Human cystatin C (CYSC) is a 13-kDa

Human cystatin C (CYSC) is a 13-kDa endogenous cysteine proteinase inhibitor and was investigated as a replacement for creatinine as a marker of renal function. However, expressing recombinant CYSC is difficult in Escherichia coli because of resulting low yield and insufficient purity and insolubility. Here, we cloned and fused CYSC to the C-terminus of three soluble partners – maltose-binding protein (MBP), glutathione S-transferase (GST) and translation initiation factor 2 domain I (IF2) – to screen for their ability to improve the solubility of recombinant CYSC when expressed in E. coli. MBP was best at enhancing the soluble expression of CYSC, with soluble fractions accounting for 92.8 ± 3.11% of all proteins. For scaled production, we purified the de-tagged CYSC by using a 3C protease-cleaved MBP-T3-CYSC fused protein with immobilized metal affinity chromatography and cation-affinity purification. The molecular weights of the de-tagged CYSC and human natural CYSC were similar, and the former could react specifically with CYSC polyclonal antibody. Moreover, the de-tagged CYSC displayed full biological activity against papain and cathepsin B, which was very similar to that of the human natural CYSC protein standard. We provide a method to produce large amounts of soluble recombinant human CYSC in E. coli.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

มนุษย์ cystatin C (CYSC) เป็นสารยับยั้งที่ 13 kDa endogenous cysteine proteinase และถูกสอบสวนแทน creatinine เป็นเครื่องหมายของฟังก์ชันไต อย่างไรก็ตาม การแสดง recombinant CYSC ได้ยากใน Escherichia coli เนื่องจากได้ผลตอบแทนต่ำ และความบริสุทธิ์ไม่เพียงพอ และ insolubility ที่นี่ เราโคลน และ fused CYSC กับนัส C ละลายน้ำได้สามคู่-maltose ผูกโปรตีน (MBP), ไธ S-transferase (GST) และโดเมน 2 ปัจจัยเริ่มต้นแปลฉัน (IF2) – การจอสำหรับความสามารถในการเพิ่มการละลายของ CYSC recombinant เมื่อแสดงใน E. coli MBP สุดเพิ่มค่าการละลายของ CYSC กับบัญชี 92.8 ± 3.11% ของโปรตีนทั้งหมดส่วนที่ละลายน้ำได้ สำหรับการผลิตปรับสัดส่วนได้ เราบริสุทธิ์ CYSC ติดแท็กยกเลิก โดยใช้ MBP-T3-CYSC fused โปรตีน 3 C แหวกรติเอสมีความเกี่ยวข้องของโลหะเอนไซม์ฟอก chromatography และ cation-ความสัมพันธ์ น้ำหนักโมเลกุลของ CYSC de-แท็กและ CYSC ธรรมชาติมนุษย์ได้เหมือนกัน และเดิมสามารถทำปฏิกิริยากับแอนติบอดี polyclonal CYSC โดยเฉพาะ นอกจากนี้ CYSC de-แท็กแสดงกิจกรรมชีวภาพเต็มรูปแบบกับเอนไซม์ปาเปนและ cathepsin B ซึ่งเป็นคล้ายกับของมนุษย์ธรรมชาติ CYSC โปรตีนมาตรฐาน เรามีวิธีการในการผลิตจำนวนมากละลาย CYSC มนุษย์ recombinant ใน E. coli

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

คริสตา C มนุษย์ (CYSC) เป็นสารยับยั้งเอนไซม์โปรติ cysteine​​ ภายนอก 13 กิโลดาลตันและได้รับการตรวจสอบแทน creatinine เป็นเครื่องหมายของการทำงานของไต อย่างไรก็ตามการแสดง CYSC recombinant เป็นเรื่องยากใน Escherichia coli เนื่องจากผลผลผลิตต่ำและความบริสุทธิ์ไม่เพียงพอและไม่ละลาย ที่นี่เราโคลนและหลอมรวม CYSC ไปที่ C-ปลายทางของสามพันธมิตรที่ละลายน้ำได้ - มอลโตสโปรตีนผูกพัน (MBP), กลูตาไธโอน S-transferase (GST) และการเริ่มต้นการแปลปัจจัย 2 โดเมนฉัน (IF2) - ไปยังหน้าจอสำหรับความสามารถของพวกเขาในการปรับปรุง การละลายของ CYSC recombinant เมื่อแสดงออกใน E. coli MBP เป็นที่ดีที่สุดในการเสริมสร้างการแสดงออกที่ละลายน้ำ CYSC กับเศษส่วนที่ละลายน้ำได้คิดเป็นสัดส่วน 92.8 ± 3.11% ของโปรตีนทั้งหมด สำหรับการผลิตปรับขนาดเราบริสุทธิ์ CYSC de-ติดแท็กโดยใช้เอนไซม์โปรติเอ-3C ตัด MBP-T3-CYSC ผสมโปรตีนที่มีความใกล้ชิดกับโคโลหะตรึงและการทำให้บริสุทธิ์ไอออนบวกเป็นพี่น้องกัน น้ำหนักโมเลกุลของ CYSC de-ติดแท็กและมนุษย์ CYSC ธรรมชาติมีความคล้ายคลึงกันและอดีตอาจทำปฏิกิริยาเฉพาะกับแอนติบอดีโพลี CYSC นอกจากนี้ CYSC de-ติดแท็กแสดงฤทธิ์ทางชีวภาพเต็มกับปาเปนและ cathepsin B ซึ่งเป็นคล้ายกับที่ของมาตรฐานโปรตีนมนุษย์ CYSC ธรรมชาติ เราให้วิธีการในการผลิตจำนวนมากของ CYSC มนุษย์ที่ละลายน้ำได้ recombinant ในเชื้อ E. coli

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

มนุษย์ cystatin C ( cysc ) เป็น 13 กิโลภายใน 8-12 ตัวยับยั้งโปรและถูกสอบสวนแทนครีเป็นเครื่องหมายของไต . อย่างไรก็ตาม การแสดงแบบ cysc ยากใน Escherichia coli เพราะส่งผลให้ผลผลิตต่ำและความบริสุทธิ์ไม่เพียงพอและกรดเมตา . ที่นี่เราสามารถผสม cysc กับ c-terminus สามคู่และน้ำตาลละลายโปรตีน ( MBP ) , กลูต้าไธโอน เรส ( GST ) และการแปลเริ่มต้นปัจจัย 2 โดเมน ( if2 ) และหน้าจอสำหรับความสามารถในการเพิ่มการละลายของโปรตีนที่ cysc เมื่อแสดงออกใน E . coli . MBP ที่ดีที่สุดเพื่อส่งเสริมการแสดงออกของ cysc ละลาย , ละลายสำหรับเศษส่วนที่มีบัญชีอยู่± 311 เปอร์เซ็นต์ของโปรตีน สำหรับปรับขนาดการผลิต เราบริสุทธิ์ เดอ แท็ก cysc โดยใช้ 3C ของเอส mbp-t3-cysc ผสมโปรตีน chromatography สามารถตรึงโลหะประจุทางบริสุทธิ์ น้ำหนัก โมเลกุลของ เดอ แท็ก cysc cysc ธรรมชาติและมนุษย์มีความคล้ายคลึงกับอดีตอาจเป็นเฉพาะกับ cysc ใช้แอนติบอดี นอกจากนี้เดอ แท็ก cysc แสดงเต็มรูปแบบทางชีวภาพ กิจกรรมกับปาเปนและคาเทปซิน บี ซึ่งเป็นคล้ายกับที่ของมนุษย์ cysc ธรรมชาติโปรตีนมาตรฐาน เรามีวิธีการผลิตจำนวนมากของ cysc ปริมาณ recombinant มนุษย์ใน E . coli .