To our knowledge the present study

To our knowledge the present study is the first to explore
the potential of ddPCR to detect and characterize KRAS status
in the CTCs of patients with colorectal cancer after isolation
by size-based technology. Our findings show that molecular
characterization of CRCs using ddPCR is feasible with a good
sensitivity and concordance between the KRAS phenotype in
the CTCs and the corresponding tumor tissues.
2. Material and methods
2.1. Samples from colorectal cancer patients and healthy
donors
A total of 35 patients with colorectal cancer (CRC) were included
in this study. Patients enrolled in this study have been included
in larger clinical studies (NCT01675999 and NCT 00958737)
approved by the local ethical committee. All participants were
informed by the surgeons (MK, GM and AP) and signed a specific
consent form for this study. Ethylenediaminetetraacetic acid
(EDTA)-anticoagulated peripheral blood (6 mL) was obtained
from all patients just before colorectal tumor resection. DNA
was extracted from the enriched fraction of CTCs (see below)
aswell as from tumor tissues obtained after surgery. All samples
from healthy donors (HD) were obtained anonymously from ten
healthy volunteers (6men and 4women;mean age 42 15 years)
drawn at french national transfusion agency (Bichat-Claude
Bernard). According to the French law related to research of
donated blood, general indications includes age A (G12D) and MCF7 harbor no mutations in KRAS
gene. After trypsinization, PANC1 cells were picked one by
one under an inverted microscope and transferred into
100 mL of nuclease-free PBS1X before to be added into 3 or
6 mL of whole blood of HD. Then, blood was filtered for
CTCs counting or KRAS status determination.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ความรู้ของเรา ในการวิจัยเป็นครั้งแรกเพื่อสำรวจศักยภาพของ ddPCR เพื่อตรวจสอบ และลักษณะสถานะคราสใน CTCs ของผู้ป่วยโรคมะเร็งลำไส้ใหญ่หลังจากแยกโดยเทคโนโลยีขนาดตาม ผลการวิจัยของเราแสดงว่าโมเลกุลสิง CRCs ใช้ ddPCR เป็นไปได้ ด้วยดีความไวและสอดคล้องระหว่างกนิคราสในCTCs ในและเนื้อเยื่อมะเร็งที่สอดคล้องกัน2. วัสดุและวิธีการ2.1. ตัวอย่าง จากผู้ป่วยมะเร็ง และดีต่อสุขภาพผู้บริจาคจำนวนผู้ป่วยโรคมะเร็งลำไส้ใหญ่ (CRC) 35 มาพร้อมในการศึกษานี้ ผู้ป่วยที่ลงทะเบียนในการศึกษานี้ถูกรวมอยู่ด้วยในการศึกษาทางคลินิกขนาดใหญ่ (NCT01675999 และ NCT 00958737)ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมในท้องถิ่น มีผู้เข้าร่วมทั้งหมดทราบ โดยศัลยแพทย์ (MK, GM และ AP) และลงนามเฉพาะแบบฟอร์มยินยอมการศึกษานี้ กรด Ethylenediaminetetraacetic(EDTA) -ได้รับเลือด anticoagulated (6 มล.)จากผู้ป่วยทั้งหมดก่อนที่จะชำแหละเนื้องอกลำไส้ใหญ่ ดีเอ็นเอถูกแยกจากส่วนอุดมของ CTCs (ดูด้านล่าง)เช่นนับจากเนื้อเยื่อของเนื้องอกได้หลังการผ่าตัด ตัวอย่างทั้งหมดจากผู้บริจาคเพื่อสุขภาพ (HD) ได้รับโพสจากสิบอาสาสมัครสุขภาพดี (6men 4women หมายถึง อายุ 42 ปีและ 15 ปี)วาดที่ประคองชาติฝรั่งเศสแทน (Bichat-โคลดเบอร์นาร์ด) ตามกฎหมายฝรั่งเศสที่เกี่ยวข้องกับงานวิจัยของร่วมบริจาคโลหิต สรรพคุณทั่วไปมีอายุ < 70 ปีโดยไม่รู้จักโรคที่เรื้อรัง มะเร็ง โรค hematologicalหรือติดเชื้อไวรัส และไม่มีสาขา หรือผ่าตัดในระหว่างการ4 เดือน2.2. การกำหนดตัวบ่งชี้มะเร็งในซีรั่มAssayed CEA (มะเร็งตัวอ่อน Antigen) และ CA19.9ในซีรั่มของผู้ป่วยรวบรวมในการเพิ่มเติมในการขณะเดียวกันที่แยก CTC และวิเคราะห์ cytological การทำการทดสอบ immunoanalysis ตาม KRYPTORวิเคราะห์ (B.R.A.H.M.S, Hennigsdorf เยอรมนี) ตามวิธีการมาตรฐาน2.3. วัฒนธรรมและองศาการทดลองเซลล์มะเร็งตับมนุษย์ PANC1 เซลล์บรรทัด และสายเซลล์มะเร็งเต้านมของมนุษย์ MCF-7 ได้รับจากATCC (ATCC มานาสซาส สหรัฐอเมริกา) PANC 1 ถูกล้างด้วยDMEM ที่ประกอบด้วย 10% ซีรั่มวัวบ่อย ๆ และยาปฏิชีวนะขณะ MCF7 ถูกล้าง MEM และเพิ่ม0.01 mg/mL recombinant อินซูลินของมนุษย์ วัวเกิด 10%เซรั่มและยาปฏิชีวนะ เป็น PANC1 สำหรับคราสc.35G > (G12D) และท่าเรือ MCF7 ไม่กลายพันธุ์ในคราสยีน หลังจาก trypsinization, PANC1 เซลล์รับโดยหนึ่งภายใต้กล้องจุลทรรศน์การคว่ำ และโอนเข้า100 มิลลิลิตรของฟรี nuclease PBS1X ก่อนที่จะเพิ่มเป็น 3 หรือ6 มิลลิลิตรของเลือดของ HD แล้ว เลือดถูกกรองสำหรับCTCs นับหรือกำหนดสถานะคราส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เพื่อความรู้ของเราในปัจจุบันการศึกษาเป็นครั้งแรกในการสำรวจ
ศักยภาพของ ddPCR ในการตรวจสอบและลักษณะสถานะ KRAS
ใน CTCs ของผู้ป่วยที่เป็นโรคมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักหลังจากที่แยก
ด้วยเทคโนโลยีขนาดตาม ผลการวิจัยของเราแสดงให้เห็นว่าโมเลกุล
ลักษณะของ CRCs ใช้ ddPCR เป็นไปได้ด้วยดี
ความไวและความสอดคล้องระหว่างฟีโนไทป์ KRAS ใน
CTCs และเนื้อเยื่อของเนื้องอกที่สอดคล้องกัน
2. วัสดุและวิธีการ
2.1 ตัวอย่างจากผู้ป่วยโรคมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักและมีสุขภาพดี
บริจาค
รวมของผู้ป่วย 35 ด้วยโรคมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก (CRC) ถูกรวมอยู่
ในการศึกษานี้ ผู้ป่วยที่ลงทะเบียนเรียนในการศึกษาครั้งนี้ได้รับการรวม
อยู่ในการศึกษาทางคลินิกขนาดใหญ่ (NCT01675999 และ NCT 00958737)
ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมท้องถิ่น ผู้เข้าร่วมทั้งหมดได้รับการ
แจ้งจากศัลยแพทย์ (MK, จีเอ็มและ AP) และลงนามเฉพาะ
รูปแบบความยินยอมในการศึกษาครั้งนี้ กรด Ethylenediaminetetraacetic
(EDTA) -anticoagulated เลือด (6 มิลลิลิตร) ที่ได้รับ
จากผู้ป่วยทั้งหมดเป็นเพียงแค่ก่อนที่จะผ่าตัดเนื้องอกในลำไส้ใหญ่ ดีเอ็นเอ
ถูกสกัดจากส่วนของอุดม CTCs (ดูด้านล่าง)
ตลอดจนจากเนื้อเยื่อของเนื้องอกได้รับหลังการผ่าตัด ตัวอย่างทั้งหมด
จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี (HD) ที่ได้รับโดยไม่ระบุชื่อจากสิบ
อาสาสมัครสุขภาพดี (6men และ 4women; อายุ 42 15 ปีหมายความว่า)
ดึงหน่วยงานการถ่ายชาติฝรั่งเศส (Bichat-Claude
Bernard) ตามที่กฎหมายฝรั่งเศสที่เกี่ยวข้องกับการวิจัยของ
โลหิตบริจาคตัวชี้วัดทั่วไปรวมถึงอายุ <70 ปี
โดยไม่ต้องรู้จักกันโรคเรื้อรังโรคมะเร็ง, โรคทางโลหิตวิทยา
หรือการติดเชื้อไวรัสและไม่มีการถ่ายหรือการผ่าตัดในช่วง
4 เดือนสุดท้าย
2.2 ความมุ่งมั่นของเนื้องอกซีรั่มเครื่องหมาย
CEA (มะเร็งตัวอ่อน Antigen) และ CA19.9 ถูก assayed
ในซีรั่มของผู้ป่วยที่เก็บรวบรวมไว้ในหลอดเพิ่มเติมใน
เวลาเดียวกันกับที่แยก CTC และการวิเคราะห์ทางเซลล์วิทยา
ทดสอบ immunoanalysis ได้รับการดำเนินการบน KRYPTOR
วิเคราะห์ (Brahms, Hennigsdorf, เยอรมนี) ตาม
ขั้นตอนมาตรฐาน
2.3 การเพาะเลี้ยงเซลล์และองศาการทดลอง
สายพันธุ์ของเซลล์มนุษย์ตับอ่อนมะเร็งของต่อม PANC1 และ
มนุษย์เซลล์มะเร็งเต้านมสาย MCF-7 ที่ได้รับจาก
ATCC (ATCC ซาส, สหรัฐอเมริกา) PANC-1 ที่เลี้ยงด้วย
DMEM ที่มีซีรั่มของทารกในครรภ์วัว 10% และยาปฏิชีวนะ
ในขณะ MCF7 เลี้ยงกับ MEM และนอกเหนือจาก
0.01 mg / ml มนุษย์อินซูลิน recombinant 10% ของทารกในครรภ์วัว
ซีรั่มและยาปฏิชีวนะ PANC1 เป็น heterozygous สำหรับ KRAS
c.35G> A (G12D) และท่าเรือ MCF7 การกลายพันธุ์ใน KRAS ไม่มี
ยีน หลังจาก trypsinization เซลล์ PANC1 ถูกหยิบหนึ่งโดย
หนึ่งภายใต้กล้องจุลทรรศน์คว่ำและโอนเข้ามา
100 มล PBS1X Nuclease ฟรีก่อนที่จะเพิ่มเป็น 3 หรือ
6 มลเลือดทั้งหมดของ HD จากนั้นเลือดถูกกรองสำหรับ
CTCs การนับหรือการชี้ขาดสถานะ KRAS

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ความรู้การศึกษาครั้งนี้เป็นครั้งแรกที่จะสํารวจศักยภาพของ ddpcr ตรวจจับและวิเคราะห์สถานะ krasใน ctcs ของผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่หลังจากแยกโดยขนาดของเทคโนโลยีที่ใช้ ผลการวิจัยพบว่า โมเลกุลคุณสมบัติของ crcs ใช้ ddpcr จะเป็นไปได้ด้วยดีความไวและความสอดคล้องระหว่าง kras ฟีโนไทป์ในการ ctcs เนื้องอกและเนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้อง2 . วัสดุและวิธีการ2.1 . ตัวอย่างจากผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก และมีสุขภาพดีผู้บริจาคทั้งหมด 35 ผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก ( CRC ) ประกอบด้วยในการศึกษานี้ ผู้ป่วยที่เข้าร่วมการศึกษาได้รับการรวมในการศึกษาทางคลินิกขนาดใหญ่ ( nct01675999 NCT และ 00958737 )ความเห็นชอบจากคณะกรรมการด้านจริยธรรมภายใน ผู้เข้าร่วมทั้งหมดได้แจ้งจากศัลยแพทย์ ( MK , ( gmt ) และ AP ) และลงนามโดยเฉพาะหนังสือยินยอม สำหรับการศึกษานี้ บอนกรดความคงตัวทางเคมี ( EDTA ) อุปกรณ์ต่อพ่วง ( 6 ml ) ที่ได้รับจากผู้ป่วยทั้งหมดก่อนที่ลำไส้ใหญ่เนื้องอกผ่าตัด ดีเอ็นเอสกัดจากส่วนของ ctcs อุดม ( ดูข้างล่าง )และจากเนื้อเยื่อมะเร็งที่ได้รับหลังจากการผ่าตัด ตัวอย่างทั้งหมดจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี ( HD ) ได้โดยไม่ระบุชื่อจากสิบอาสาสมัครที่มีสุขภาพดี ( 6men และ 4women ; หมายถึงอายุ 42 15 ปี )วาดในหน่วยงานบริการแห่งชาติฝรั่งเศส ( bichat คลเบอร์นาร์ด ) จากฝรั่งเศส กฎหมายที่เกี่ยวข้องกับงานวิจัยของบริจาคเลือด ข้อบ่งชี้ทั่วไปรวมถึงอายุ < 70 ปีโดยไม่รู้จักโรคเรื้อรัง , มะเร็ง , โรคโลหิตวิทยาหรือการติดเชื้อไวรัสและไม่มีเลือดหรือผ่าตัดในระหว่างเมื่อ 4 เดือน2.2 . การหาปริมาณเซรุ่มเนื้องอกเครื่องหมายCEA ( มะเร็ง ) และมีปริมาณ ca19.9 ตัวอ่อน )ในซีรั่มของผู้ป่วยสะสมในท่อเพิ่มเติมที่เวลาเดียวกันที่ CTC การแยกและการวิเคราะห์สามารถ . ที่immunoanalysis assay แสดงบน kryptorวิเคราะห์ ( b.r.a.h.m.s hennigsdorf , Germany ) ตามขั้นตอนมาตรฐาน2.3 การเพาะเลี้ยงเซลล์ และขัดขวางการทดลองมนุษย์และเซลล์ adenocarcinoma ตับอ่อน panc1 บรรทัดสายเซลล์มะเร็งเต้านมของมนุษย์ mcf-7 ที่ได้รับจากATCC และซาส , USA ) panc-1 เพาะเลี้ยงกับdmem ที่มี 10% foetal วัว เซรั่ม และ ยาปฏิชีวนะในขณะที่ mcf7 เพาะเลี้ยงกับแหม่ม และการเพิ่มของ0.01 มก. / มล. แนนท์อินซูลินมนุษย์ 10% foetal วัวเซรั่ม และยาปฏิชีวนะ panc1 เป็น homozygous สำหรับ krasc.35g > ( g12d ) และ mcf7 ท่าเรือไม่มีการกลายพันธุ์ ใน krasยีน หลังจาก trypsinization panc1 cells , เลือกโดยหนึ่งภายใต้กล้องจุลทรรศน์ และย้ายมากลับหัว100 มิลลิลิตรของนิวเคลียสฟรี pbs1x ก่อนที่จะเพิ่มเป็น 3 หรือ6 มิลลิลิตรของเลือดทั้งหมดของ HD แล้วเลือดที่ถูกกรองสำหรับctcs นับหรือ kras ภาวะการตัดสินใจ