTCCTTCTGCATCCTGTCA ไพรเมอร์ 3' ถูกนำมาใช้เป็นวิธี PCR การควบคุมภายใน (ช้าง et al., 2007). แต่ละคน ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการในปริมาณ 25 ไมโครลิตรที่มี2.5 มิลลิ MgCl2 0.8 มิลลิไพรเมอร์ไปข้างหน้า 0.8 มิลลิไพรเมอร์กลับ0.15 มิลลิของแต่ละ dNTP (Promega คอร์ป, WI, USA) 1 ×บัฟเฟอร์ PCR, 0.1 U / ไมโครลิตรโพลิเมอร์ Taq (Tucantaq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์, Corpogen, โคลอมเบีย) 100 นาโนกรัมดีเอ็นเอแม่แบบรวมถึง 25 ไมโครลิตร H2O ที่ดีที่สุดขยายได้ด้วย denaturing เริ่มต้นที่ 94 ° C × 3 นาทีตามด้วย30 รอบของ denaturing ที่ 94 ° C × 30 s, การอบที่58 ° C (ภายนอก) หรือ 60 ° C (ภายใน) × 30 วินาที, ส่วนขยาย ขั้นตอนที่72 ° C × 30 s ตามด้วยขั้นตอนการขยายสุดท้ายที่ 72 ° C × 3 นาที PXE Thermal Cycler ใช้สำหรับ PCR (เทอร์โมอิคอร์ปอเรชั่นสหรัฐอเมริกา) aliquots ของผลิตภัณฑ์ขยายวิเคราะห์ electrophoresis บน 1.5% agarose เจลย้อมด้วย ethidium bromide (Agarose ซิกสหรัฐอเมริกา) ใน 1 ×บัฟเฟอร์ TBE 1 ชั่วโมงที่ 70 โวลต์เจลถูกมองเห็นภายใต้แสงยูวีtransilluminator (Spectroline สหรัฐอเมริกา) และถ่ายภาพ . บันไดดีเอ็นเอ bp 100 ถูกใช้เป็นเครื่องหมายที่มีน้ำหนักโมเลกุล(Promega, WI, สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

The park.The park.The park.The park.The park.