Materials & methods2.1. Study popul

Materials & methods
2.1. Study population

The study area and subjects have been previously described and extensively characterized (Nambunmee et al., 2010 and Ruangyuttikarn et al., 2013). Briefly, the study participants consisted of 169 residents living in Mae Ku, Phra Thad Padang, and Mae Tao, known polluted areas of Mae Sot, and 100 participants living the Mae Kasa subdistrict, a non-contaminated area of Mae Sot (Simmons et al., 2005). These areas are all rural, with similar socioeconomic environments. Subjects from polluted areas aged ≥40 years and with urinary Cd levels ≥5 μg/g creatinine in the 2007 survey were included in this study (Nambunmee et al., 2010). Exposed residents were 5-year age-matched to residents from the Mae Kasa subdistrict. Each participant was consented and interviewed by trained nurses. The research ethical committee of the Faculty of Medicine, Chiang Mai University approved this study. (Approval No. 004/2012).

2.2. Sample collection and processing

Twenty-five mL of morning urine was collected from each participant in Cd-free polyethylene containers and stored at −20 °C. Fasting venous whole blood with EDTA and urine samples were frozen and transported on dry ice to the University of Michigan for DNA extraction and Cd measurements.

2.3. Urinary cadmium measurement

A refractometer determined specific gravity of each sample (PAL-10S, Atago Inc.). UCd was measured at the Michigan Department of Community Health as part of the U.S. Centers for Disease Control (CDC) Laboratory Response Network Program. Briefly, urine samples were diluted 1:10 with a diluent composed of 2.0% nitric acid, internal standards and 0.05% Triton X; and Cd concentrations were determined using ICP-MS (DRCII, PerkinElmer, USA). The analytical accuracy using QMEQAS08U urinary standard reference material (Institut national de santé publique du Québec, INSPQ) was 101.1% (n = 8). All samples were above the analytical detection limit of 0.15 μg/L.

2.4. DNA preparation

DNA was extracted from 300 μL of whole blood using the QiaAMP DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). DNA concentration was quantified using the Nanodrop (ThermoScientific, Wayne, MI, USA), and stored at −20 °C. Sodium bisulfite modification was performed on 500 ng of genomic DNA using the EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) according to the manufacturer's protocol.

2.5. DNA methylation

Methylation assays for MT2A, DNMT3B and MGMT, were designed using PyroMark Assay Design 2.0. LINE-1 methylation was measured using a previously published assay ( Yang et al., 2004). Bisulfite singleplex PCR amplification was performed using FastStart Taq Polymerase (Roche Diagnostics, Indiana, USA) with primer concentrations of 0.2 mM and 10 ng/μL of bisulfite-converted DNA. Fifteen microliters of PCR product was combined with sequencing primer and methylation analysis was conducted using the Pyromark™ MD System (Biotage) according to manufacturer's protocol (PyroGold reagents). Four bisulfite and four pyrosequencing controls were generated by mixing unmethylated and methylated control DNA (genomic: EpigenDX; bisulfite-converted: Epitect) to obtain controls with 0%, 30%, 60% and 100% methylation. Each sample plate was run with all controls. If methylation values of controls were incorrect, all samples on plate were re-run. Measurement of all samples for every methylation marker was not possible due to insufficient quantity of extracted DNA.

2.6. Statistical analysis

Correlations between creatinine (Cr)-adjusted, specific gravity (SG)-adjusted and unadjusted values were calculated using the Spearman method. UCd levels were adjusted by specific gravity to account for all dilution-related variation (Suwazono et al., 2005). Urinary markers were standardized to the median specific gravity of the control population with the following formula: Cc = C[(1.017 - 1)/SG - 1)], where Cc is the SG-corrected UCd, C is the observed Cd level, 1.017 is the median SG of the unexposed population, and SG is the specific gravity of the individual's urine sample ( Meeker et al., 2009). Chi-squared and Mann–Whitney tests were used to compare exposed and unexposed populations. Statistical significance was defined when p < 0.05.

Linear regression models were used to determine the associations between UCd and each methylation marker. Methylation changes were standardized to an interquartile range (IQR) increase in UCd levels. Methylation units were in 1% increments. Due to departures from normality, UCd and all methylation markers were log-transformed for regression analysis. Models were interpreted as percent increases in predictor associated with percent changes in outcome. Age, smoking status and occupation were associated with UCd levels and included as covariates. Because methylation was measured in white blood cell DNA, all models were re-run adjusting for white blood cell count. There were no differences in results, and white blood cell count was not included in

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ2.1 การศึกษาประชากรพื้นที่ศึกษาและหัวข้อที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ และลักษณะ (Nambunmee et al., 2010 และ Ruangyuttikarn et al., 2013) อย่างกว้างขวาง สั้น ๆ ประกอบด้วยผู้เข้าร่วมศึกษา 169 อาศัยอยู่ในแม่ Ku พระธาตุปา และแม่ เต่า แม่สอด เสียพื้นที่ที่รู้จักกัน และร่วม 100 ชีวิต Kasa แม่ subdistrict ไม่ปนเปื้อนพื้นที่แม่สอด (ซิมมอนส์ et al., 2005) พื้นที่เหล่านี้เป็นชนบททั้งหมด มีสภาพแวดล้อมที่ประชากรคล้ายคลึงกัน เรื่องจากพื้นที่เสียอายุ ≥40 ปี และ มีท่อปัสสาวะซีดีระดับ ≥5 μg/g creatinine ใน 2007 การสำรวจรวมอยู่ในการศึกษานี้ (Nambunmee et al., 2010) อาศัยสัมผัสได้ 5 ปีอายุจับคู่กับคนจากตำบลแม่ Kasa ผู้เข้าร่วมแต่ละยินยอม และสัมภาษณ์ โดยพยาบาลที่ผ่านการฝึกอบรม งานวิจัยจริยธรรมคณะกรรมการของคณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่อนุมัติการศึกษานี้ (อนุมัติครั้งที่ 004/2555)2.2. ตัวอย่างเก็บรวบรวมและประมวลผลยี่สิบห้ามิลลิลิตรของปัสสาวะตอนเช้าถูกรวบรวมจากผู้เข้าร่วมแต่ละในฟรีซีดีบรรจุภัณฑ์พลาสติก และเก็บไว้ที่ −20 องศาเซลเซียส แช่แข็ง และขนส่งในน้ำแข็งแห้งเพื่อมหาวิทยาลัยมิชิแกนสกัดดีเอ็นเอและซีดีวัดเลือดทั้งดำ ด้วย EDTA และปัสสาวะตัวอย่างของการถือศีลอด2.3. วัดแคดเมียมท่อปัสสาวะRefractometer แบบกำหนดความถ่วงจำเพาะของแต่ละอย่าง (PAL-10 อาตาโกะ Inc.) UCd ถูกวัดที่มิชิแกนแผนกของชุมชนสุขภาพเป็นส่วนหนึ่งของสหรัฐอเมริกาศูนย์ควบคุมโรค (CDC) ปฏิบัติตอบสนองเครือข่ายโปรแกรม สั้น ๆ ปัสสาวะตัวอย่าง 1:10 ที่แตกออก ด้วย diluent ที่ประกอบด้วยกรดไนตริก 2.0% ภายในมาตรฐาน และ 0.05% ไตรตั้น X และความเข้มข้นของซีดีถูกกำหนดใช้ ICP-MS (DRCII, PerkinElmer สหรัฐอเมริกา) วิเคราะห์ความถูกต้องโดยใช้เอกสารอ้างอิงมาตรฐานท่อปัสสาวะ QMEQAS08U (สถาบันแห่งชาติ de santé publique du Québec, INSPQ) % 101.1 (n = 8) ตัวอย่างทั้งหมดมีขีดตรวจวิเคราะห์ของ 0.15 μg L.2.4 การเตรียม DNAดีเอ็นเอที่สกัดจาก μL 300 ของเลือดทั้งหมดที่ใช้ชุดดีเอ็นเอขนาดเล็ก QiaAMP (Qiagen, Valencia, CA, USA) ความเข้มข้นของดีเอ็นเอถูก quantified โดยใช้ Nanodrop (ThermoScientific, Wayne, MI สหรัฐอเมริกา), และเก็บไว้ที่ −20 องศาเซลเซียส ทำการปรับเปลี่ยนโซเดียม bisulfite บน 500 ng ของ genomic DNA ใช้ชุด Bisulfite EpiTect (Qiagen, Valencia, CA, USA) ตามโพรโทคอลของบริษัทผู้ผลิต2.5 การปรับปรับ assays สำหรับ MT2A, DNMT3B และ MGMT ถูกออกแบบโดยใช้ PyroMark ทดสอบออกแบบ 2.0 ปรับ 1 บรรทัดถูกวัดโดยใช้วิเคราะห์เผยแพร่ก่อนหน้านี้ (Yang et al., 2004) ขยาย bisulfite singleplex PCR ถูกทำ FastStart Taq พอลิเมอเรส (วินิจฉัย Roche อินเดียน่า สหรัฐอเมริกา) ด้วยรองพื้นความเข้มข้น 0.2 มม.และ ng 10 μL แปลง bisulfite เอ็น Microliters 15 ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกรวมกับรองพื้นลำดับ และวิธีวิเคราะห์ปรับใช้ Pyromark ™ MD ระบบ (Biotage) ตามของผู้ผลิตโพรโทคอล (PyroGold reagents) Bisulfite สี่และสี่ pyrosequencing ควบคุมสร้างขึ้น โดยผสม unmethylated และ methylated ควบคุมดีเอ็นเอ (genomic: EpigenDX แปลง bisulfite: Epitect) ได้รับการควบคุม ด้วย 0%, 30%, 60% และ 100% ปรับ แต่ละจานอย่างถูกเรียกใช้กับตัวควบคุมทั้งหมด ถ้าปรับค่าของตัวควบคุมไม่ถูกต้อง มีรันตัวอย่างทั้งหมดในจานอีกครั้ง วัดตัวอย่างทั้งหมดสำหรับทุกเครื่องปรับไม่สามารถเนื่องจากมีปริมาณไม่เพียงพอของดีเอ็นเอที่แยก2.6. สถิติวิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างค่า creatinine (Cr) -ปรับปรุง ความถ่วงจำเพาะ (SG) - ปรับปรุงและไม่ได้ปรับค่าถูกคำนวณโดยใช้วิธี Spearman ระดับ UCd ถูกปรับปรุง โดยถ่วงบัญชีสำหรับทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับการเจือจางความผันแปร (Suwazono et al., 2005) เครื่องหมายที่ท่อปัสสาวะได้มาตรฐานเพื่อถ่วงมัธยฐานของประชากรควบคุมด้วยสูตรต่อไปนี้: Cc = C [(1.017-1) /SG - 1)], ที่ Cc เป็น UCd แก้ไข SG, C คือ ระดับซีดีสังเกต 1.017 เป็นมัธยฐาน SG ของประชากร unexposed และ SG มีเฉพาะแรงโน้มถ่วงของตัวอย่างปัสสาวะของแต่ละบุคคล (Meeker et al., 2009) ไคสแควร์ และมานน์ – วิทนีย์ทดสอบใช้เปรียบเทียบประชากร unexposed และสัมผัส นัยสำคัญทางสถิติถูกกำหนดเมื่อ p < 0.05แบบจำลองถดถอยเชิงเส้นถูกใช้เพื่อกำหนดความสัมพันธ์ระหว่าง UCd และแต่ละเครื่องปรับ ปรับเปลี่ยนได้มาตรฐานขึ้นช่วง interquartile (IQR) ระดับ UCd หน่วยปรับได้ทีละ 1% เนื่องจากออกจาก normality, UCd และเครื่องหมายทั้งหมดปรับได้แปลงบันทึกการวิเคราะห์การถดถอย รุ่นถูกตีเป็นเปอร์เซ็นต์เพิ่มจำนวนประตูที่สัมพันธ์กับเปอร์เซ็นต์การเปลี่ยนแปลงในผลที่ได้ อายุ สถานะการสูบบุหรี่ และอาชีพเกี่ยวข้องกับระดับ UCd และรวมเป็น covariates เนื่องจากปรับถูกวัดในเม็ดเลือดขาวดีเอ็นเอ ทุกรุ่นถูกเรียกใช้ใหม่การปรับปรุงสำหรับการตรวจนับเม็ดเลือดขาว มีไม่มีความแตกต่างในผล และการตรวจนับเม็ดเลือดขาวไม่รวมอยู่ใน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
2.1 ประชากรที่ศึกษาพื้นที่การศึกษาและการอาสาสมัครได้รับการอธิบายก่อนหน้านี้และโดดเด่นอย่างกว้างขวาง (Nambunmee et al., 2010 และ Ruangyuttikarn et al., 2013) สั้น ๆ ที่เข้าร่วมการศึกษาประกอบด้วย 169 ประชาชนที่อาศัยอยู่ในอำเภอกู่พระพระธาตุปาดังและแม่เต่าที่รู้จักกันในพื้นที่ปนเปื้อนของแม่สอดและ 100 คนที่อาศัยอยู่แม่กาษาตำบลเป็นพื้นที่ที่ไม่ปนเปื้อนของแม่สอด (ซิมมอนส์และอัล ., 2005) พื้นที่เหล่านี้ล้วนเป็นชนบทที่มีสภาพแวดล้อมทางเศรษฐกิจและสังคมที่คล้ายกัน อาสาสมัครจากพื้นที่ปนเปื้อนอายุ≥40ปีและมีระดับปัสสาวะ Cd ≥5ไมโครกรัม / g creatinine ในการสำรวจ 2,007 ถูกรวมอยู่ในการศึกษาครั้งนี้ (Nambunmee et al., 2010) ที่อาศัยอยู่ในสัมผัสถูก 5 ปีอายุการจับคู่กับประชาชนจากแม่กาษาตำบล เข้าร่วมแต่ละคนได้รับการยินยอมและสัมภาษณ์โดยพยาบาลผ่านการฝึกอบรม ผลการวิจัยของคณะกรรมการจริยธรรมของคณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ได้รับการอนุมัติการศึกษาครั้งนี้ (ฉบับที่ 004/2012 การอนุมัติ). 2.2 การเก็บตัวอย่างและการประมวลผลมิลลิลิตรยี่สิบห้าของปัสสาวะในตอนเช้าที่ถูกเก็บรวบรวมจากผู้เข้าร่วมแต่ละบรรจุในภาชนะพลาสติกชนิด Cd ฟรีและเก็บไว้ที่ -20 ° C การถือศีลอดเลือดดำกับกลุ่มตัวอย่าง EDTA และปัสสาวะเป็นแช่แข็งและขนส่งบนน้ำแข็งแห้งไปที่มหาวิทยาลัยมิชิแกนในการสกัดดีเอ็นเอและการวัด Cd. 2.3 วัดแคดเมียมปัสสาวะเครื่องวัดกำหนดแรงโน้มถ่วงที่เฉพาะเจาะจงของแต่ละตัวอย่าง (PAL-10S, Atago อิงค์) UCD วัดที่มิชิแกนกรมสุขภาพชุมชนเป็นส่วนหนึ่งของสหรัฐศูนย์ควบคุมโรค (CDC) ห้องปฏิบัติการตอบสนองโปรแกรมเครือข่าย สั้น ๆ , ตัวอย่างปัสสาวะเจือจาง 1:10 เจือจางกับประกอบด้วย 2.0% กรดไนตริกมาตรฐานภายในและ 0.05% Triton X; และความเข้มข้นของแคดเมียมได้รับการพิจารณาโดยใช้ ICP-MS (DRCII, PerkinElmer สหรัฐอเมริกา) ความถูกต้องในการวิเคราะห์โดยใช้วัสดุอ้างอิงมาตรฐานปัสสาวะ QMEQAS08U (Institut de ชาติSanté Publique ดู่Québec, INSPQ) เป็น 101.1% (n = 8) ตัวอย่างทั้งหมดอยู่เหนือขีด จำกัด ของการตรวจสอบวิเคราะห์ของ 0.15 ไมโครกรัม / ลิตร. 2.4 การเตรียมดีเอ็นเอดีเอ็นเอที่สกัดจาก 300 ไมโครลิตรของเลือดโดยใช้ดีเอ็นเอ QiaAMP Mini Kit (Qiagen, วาเลนเซีย, CA, USA) ความเข้มข้นของปริมาณดีเอ็นเอโดยใช้ Nanodrop (ThermoScientific เวย์น, MI, USA) และเก็บไว้ที่ -20 ° C โซเดียม bisulfite ปรับเปลี่ยนได้ดำเนินการใน 500 นาโนกรัมของดีเอ็นเอโดยใช้ EpiTect bisulfite Kit (Qiagen, วาเลนเซีย, CA, USA) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต. 2.5 ดีเอ็นเอ methylation ตรวจ Methylation สำหรับ MT2A, DNMT3B และ MGMT ถูกออกแบบโดยใช้ PyroMark Assay ออกแบบ 2.0 methylation สาย-1 วัดโดยใช้การวิเคราะห์ที่เผยแพร่ก่อนหน้า (Yang et al., 2004) ขยาย PCR bisulfite singleplex ได้รับการดำเนินการโดยใช้ FastStart Taq โพลิเมอร์ (Roche Diagnostics อินดีแอนาสหรัฐอเมริกา) ไพรเมอร์ที่มีความเข้มข้น 0.2 มิลลิ 10 ng / ไมโครลิตรดีเอ็นเอ bisulfite แปลง สิบห้า microliters ของผลิตภัณฑ์ PCR ได้ร่วมกับไพรเมอร์ลำดับและการวิเคราะห์ methylation ได้ดำเนินการโดยใช้ Pyromark ™ MD ระบบ (BIOTAGE) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (น้ำยา PyroGold) bisulfite สี่และสี่ควบคุม pyrosequencing ถูกสร้างขึ้นโดยการผสมดีเอ็นเอควบคุมและแอลกอฮอล์ unmethylated (จีโนม: EpigenDX; bisulfite แปลง: Epitect) ที่จะได้รับการควบคุม 0%, 30%, 60% และ 100% methylation แต่ละแผ่นตัวอย่างทำงานด้วยการควบคุมทั้งหมด หากค่า methylation ของการควบคุมไม่ถูกต้องตัวอย่างทั้งหมดบนแผ่นวิ่งอีกครั้ง วัดของกลุ่มตัวอย่างทั้งหมดเครื่องหมายทุก methylation เป็นไปไม่ได้เนื่องจากปริมาณไม่เพียงพอของดีเอ็นเอที่สกัด. 2.6 การวิเคราะห์ทางสถิติความสัมพันธ์ระหว่างรี (Cr) -adjusted ความถ่วงจำเพาะ (SG) -adjusted และค่าเท็มเพลตจะถูกคำนวณโดยใช้วิธีการสเปียร์แมน ระดับ UCD มีการปรับโดยแรงโน้มถ่วงที่เฉพาะเจาะจงไปยังบัญชีสำหรับการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับการลดสัดส่วนทั้งหมด (Suwazono et al., 2005) เครื่องหมายทางเดินปัสสาวะได้รับมาตรฐานเพื่อความถ่วงจำเพาะเฉลี่ยของประชากรการควบคุมที่มีสูตรต่อไปนี้: สำเนา = C [(1.017-1) / SG - 1)] ที่สำเนาเป็น UCD SG-แก้ไข C เป็นระดับ Cd สังเกต 1.017 เป็น SG เฉลี่ยของประชากรที่ยังไม่ได้ถ่ายและ SG เป็นแรงโน้มถ่วงที่เฉพาะเจาะจงของตัวอย่างปัสสาวะของแต่ละบุคคล (Meeker et al., 2009) ไคสแควร์และการทดสอบ Mann-Whitney ถูกนำมาใช้เพื่อเปรียบเทียบประชากรสัมผัสและยังไม่ได้ถ่าย นัยสำคัญทางสถิติถูกกำหนดเมื่อ p <0.05. เชิงเส้นแบบถดถอยถูกใช้ในการกำหนดความสัมพันธ์ระหว่าง UCD และแต่ละเครื่องหมาย methylation การเปลี่ยนแปลง methylation ถูกมาตรฐานเพื่อช่วง interquartile (IQR) เพิ่มขึ้นในระดับ UCD หน่วย methylation อยู่ในเพิ่มทีละ 1% เนื่องจากการออกจากภาวะปกติ, UCD และเครื่องหมาย methylation ทั้งหมดถูกเปลี่ยนเข้าสู่ระบบสำหรับการวิเคราะห์การถดถอย รุ่นที่ถูกตีความว่าเป็นเพิ่มขึ้นร้อยละในการทำนายที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงร้อยละในผล อายุสถานะการสูบบุหรี่และการประกอบอาชีพมีความสัมพันธ์กับระดับ UCD และรวมเป็นตัวแปร เพราะ methylation วัดในดีเอ็นเอของเซลล์เม็ดเลือดขาวทุกรุ่นได้รับการ re-run ปรับสำหรับการนับเม็ดเลือดขาว มีความแตกต่างในผลไม่และจำนวนเซลล์เม็ดเลือดขาวที่ไม่รวมอยู่ใน