2.2. Production and purification of

2.2. Production and purification of reuterin
The reuterin-producing L. reuteri was subcultured anaerobically
(AnaeroGen™,OxoidLtd.,Basingstoke,Hampshire,UK)inMRSbroth
(Biolife) at 37?C for 18 h before use in experiments. The bacterial
strain was inoculated in 2-L MRS broth flasks and incubated for 18 h
at 37
?C under anaerobic conditions. Cells were harvested by
centrifugation at 4500e5000 ? g for 5 min and washed once with
sterile glycerol solution (100 mM). The pellet was resuspended in a
totalvolumeof500mlof100mMglycerolsolutionandincubatedfor
3 h at 37?C under anaerobic conditions. Cells were removed by
centrifugation at 6000 ? g for 5 min and the supernatant was
transferredintonewflasksandfrozenat?20?Cuntilitspurification.
Reuterin
purification
was
performed
using
the
method
described by Vollenweider et al. (2003) with some changes. Briefly,
250 ml of the solution containing reuterin were frozen under
rotation in a MeOH bath (?30?C) and lyophilized for 16e20 h. To
eliminate the orange-colored impurities, the viscous liquid was
resuspended with 40 ml of acetone (Merck, Darmstadt, Germany),
mixed with 10 g of silica gel 60 (Merck), evaporated and poured in a
glass Buchner funnel with fritted disc containing 5 g of silica gel 60.
The reuterin was eluted with acetone:ethyl acetate (2:1) in 100 ml
glass flasks and detected using the colorimetric method described
by Rahn and Schlenk (1973) for detection of aldehydes. Eluted
fractions containing reuterin were concentrated under reduced
pressure, loaded on a silica gel 60 column and eluted with aceto-
ne:ethyl acetate (2:1), using a CombiFlash RF4x chromatography
system (Teledyne Isco, Inc., Massachusetts, USA) and a flow rate of
5 ml/min. Fractions with the aldehyde indicated by the colorimetric
method cited above were combined and evaporated under reduce
pressure and dried in a vacuum system to remove last traces of
solvents.
The purity of reuterin in samples was assessed by high resolu-
tion electrospray ionization mass spectrometry (HRESIMS) per-
formed on a Bruker maXis QTOF spectrometer, and Nuclear
Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy acquired on a Bruker
AVANCE III 500-MHz NMR spectrometer equipped a with a 1.7 mm
TCI cryoprobe. The mass spectrometer was operated in positive ESI
mode. The instrumental parameters were: 4 kV capillarity voltage,
drying gas flow of 1 L/min at 200?C, nebulizer pressure at 2.8 bars.
TFA-Na cluster ions were used for mass calibration of the instru-
ment prior tosamples injection. Pre-run calibrationwas by infusion
with the same TFA-Nacalibrant. NMR spectra (500 and 125 MHz for
1H and13C NMR, respectively) were recorded in CD3OD, using the
signals of the residual solvent as internal references (dH3.31 and dC
49.0 ppm). The purified reuterinwithout contaminants was diluted
in sterile distilled water to about 100 mg/ml solution and stored at
?40?C until use.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. Production and purification of reuterinThe reuterin-producing L. reuteri was subcultured anaerobically(AnaeroGen™,OxoidLtd.,Basingstoke,Hampshire,UK)inMRSbroth(Biolife) at 37?C for 18 h before use in experiments. The bacterialstrain was inoculated in 2-L MRS broth flasks and incubated for 18 hat 37?C under anaerobic conditions. Cells were harvested bycentrifugation at 4500e5000 ? g for 5 min and washed once withsterile glycerol solution (100 mM). The pellet was resuspended in atotalvolumeof500mlof100mMglycerolsolutionandincubatedfor3 h at 37?C under anaerobic conditions. Cells were removed bycentrifugation at 6000 ? g for 5 min and the supernatant wastransferredintonewflasksandfrozenat?20?Cuntilitspurification.Reuterinpurificationwasperformedusingthemethoddescribed by Vollenweider et al. (2003) with some changes. Briefly,250 ml of the solution containing reuterin were frozen underrotation in a MeOH bath (?30?C) and lyophilized for 16e20 h. Toeliminate the orange-colored impurities, the viscous liquid wasresuspended with 40 ml of acetone (Merck, Darmstadt, Germany),mixed with 10 g of silica gel 60 (Merck), evaporated and poured in aglass Buchner funnel with fritted disc containing 5 g of silica gel 60.The reuterin was eluted with acetone:ethyl acetate (2:1) in 100 mlglass flasks and detected using the colorimetric method describedby Rahn and Schlenk (1973) for detection of aldehydes. Elutedเศษส่วนที่ประกอบด้วย reuterin มีความเข้มข้นลดลงต่ำกว่าความดัน โหลดบนคอลัมน์เจล 60 และ eluted กับ aceto-ne:ethyl acetate (2:1), ใช้ chromatography CombiFlash RF4xระบบ (Teledyne Isco, Inc. รัฐแมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา) และอัตราการไหลของ5 ml/นาที เศษกับแอลดีไฮด์ที่ระบุ โดยการเทียบเคียงวิธีอ้างถึงข้างต้นรวม และหายไปภายใต้ลดความดัน และแห้งในระบบสูญญากาศเพื่อลบร่องรอยสุดท้ายของหรือสารทำละลายความบริสุทธิ์ของ reuterin ในตัวอย่างถูกประเมิน โดยสูง resolu-สเตรชันวิธีพ่นละอองไฟฟ้า ionization โตรเมทรี (HRESIMS) ต่อ-สเปกโตรมิเตอร์ QTOF เรา Bruker และนิวเคลียร์ที่เกิดขึ้นกแม่เหล็กสั่นพ้อง (NMR) มาในแบบ Brukerสเปกโตรมิเตอร์ในการ NMR 500 MHz AVANCE III พร้อมกับกับ 1.7 mmCryoprobe TCI สเปกโตรมิเตอร์จำนวนมากถูกดำเนินการใน ESI บวกโหมดการ มีพารามิเตอร์บรรเลง: 4 kV แรง capillarityการอบแก๊สไหล 1 L/นาที 200 C ดันฝอยละอองที่ 2.8 บาร์ใช้สำหรับสอบเทียบมวล instru-นา TFA คลัสเตอร์กันติดขัด tosamples ก่อนฉีด Calibrationwas รันก่อน โดยคอนกรีตมีเดียว TFA-Nacalibrant NMR แรมสเป็คตรา (500 และ 125 MHz สำหรับ1 H and13C NMR ตามลำดับ) ได้รับการบันทึกใน CD3OD ใช้การสัญญาณของตัวทำละลายที่เหลือเป็นการอ้างอิงภายใน (dH3.31 และ dC49.0 ppm) ถูกทำให้เจือจางสารปนเปื้อน reuterinwithout บริสุทธิ์ในกอซกลั่นน้ำเกี่ยวกับ 100 mg/ml และเก็บไว้ที่?40?C until use.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 การผลิตและการทำให้บริสุทธิ์ของ reuterin
reuterin ผลิต L. reuteri ถูกเลี้ยงแบบไม่ใช้อากาศ
(AnaeroGen ™, OxoidLtd. เบซิงนิวแฮมป์เชียร์สหราชอาณาจักร) inMRSbroth
(BioLife) ที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 18 ชั่วโมงก่อนที่จะใช้ในการทดลอง แบคทีเรียสายพันธุ์ที่ได้รับเชื้อใน MRS-L 2 ขวดน้ำซุปและบ่มเป็นเวลา 18 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ37 องศาเซลเซียสภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจน เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 4500e5000? กรัมเป็นเวลา 5 นาทีและล้างครั้งเดียวกับการแก้ปัญหาการฆ่าเชื้อกลีเซอรอล(100 มิลลิเมตร) เม็ดถูก resuspended ในtotalvolumeof500mlof100mMglycerolsolutionandincubatedfor 3 ชั่วโมงที่ 37 องศาเซลเซียสภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจน เซลล์ที่ถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 6000 กรัมเป็นเวลา 5 นาทีและใส โดย Vollenweider et al, (2003) ที่มีการเปลี่ยนแปลงบางอย่าง สั้น ๆ , 250 มล. ของการแก้ปัญหาที่มี reuterin ที่ถูกแช่แข็งภายใต้การหมุนในอ่างเมธานอล(? 30? C) และแห้งสำหรับ 16e20 ชั่วโมง เพื่อขจัดสิ่งสกปรกสีส้มที่เป็นของเหลวข้นหนืดได้resuspended 40 มล. ของอะซิโตน (เมอร์ค, ดาร์มสตัด, เยอรมนี) ผสมกับ 10 กรัมของซิลิกาเจล 60 (เมอร์ค) ระเหยและเทในช่องกระจกBuchner กับแผ่นดิสก์ fritted มี 5 กรัมของซิลิกาเจล 60 reuterin ถูกชะด้วยอะซิโตน: เอทิลอะซิเตท (2: 1) 100 มล. ขวดแก้วและตรวจพบโดยใช้วิธีการสีที่อธิบายไว้โดย Rahn และ Schlenk (1973) สำหรับการตรวจสอบของลดีไฮด์ ชะเศษส่วนที่มี reuterin มีความเข้มข้นลดลงภายใต้ความดันโหลดบนซิลิกาเจล60 คอลัมน์และชะ aceto- กับภาคตะวันออกเฉียงเหนือ: เอทิลอะซิเตท (2: 1) โดยใช้โค RF4x CombiFlash ระบบ (Teledyne Isco, Inc, Massachusetts, USA) และ อัตราการไหลของ5 มล. / นาที เศษส่วนกับลดีไฮด์ที่ระบุโดยสีวิธีการดังกล่าวข้างต้นได้รวมและระเหยภายใต้การลดความดันและแห้งในระบบสูญญากาศที่จะลบร่องรอยสุดท้ายของตัวทำละลาย. ความบริสุทธิ์ของ reuterin ในตัวอย่างได้รับการประเมินจากความละเอียดสูงการelectrospray ไอออนไนซ์มวลสาร (HRESIMS ) ละที่เกิดขึ้นในสเปกโตรมิเตอร์Bruker Maxis QTOF และนิวเคลียร์ด้วยคลื่นสนามแม่เหล็ก(NMR) สเปกโทรสโกที่ได้มาใน Bruker AVANCE III 500 MHz สเปกโตรมิเตอร์ NMR การติดตั้งที่มี 1.7 มมTCI cryoprobe สเปกโตรมิเตอร์มวลได้รับการดำเนินการในเชิงบวก ESI โหมด พารามิเตอร์ที่มีประโยชน์คือ 4 กิโลโวลต์แรงดันไฟฟ้าฝอย, การไหลของก๊าซแห้ง 1 ลิตร / นาทีที่ 200 องศาเซลเซียสความดัน nebulizer ที่ 2.8 บาร์?. TFA นาไอออนกลุ่มถูกนำมาใช้สำหรับการสอบเทียบมวลของตราสารment ก่อนฉีด tosamples calibrationwas ทำงานก่อนโดยฉีดแบบเดียวกับที่TFA-Nacalibrant NMR สเปกตรัม (500 และ 125 MHz สำหรับ1H NMR and13C ตามลำดับ) ถูกบันทึกไว้ใน CD3OD โดยใช้สัญญาณของตัวทำละลายที่เหลือเป็นข้อมูลอ้างอิงภายใน(dH3.31 และ DC 49.0 ppm) สารปนเปื้อน reuterinwithout บริสุทธิ์ถูกเจือจางในน้ำกลั่นปลอดเชื้อประมาณ100 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรวิธีการแก้ปัญหาและเก็บไว้ที่40 องศาเซลเซียสจนการใช้งาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . การผลิตและการทำให้บริสุทธิ์ของรูเทอริน
รูเทอรินการผลิต รัฐฟลอริดา เป็น subcultured พ
( anaerogen ™ oxoidltd , , Basingstoke Hampshire , UK ) inmrsbroth
( biolife ) ที่ 37 C เป็นเวลา 18 ชั่วโมง ก่อนใช้ ในการทดลอง เชื้อแบคทีเรีย
เมื่อยเป็นเชื้อในขวด 2-l MRS broth บ่มที่ 37 18 H

? C ภายใต้เงื่อนไขแบบไม่ใช้ออกซิเจน เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดย
3 ที่ 4500e5000 ?กรัมเป็นเวลา 5 นาที และล้างด้วยสารละลายกลีเซอรอล
เมื่อเป็นหมัน ( 100 มม. ) เม็ดเป็น resuspended ใน totalvolumeof500mlof100mmglycerolsolutionandincubatedfor

3 H ที่ 37 C ภายใต้เงื่อนไขแบบไม่ใช้ออกซิเจน เซลล์ที่ถูกกำจัดโดย
3 6 , 000 ? กรัมเป็นเวลา 5 นาทีและนำอยู่
transferredintonewflasksandfrozenat ? 20 cuntilitspurification .



เป็นรูเทอรินบริสุทธิ์ )



วิธีใช้อธิบายโดย vollenweider et al . ( 2003 ) กับการเปลี่ยนแปลงบางอย่าง สั้น ๆ ,
ของสารละลายที่มีรูเทอริน 250 ml ถูกแช่แข็งภายใต้
การหมุนในปริมาณนํ้า ( ? 30 ? c ) และแห้งสำหรับ 16e20 H .

ตัดสีส้มสิ่งสกปรกของเหลวหนืดถูก
resuspended 40 มิลลิลิตรของอะซิโตน ( เมอร์คดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี ) ,
10 กรัม ผสมกับซิลิกาเจล 60 ( Merck ) , น้ำตาลและเทลงใน
แก้วกรวยกรองบุชเนอร์กับ fritted แผ่นดิสก์บรรจุ 5 กรัมของซิลิกาเจล 60 .
รูเทอรินเป็นตัวอย่างกับอะซิโตน : ethyl acetate ( 2 : 1 ) 100 ml
แก้ว flasks และตรวจพบการใช้วิธีวัดสีอธิบาย
โดยร้าน schlenk ( 1973 ) และการตรวจหาอัลดีไฮด์ .
ตัวอย่างเศษส่วนที่มีรูเทอรินมีความเข้มข้นลดลง
ภายใต้ความดัน โหลดบนซิลิกาเจล 60 คอลัมน์และตัวอย่างกับ aceto -
ne :เอทิลอะซิเตท ( 2 : 1 ) , ใช้ combiflash rf4x โครม
ระบบ ( teledyne isco , อิงค์ , Massachusetts , USA ) และอัตราการไหลของ
5 มล. / นาที เศษส่วน กับเวลาที่ระบุโดยวิธี Colorimetric
อ้างข้างต้นได้รวมและระเหยภายใต้ความดันลด
และแห้งในระบบสุญญากาศเพื่อลบร่องรอยของการล่าสุด

ของตัวทำละลายบริสุทธิ์รูเทอริน ในตัวอย่างคือการประเมินโดย resolu
- สูงtion วิธีพ่นละอองไฟฟ้าไอแมสสเปกโทรเมทรี ( hresims ) ต่อ -
ขึ้นบนแผ่นดิน qtof BRUKER Maxis และนิวเคลียร์แมกเนติกเรโซแนนซ์สเปกโทรสโกปี ( NMR )

ได้มาในบรุคเกอร์วนซ์ 3 500 MHz NMR สเปคโตรมิเตอร์ติดตั้งกับ 1.7 mm
สบท cryoprobe . สเปกโตรมิเตอร์มวล ดำเนินการในโหมด ESI
บวก พารามิเตอร์เครื่องมือ : 4 แรงดันแคพิลลารีกิโล
การอบแห้ง อัตราการไหลของแก๊ส 1 ลิตร / นาที ที่ 200 หรือเปล่า C , nebulizer ความดันที่ 2.8 แถบ
กรดไขมันกลุ่มไอออนนา ใช้สำหรับสอบเทียบมวลของชุดอุปกรณ์ --
tosamples ment ก่อนฉีด ก่อนวิ่ง calibrationwas โดยแช่
กับ nacalibrant ในระดับเดียวกัน NMR สเปกตรัม ( 500 และ 125 MHz สำหรับ
1 and13c NMR , ตามลำดับ ) ได้ถูกบันทึกไว้ใน cd3od โดยใช้สัญญาณของตัวทำละลายตกค้างเป็น

dh3.31 และ DC ( อ้างอิงภายใน49.0 ppm ) และ reuterinwithout สารปนเปื้อนเจือจาง
ในหมันน้ำกลั่นประมาณ 100 mg / ml และโซลูชั่นเก็บไว้ที่
? 40 ? C
จนใช้