2.1. Bacterial isolatesA total of 1

2.1. Bacterial isolates
A total of 108 V. parahaemolyticus isolates recovered from 2007 to
2011 were included in this study. Among these isolates, 96 were
recovered from clinical cases and 12 from seafood products. Samples
were pre-enriched in the Alkaline Peptone Water medium (APW)
containing 3.5% NaCL at 37 °C overnight before inoculating to the
thiosulfate citrate bile-salts sucrose (TCBS) agar. Those green shiny
colonies from TCBS were selected for next identification using the
oxidize test, triple sugar iron agar (TSI) reaction and serotyped by
slide agglutination with a V. parahaemolyticus antiserum (Denka Seiken,
Tokyo, Japan).
2.2. Ethics statement
All these 96 clinical samples were stool samples and collected by the
nurse in the sentinel hospitals assigned by the foodborne disease
surveillance project of Guangdong Province. All samples used in this
study were anonymized and received the approval from the Institution-
al Review Board of Centre for Disease Control and Prevention of Guang-
dong Province.
2.3. Chromosomal DNA preparation
DNA was extracted from bacterial isolates using the QIAamp DNA
Mini kit according to the manufacturer's instructions (Qiagen, Inc.,
Shanghai, China). DNA extracts were dissolved in Tris–EDTA (10 mM
Tris–HCl, 0.10 mM EDTA [pH 8.0]) buffer and stored at 4 °C. Dilutions
of template DNA were made with sterile distilled water to obtain a
final concentration of approximately 100 ng/mL.
2.4. Detection of toxin genes
A multiplex PCR assay was performed to determine the presence of
tdh and trh. PCR was performed using a thermal cycler (Biometra, Inc.,
Biometra TGradient, Göttingen, Germany.) with the previously
published primers (Bej et al., 1999). Target sequences were amplified
after an initial denaturation at 94 °C for 3 min, with 25 cycles consisting
of 94 °C for 40 s, 60 °C for 40 s, and 72 °C for 40 s and a final extension
step of 72 °C for 4 min. Amplified products were separated on a 1% aga-
rose gel, stained with 1% ethidium bromide, and imaged using a Gel Doc
EQ system (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA).
2.5. MLST
A seven-locus MLST system described previously (Gonzalez-Escalona
et al., 2008) was used to genotype the isolates. The dnaE (DNA polymer-
ase III, α subunit), gyrB (DNA gyrase, subunit B), recA (recombinase A),
dtdS (threonine 3-dehydrogenase), pntA (transhydrogenase, α subunit),
pryC (dihydro-orotase) and tnaA (tryptophanase) genes were analyzed
as previously described. Primer sequences and conditions for PCR
amplification are available at http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/
info/protocol.html. PCR products were purified using a QIAquick PCR
Purification kit as described by the manufacturer (Qiagen). Cycle
sequencing was carried for both DNA strands of the amplified targets
using M13 universal primers and BigDye chemistry (Perkin Elmer Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA), with an initial denaturation of 96 °C for
1 min, followed by 25 cycles of denaturation at 96 °C for 10 s, primer
annealing at 50 °C for 5 s, and extension at 72 °C for 4 min. Sequence
data were analyzed using ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Perkin
Elmer Applied Biosystems). Alignment of sequences was performed
using DNAStar (version V7.10). Numbers for alleles and sequence types
(STs) were assigned according to the PubMLST V. parahaemolyticus
database.
2.6. Assignment to clonal complexes
The program eBURST v3.0 was used to identify the different clonal
complexes (http://eburst.mlst.net). The most restrictive group definition
was used to define the clonal complexes, i.e., at least six of the seven
alleles had to be identical to be included in the same group or clonal
complex (Feil et al., 2004). The statistical confidences for the ancestral
types were assessed using 1000 bootstrap resamplings. Two different
STs are considered single-locus variant (SLV) when they differ from
each other at a single locus. Double-locus variants (DLVs) refer to two
STs differing in only two of the seven loci.
2.7. Test for recombination
The START (version 2.0) software package was used to calculate
the “standardized” index of association (IAS) (Haubold and Hudson,
2000). This statistical method tests for the null hypothesis of
linkage equilibrium; i.e., if IAS = 0, then alleles are independently
distributed at all loci analyzed (alleles are in linkage equilibrium)
and recombination has occurred frequently. The ratio between
the numbers of synonymous (dS) and nonsynonymous (dN) substi-
tutions was calculated by the method of Nei–Gojobori implemented
in START. This measures the type of selection occurring at each
locus. The hypothesis tested was for neutrality (dN = dS); if dN/
dS b 1, then nonsynonymous, sites are under selective constraint
or purifying pressure (negative selection); dN/dS N 1 indicates
positive selection, and dN/dS = 1 indicates neutrality.
3. Results
Fifteen serotypes were identified among the 108 isolates, domi-
nated by O3:K6 (n = 52; 48%), O4:K8 (n = 20; 18%) and O1:KUT
(n = 12; 11%). Only four isolates (two O4:K8 and two O1:KUT)
from seafood products expressed one of these serotypes. Ninety-
three of the clinical but only two of the seafood product isolates
were tdh positive. However, none of the isolates carried the trh
gene (Table 1).
The numbers of alleles observed for each MLST locus were distributed
as follows: 16 (dnaE), 19 (gyrB), 20 (recA), 17 (dtdS), 14 (pntA), 19 (pyrC)
and 18 (tnaA). The number of polymorphic sites observed varied per locus
from 17 (pntA) to 50 (recA). The nucleotide diversity ranged from 0.010 to
0.025, with the highest degree of diversity and percentage of polymorphic
sites observed for dtdS (0.025, 6.77%) and recA (0.022, 6.86%). The ratio of
nonsynonymous to synonymous substitutions (dN/dS) was lower than 1
for each locus analyzed using a selection test for neutrality (Table 2).
Thirty-one different STs were identified and 17 STs were novel
to this study. ST-3 was the most abundant type (53 out of 108 isolates);
isolates with this ST were found in three different serotypes (O3:K6,
n = 47, O1:KUT, n = 5 and O4:K68, n = 1). Eight additional STs were
represented by more than one isolate including ST-189 (n = 8; all
O4:K8), ST-265 (n = 6; all O4:K8), ST-345 (n = 6; all O4:K8), ST-199
(n = 4; all O1:KUT), ST-337 (n = 3; all O4:K34), ST-8 (n = 2; O1:KUT
and O1:K56), ST-492 (n = 2; both O3:K6) and ST-787 (n = 2; both
O4:K68).
eBURST analysis revealed four clonal complexes (CC3, CC345, CC120
and CC8), and 20 singletons (Fig. 1). CC3 consisted of 58 isolates from
five STs [ST-3, founder; ST-431, SLV (gyrB); ST-435, SLV (recA); ST-
661, SLV (pntA); and ST-787, SLV (pyrC)] and three serovars (O3:K6,
O1: KUT and O4:K68). The ST-3 O3:K6 pandemic clone is located within
CC3. CC8 consists of two STs (ST-8 and ST-783) differing at the pyrC

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.1. Bacterial isolatesA total of 108 V. parahaemolyticus isolates recovered from 2007 to2011 were included in this study. Among these isolates, 96 wererecovered from clinical cases and 12 from seafood products. Sampleswere pre-enriched in the Alkaline Peptone Water medium (APW)containing 3.5% NaCL at 37 °C overnight before inoculating to thethiosulfate citrate bile-salts sucrose (TCBS) agar. Those green shinycolonies from TCBS were selected for next identification using theoxidize test, triple sugar iron agar (TSI) reaction and serotyped byslide agglutination with a V. parahaemolyticus antiserum (Denka Seiken,Tokyo, Japan).2.2. Ethics statementAll these 96 clinical samples were stool samples and collected by thenurse in the sentinel hospitals assigned by the foodborne diseasesurveillance project of Guangdong Province. All samples used in thisstudy were anonymized and received the approval from the Institution-al Review Board of Centre for Disease Control and Prevention of Guang-dong Province.2.3. Chromosomal DNA preparationDNA was extracted from bacterial isolates using the QIAamp DNAMini kit according to the manufacturer's instructions (Qiagen, Inc.,Shanghai, China). DNA extracts were dissolved in Tris–EDTA (10 mMTris–HCl, 0.10 mM EDTA [pH 8.0]) buffer and stored at 4 °C. Dilutionsof template DNA were made with sterile distilled water to obtain afinal concentration of approximately 100 ng/mL.2.4 การตรวจยีนสารพิษทำการตรวจสอบสถานะของการ multiplex PCR assaytdh และ trh ทำ PCR ใช้ cycler ความร้อน (Biometra, Inc.Biometra TGradient, Göttingen เยอรมนี) กับก่อนหน้านี้เผยแพร่ไพรเมอร์ (Bej et al., 1999) มีขยายเป้าหมายลำดับหลังจากการ denaturation เริ่มต้นที่ 94 ° C สำหรับ 3 นาที กับรอบที่ 25 ประกอบด้วยของ 94 ° C สำหรับ 40 s, 60 ° C สำหรับ 40 s และ 72 ° C สำหรับ 40 s และนามสกุลเป็นขั้นสุดท้ายขั้นตอนของ 72 ° C ต่ำสุด 4 Amplified ผลิตภัณฑ์ถูกแยกจากกันในตู้ 1% เป็น-กุหลาบ สีกับโบรไมด์ ethidium 1% และใช้เอกสารที่เจ imagedระบบ EQ (Bio Rad Inc. เฮอร์คิวลิส CA, USA)2.5. MLSTโลกัสโพลเจ็ด MLST ระบบอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Gonzalez Escalonaร้อยเอ็ด al., 2008) ได้ใช้ลักษณะทางพันธุกรรมแยก DnaE (ดีเอ็นเอพอลิเมอร์-ase III ย่อยด้วยกองทัพ), gyrB (DNA gyrase ย่อย B), recA (recombinase A),dtdS (ทรีโอนีน 3-dehydrogenase) pntA (transhydrogenase ด้วยกองทัพย่อย),วิเคราะห์ยีน tnaA (tryptophanase) และ pryC (dihydro-orotase)อธิบายว่า ก่อนหน้านี้ ลำดับรองพื้นและเงื่อนไขสำหรับ PCRขยายได้ที่ http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/info/protocol.html ผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์โดยใช้ QIAquick PCRชุดฟอกตามที่อธิบายไว้ โดยผู้ผลิต (Qiagen) วงจรลำดับถูกดำเนินการสำหรับทั้งสอง strands ดีเอ็นเอของเป้าหมายเอาต์ใช้ไพรเมอร์สากล M13 และเคมี BigDye (เพอร์เอลเมอใช้Biosystems ฟอสเตอร์ซิตี้ CA, USA), กับการ denaturation เริ่มต้นของ 96 ° C สำหรับ1 min, followed by 25 cycles of denaturation at 96 °C for 10 s, primerannealing at 50 °C for 5 s, and extension at 72 °C for 4 min. Sequencedata were analyzed using ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (PerkinElmer Applied Biosystems). Alignment of sequences was performedusing DNAStar (version V7.10). Numbers for alleles and sequence types(STs) were assigned according to the PubMLST V. parahaemolyticusdatabase.2.6. Assignment to clonal complexesThe program eBURST v3.0 was used to identify the different clonalcomplexes (http://eburst.mlst.net). The most restrictive group definitionwas used to define the clonal complexes, i.e., at least six of the sevenalleles had to be identical to be included in the same group or clonalcomplex (Feil et al., 2004). The statistical confidences for the ancestraltypes were assessed using 1000 bootstrap resamplings. Two differentSTs are considered single-locus variant (SLV) when they differ fromeach other at a single locus. Double-locus variants (DLVs) refer to twoSTs differing in only two of the seven loci.2.7. Test for recombinationThe START (version 2.0) software package was used to calculatethe “standardized” index of association (IAS) (Haubold and Hudson,2000). This statistical method tests for the null hypothesis oflinkage equilibrium; i.e., if IAS = 0, then alleles are independentlydistributed at all loci analyzed (alleles are in linkage equilibrium)และเกิด recombination บ่อย อัตราส่วนระหว่างจำนวนพ้อง (dS) และ nonsynonymous (dN) substi-คำนวณ โดยวิธีของ Nei – Gojobori ใช้ tutionsในการเริ่มต้น นี้มาตรการเลือกที่เกิดขึ้นในแต่ละชนิดโลกัสโพล สมมติฐานที่ทดสอบมีความเป็นกลาง (dN = dS); ถ้า dN /dS b 1 แล้ว nonsynonymous เว็บไซต์อยู่ภายใต้ข้อจำกัดมาตรการหรือบริสุทธิ์ความดัน (ลบตัวเลือก), dN/dS N 1 ระบุเลือกค่าบวก และ dN/dS = 1 บ่งชี้ว่า ความเป็นกลาง3. ผลลัพธ์Serotypes 15 ได้ระบุแบบ 108 ล domi-nated โดย O3:K6 (n = 52, 48), O4:K8 (n = 20; 18%) และ O1:KUT(n = 12; 11%) เพียงสี่แยก (O4:K8 สองและ O1:KUT สอง)จากทะเล ผลิตภัณฑ์แสดง serotypes เหล่านี้อย่างใดอย่างหนึ่ง 90-สามทางคลินิกแต่เพียงสองแยกผลิตภัณฑ์อาหารทะเลมี tdh บวก อย่างไรก็ตาม ไม่มีการแยกดำเนินการ trhยีน (ตาราง 1)มีกระจายจำนวน alleles ที่สังเกตในแต่ละโลกัสโพล MLSTดังนี้: 16 (dnaE), 19 (gyrB), 20 (recA), 17 (dtdS), 14 (pntA) 19 (pyrC)และ 18 (tnaA) จำนวนไซต์ polymorphic สังเกตแตกต่างกันสำหรับแต่ละโลกัสโพลจาก 17 (pntA) กับ 50 (recA) ความหลากหลายของนิวคลีโอไทด์มา 0.010 เพื่อ0.025 ระดับสูงสุดของความหลากหลายและเปอร์เซ็นต์ของ polymorphicอเมริกาสังเกตสำหรับ dtdS (0.025, 6.77%) และ recA (0.022, 6.86%) อัตราส่วนของnonsynonymous ไปพ้องแทน (dN/dS) ไม่ต่ำกว่า 1ในแต่ละโลกัสโพลวิเคราะห์โดยใช้การทดสอบตัวเลือกสำหรับความเป็นกลาง (ตารางที่ 2)สามสิบหนึ่งระบุอื่น STs และ 17 STs มีนวนิยายการศึกษานี้ เซนต์-3 ถูกชนิดอุดมสมบูรณ์ที่สุด (53 ของ 108 แยกได้);แยกกับเซนต์นี้พบใน serotypes ต่าง ๆ สาม (O3:K6n = 47, O1:KUT, n = 5 และ O4:K68, n = 1) STs แปดเพิ่มเติมได้แสดง โดยแยกหนึ่งรวมถึงเซนต์-189 (n = 8 ทั้งหมดO4:K8), เซนต์-265 (n = O4:K8 6 ทั้งหมด), เซนต์-345 (n = 6 ทั้งหมด O4:K8), เซนต์-199(n = 4 ทั้งหมด O1:KUT), เซนต์-337 (n = 3 ทั้งหมด O4:K34), เซนต์-8 (n = 2 O1:KUTและ O1:K56), เซนต์-492 (n = 2 ทั้งสอง O3:K6) และ 787 ดรีมเซนต์ (n = 2 ทั้งสองO4:K68)eBURST วิเคราะห์เปิดเผย 4 clonal คอมเพล็กซ์ (CC3, CC345, CC120และ CC8), และ 20 singletons (Fig. 1) CC3 ประกอบด้วย 58 แยกจากSTs ห้า [เซนต์-3 ผู้ก่อตั้ง เซนต์-431 เอสแอลวี (gyrB); เซนต์-435 เอสแอลวี (recA); เซนต์-661 เอสแอลวี (pntA); และ ST-787 ดรีม เอสแอลวี (pyrC)] และสาม serovars (O3:K6O1: กุดและ O4:K68) โคลนระบาด 3 เซนต์ O3:K6 อยู่ภายในCC3 CC8 ประกอบด้วยสอง STs (8 เซนต์และเซนต์ 783) แตกต่างกันที่การ pyrC