Yeast transformation. The plasmids

Yeast transformation. The plasmids used for transformation of the Saccharo-
myces strains described in this paper were all pUCKm8 or pUCKm10 derivatives
which contain the geneticin resistance gene (the Kmr gene [also known as the
kanamycin resistance gene]) and the ampicillin resistance gene (the Apr gene).
The Kmr gene can be a dominant selectable marker for many yeasts, particularly
Saccharomyces species (27). Transformation of the Saccharomyces strains by the
pUCKm8 or pUCKm10 derivatives, such as pLNH31, pLNH32, pLNH33, or
pLNH34, was carried out by electroporation largely by using the procedure
described by Becker and Guarente (3), with some minor modifications. The yeast
cells were grown to a density of 120 to 160 Klett units (KU) (optical density at
600 nm [OD600], 12 to 16). A yeast cell suspension (60 ml containing 1 to 5 ml of
plasmid DNA) in a 0.2-cm sterile Bio-Rad cuvette was electroporated with a
Gene Pulser and a Pulse Controller (both obtained from Bio-Rad) set at 1.5 to
2.0 kV (the value varied from strain to strain), 25 mF, and 200 V. Authentic yeast
transformants were selected as described below. The Kmr gene in a plasmid
served as the primary selectable marker which rendered the host cells carrying
the plasmid resistant to geneticin present in the medium. The concentration of
geneticin used varied somewhat for different Saccharomyces yeasts. For example,
fusion 1400 transformants were selected on YEPD (1% yeast extract, 2% pep-
tone, 2% glucose) plates containing 40 mg of geneticin per ml, and S. cerevisiae
AH22 transformants were selected on YEPD plates containing 50 mg of gene-
ticin per ml. However, some untransformed yeast cells can be induced to become
resistant to geneticin. Thus, geneticin is not ideal for direct selection of trans-
formants, and not every geneticin-resistant colony is a true transformant. It has
been reported that the Apr gene can be expressed in S. cerevisiae (19), and we
found that it can also be expressed in fusion yeast strain 1400, as well as most
other Saccharomyces strains. However, most Saccharomyces strains are resistant
to ampicillin, and therefore the Apr gene cannot be used directly as a dominant
selectable marker for selection of yeast transformants. Nevertheless, Saccharo-
myces strains exhibiting high levels of Apr gene expression produce penicillinase,
and it is possible to identify yeast colonies containing the cloned Apr gene on
special plates by the penicillinase test (9). The latter test provides a way to
identify true transformants from geneticin-resistant colonies

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การแปลงยีสต์ Plasmids ที่ใช้สำหรับการเปลี่ยนแปลงของ Saccharo-สายพันธุ์ myces ที่อธิบายไว้ในเอกสารนี้ถูกตราสารอนุพันธ์ทั้งหมด pUCKm8 หรือ pUCKm10ซึ่งประกอบด้วยยีนที่ต้านทาน geneticin (ยีน Kmr [หรือที่เรียกว่าการกานามัยซินต้านทานยีน]) และยีนต้านทานโกคอ (เม.ย.ยีน)ยีน Kmr สามารถเครื่องหมายเลือกที่โดดเด่นสำหรับยีสต์มาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งสายพันธุ์ saccharomyces (27) การเปลี่ยนแปลงของ Saccharomyces ในสายพันธุ์โดยการpUCKm8 หรือ pUCKm10 อนุพันธ์ pLNH31, pLNH32, pLNH33 หรือpLNH34 ดำเนินการ โดย electroporation เป็นส่วนใหญ่ โดยใช้กระบวนการอธิบาย โดยเบกเกอร์และ Guarente (3), การแก้ไขบางเล็กน้อย ยีสต์เซลล์ที่ปลูกจะมีความหนาแน่นของหน่วย Klett 120 ไป 160 (KU) (แสงความหนาแน่นของ600 nm [OD600], 12-16) การระงับเซลล์ยีสต์ 60 มิลลิลิตรที่ประกอบด้วย 1 ถึง 5 มล.plasmid DNA) ใน 0.2 ซม.ผ่านการฆ่าเชื้อ Bio-ล้อ เวตเป็น electroporated กับการPulser ยีนและควบคุมชีพจร (ทั้งที่ได้จาก Bio-ล้อ) ตั้งไว้ที่ 1.5-2.0 kV (ค่าสายพันธุ์พันธุ์ที่แตกต่างกัน), 25 mF และ 200 V. แท้ยีสต์transformants ถูกเลือกตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง ยีน Kmr ใน plasmid เป็นเป็นเครื่องหมายเลือกหลักที่แสดงในเซลล์โฮสต์แบกplasmid ทน geneticin อยู่ในตัวกลาง ความเข้มข้นของgeneticin ที่ใช้แตกต่างกันบ้างสำหรับยีสต์ Saccharomyces แตกต่างกัน ตัวอย่างเช่นtransformants 1400 ฟิวชั่นถูกเลือกบน YEPD (สารสกัดจากยีสต์ 1%, 2% ลั่น-แผ่นเสียง กลูโคส 2%) ที่มี 40 มิลลิกรัมของ geneticin ต่อมล. และ S. cerevisiaeเลือก AH22 transformants บนแผ่น YEPD ที่ประกอบด้วยยีน-50 มิลลิกรัมticin ต่อมิลลิลิตร อย่างไรก็ตาม สามารถเหนี่ยวนำเซลล์บางเซลล์ยีสต์ untransformed จะกลายเป็นทนต่อการ geneticin , Geneticin จึงไม่เหมาะสำหรับการคัดเลือกโดยตรงของทรานส์-formants และอาณานิคมไม่ทุกทน geneticin เป็น transformant แท้จริง มีการรายงานว่า สามารถแสดงยีนเม.ย.ใน S. cerevisiae (19), และเราพบว่า มันสามารถยังแสดงในสายพันธุ์ยีสต์ฟิวชั่น 1400 เป็นส่วนใหญ่สายพันธุ์ Saccharomyces อื่น ๆ อย่างไรก็ตาม สายพันธุ์ Saccharomyces สุดจะทนโกคอ และดังนั้นเม.ย. ยีนไม่สามารถใช้โดยตรงเป็นโดดเด่นเครื่องหมายที่เลือกสำหรับการเลือกของยีสต์ transformants อย่างไรก็ตาม Saccharo-สายพันธุ์ myces ที่แสดงระดับสูงของเม.ย.ยีนผลิต penicillinaseและจำเป็นต้องระบุยีสต์อาณานิคมที่ประกอบด้วยยีนเม.ย.โคลนบนแผ่นพิเศษ โดยการทดสอบ penicillinase (9) การทดสอบหลังมีวิธีระบุ transformants จริงจากอาณานิคม geneticin ทน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเปลี่ยนแปลงของยีสต์ พลาสมิดที่ใช้สำหรับการแปลงของ saccharo -สายพันธุ์ที่อธิบายไว้ในบทความนี้ myces ทั้งหมด puckm8 หรือ puckm10 อนุพันธ์ซึ่งประกอบด้วย geneticin ต้านทานยีน ( KMR ) [ หรือที่เรียกว่าจีน ] ต้านทาน kanamycin ) และยีน ยีนต้านทานยาแอมพิซิลิน เม.ย. )โดย KMR ยีนสามารถเครื่องหมายเลือกเด่นหลายยีสต์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งSaccharomyces ชนิด ( 27 ) และการเปลี่ยนแปลงของสายพันธุ์โดยpuckm8 หรือ puckm10 อนุพันธ์ เช่น plnh31 plnh32 plnh33 , , , หรือplnh34 ถูกดำเนินการโดยส่วนใหญ่ใช้วิธี electroporation โดยบรรยายโดย guarente Becker และ ( 3 ) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยบาง ยีสต์เซลล์ปลูกที่ความหนาแน่น 120 ถึง 160 หน่วยเคล็ด ( KU ) optical ( ความหนาแน่นที่od600 600 nm [ ] , 12 - 16 ) การระงับเซลล์ยีสต์ ( 60 ml ประกอบด้วย 5 มิลลิลิตรพลาสมิดดีเอ็นเอ ) ใน 0.2-cm ปลอดเชื้อชีวภาพราดพิทยาพลคือ electroporated กับพัลเซอร์ยีนและชีพจรควบคุม ( ที่ได้จากชีวภาพราด ) ตั้งไว้ที่ 1.52.0 กิโล ( ค่าแตกต่างจากความเครียด ความเครียด ) , 25 MF และ 200 V . แท้ ยีสต์พลาสมิดจำนวนตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง โดย KMR ยีนในพลาสมิดทำหน้าที่เป็นหลักเลือกเครื่องหมายซึ่งแสดงเซลล์โฮสต์ แบกพลาสมิดที่ทนต่อ geneticin อยู่ในระดับปานกลาง ความเข้มข้นของgeneticin ใช้แตกต่างกันค่อนข้างสำหรับยีสต์ Saccharomyces ต่าง ๆ ตัวอย่างเช่นฟิวชั่น 1400 transformants ถูกเลือกบนอาหารเลี้ยงเชื้อ ( สารสกัดจากยีสต์ 1% 2% เป๊ป -โทนน้ำตาล 2% ) แผ่นบรรจุ 40 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และ geneticin , S . cerevisiaeah22 transformants บนจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบด้วยยีน - 50 มิลลิกรัมticin ต่อมิลลิลิตร แต่บางเซลล์ยีสต์ untransformed สามารถกระตุ้นให้กลายเป็นป้องกัน geneticin . ดังนั้น geneticin ไม่เหมาะสำหรับการเลือกของทรานส์ - โดยตรงformants และไม่ทุก geneticin ป้องกันอาณานิคมเป็น / จริง มันมีมีรายงานว่าเม.ย. ยีนสามารถแสดงออกใน S . cerevisiae ( 19 ) และเราพบว่ามันยังสามารถแสดงออกในยีสต์สายพันธุ์ 1400 ฟิวชั่นเป็นที่สุดอื่น ๆและสายพันธุ์ แต่ส่วนใหญ่จะเป็นสายพันธุ์ต้านทานให้แอมพิซิลลิน และดังนั้น เม.ย. ยีนไม่สามารถใช้โดยตรงเป็นเด่นเครื่องหมายเลือกคัดเลือก transformants ยีสต์ อย่างไรก็ตาม saccharo -myces สายพันธุ์โดยระดับการแสดงออกของยีนผลิตเพนนิซิลลินเม.ย. ,และมันเป็นไปได้ที่จะระบุยีสต์อาณานิคมที่มีโคลนยีนในเม.ย.พิเศษแผ่นโดยเพนนิซิลลินทดสอบ ( 9 ) ทดสอบหลังให้วิธีพลาสมิดจากอาณานิคมที่ทน geneticin ระบุจริง