MATERIAL AND METHODSPlant materialI

MATERIAL AND METHODS
Plant material
Indicavariety Mudgo and Japonicavariety Wuyujing 3
were used as resistant and susceptible controls, respec-tively. Mapping populations of 162 F
2and 150 BC1
plants
were derived from a cross of 02428 and Rathu Heenati
(RH) and the backcross 02428 / Rathu Heenati // 02428;
each F2and BC1
individual was self-fertilized to obtain
sets F
2:3and BC1F2
lines.
Small brown planthoppers
The small brown planthopper population used in the study
was collected from rice fields in Nanjing, and maintained
on wheat for four generations before being transferred to
rice Wuyujing 3 under greenhouse conditions at Nanjing
Agricultural University. The insects were confirmed to be
non-viruliferous by a dot-immunobinding assay and PCR
detection (Qinet al. 1994).
Evaluation of SBPH resistance
Modified standard seedling-box screening test (SSST)
Soil was transferred to plastic cups 8 cm in diameter and
9 cm in height with and a hole in the base. All seeds were
germinated at 30°C. Thirty germinated seeds per
F2:3or BC1F2
line were planted in the soil. Twenty eight
cups, including resistant and susceptible control varieties,
were randomly placed in a 65  44  14 cm plastic
seedling-box and kept in water 2 cm deep. There were
three replicates for each cultivar and line. Seedlings were
grown in a greenhouse under natural light and ventilation
conditions at 25  1°C.
Fifteen small brown planthopper nymphs per plant
(2nd and 3rd instars) were placed on each seedling at the
1.5–2 leaf stage. Scoring was done when approximately
90% of Wuyujing 3 seedlings had died, each line or vari-ety was assigned a numerical score between 0 and 9
following a standard evaluation system used at IRRI
(1988). The mean value of three replicates was as the
damage score.
Antixenosis test
Fifteen germinated seeds per line were sown to soil
in plastic seedling-boxes; two rows per line. Seedlings
were grown under natural light at 25  1°C in the green-house. At the 1.5–2 leaf stage, the seedling-boxes were
transferred into cages covered with nylon nets, and then
seven (2nd–3rd instar) small brown planthopper nymphs
were placed on each seedling. There were three replicates
for each cultivar and line.
The number of insects on each seedling was counted
24 h after infestation, and then dispersed evenly among
the seedlings after counting every day. The average num-ber of insects on each line was calculated and treated as
the antixenosis value after 5 days scoring.
Antibiosis test
Colorless 7 cm diameter and 17 cm high glass cups were
used in this experiment. A hot solution (30 ml), contain-ing 1 g agar, 100 ml H
2
O and 15 ml MS, was poured into
each cup, and 5 germinated seeds were planted after the
culture medium had cooled. There were three replicates
for each cultivar and line. Seedlings were grown in the
greenhouse at 25  1°C under natural light.
At the 1.5–2 leaf stage, 30 small brown planthopper
nymphs (2nd–3rd instar) were placed on each seedling
in each cup which was then covered by nylon net. The
survival of nymphs in each cup was recorded each day for
10 days, and the average survival of insects on each line
was calculated and treated as the antibiosis value.
Statistical analyses
Statistical analysis of data were performed using one-way ANOVA and significant differences were identified
by the LSD test at P  0.05 using Excel ver. 2003 and
SPSS Statistics ver. 17.0. c
2
-tests were performed to
examine the goodness of fit between expected Mendelian
ratios and SSR and phenotype data.
DNA extraction
Two to three hundred mg fresh leaves of each F2and BC1
plant (and parents) were collected and put in a pre-cooled
mortar. Liquid nitrogen was added and the tissue was
ground to fine powder with a pestle and transferred into a
2.0 ml Eppendorf tube; 600 ml of extraction buffer (100 mM
Tris-HCl pH 8.0, 50 ml EDTA-Na2
, 500 mM NaCl, 1.25%
SDS) were added and to the Eppendorf tube and the mix-ture was homogenized. The tube was incubated in a 65°C
water bath for 30 min and shaken 3–4 times until the sam-ple turned deep green. One hundred ml of KAC (5 mol l
21
)
solution was added, homogenized and incubated on ice
for 30 min; 300–400 ml of chloroform:isoamyl alcohol
(24:1) solution was added and shaken at 120 rpm for
30 min; centrifuging was done at 12 000 rpm for 5 min,
and 200 ml of aqueous solution at the top was transferred
to a new Eppendorf tube; 400 ml of chilled 99.9% ethanol
(220°C) was added and incubated at 220°C for 20 min.
Centrifuging was done at 12 000 rpm for 5 min; the super-natant decanted and washed with 70% alcohol to dry the
Hereditas 000 (2011) Trait loci associated with planthopper resistance in rice 3
Table 1. Responses of parents and control varieties to
small brown planthopper. Sixty seedlings were used in
each test. HR - highly resistant, HS - highly susceptible.
Variety Response (mean  SE) Description
Rathu Heenati 1.2  0.12 HR
Mudgo 1.5  0.20 HR
02428 8.5  0.20 HS
Wuyujing 3 8.3  0.24 HS
Fig. 1a–c.Frequency distribution of SBPH resistance in the 02428 / RH F2
population. (a) seedling-box screening test; (b) antixenosis
test; (c) antibiosis test.
DNA. The DNA was re-suspended and dissolved in
100 ml of TE, and stored at 4°C.
Amplification of microsatellites and detection of
polymorphism
SSR markers and genomic sequences were obtained
from the Gramene database (www.gramene.org/marker/
index.html) (mccouchet al. 2002) SSR analysis was
performed following the procedure of Chenet al. (1997)
with minor modifications. Amplifications were performed
in a 10 ml system containing 10 mmol l
21
Tris-HCl pH 8.3,
50 mmol l
21
KCl, 1.5 mmol l21
MgCl2
, 50 mmol l21
of
each dNTP, 0.2 mmol l21
each of primers, 0.5 U Taqpoly-merase (TaKaRa, Dalian) and 20 ng of DNA template,
using a PTC-200 thermal cycler programmed at 95°C for
5 min, followed by 34 cycles of 30 s at 94°C, 30 s at 55°C,
40 s at 72°C and a final extension of 10 min at 72°C.
Amplified DNA products were electrophoresed on 8%
polyacylamide non-denaturing gels in 0.5  TBE buffer
and detections were made by the silver staining method
(sanguinettiet al. 1994). The bands were scored on a
light box lit with fluorescent lamps.
SSR mapping and QTL detection
Linkage groups were assembled using MAPMARKER
3.0 software at an LOD score of 3.0 (LincoLnet al.1992).
QTLs were detected by composite interval mapping
(CIM) using Windows QTL Cartographer 2

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ

พืชวัสดุ indicavariety mudgo และ japonicavariety wuyujing 3
ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมทนและอ่อนไหวตามลำดับ ประชากรการทำแผนที่จาก 162 ฉ
2and 150 bc1

พืชได้มาจากการข้ามของ 02428 และ rathu heenati
(ขวา) และ backcross 02428 / rathu heenati / / 02428;
แต่ละ bc1 f2and
บุคคลเป็นตัวเองที่จะได้รับการปฏิสนธิ
ชุดฉ
2:3 bc1f2

สาย.เพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลขนาดเล็ก
ประชากรเพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลขนาดเล็กที่ใช้ในการศึกษา
ถูกเก็บรวบรวมจากนาข้าวในหนานจิงและการบำรุงรักษา
ข้าวสาลีสี่รุ่นก่อนที่จะถูกถ่ายโอนไปยัง
ข้าว wuyujing 3 เรือนกระจกภายใต้เงื่อนไขที่นานกิง
มหาวิทยาลัยเกษตร แมลงที่ได้รับการยืนยันว่าเป็น
ไม่ viruliferous โดยทดสอบจุด immunobinding และ pcr
ตรวจสอบ (qinet อั. 1994).
การประเมินผลของความต้านทาน sbph
แก้ไขการตรวจคัดกรองต้นกล้ากล่องมาตรฐาน (ssst)
ดินถูกย้ายไปที่ถ้วยพลาสติก 8 ซม. ในเส้นผ่าศูนย์กลางและ
9 ซม. สูงที่มีและหลุมในฐาน เมล็ดทั้งหมดถูก
งอกที่ 30 องศาเซลเซียส สามสิบเมล็ดงอกต่อ
f2: 3or bc1f2
สายถูกนำมาปลูกในดิน 28
ถ้วยรวมทั้งทนและอ่อนไหวพันธุ์ควบคุม
ถูกวางไว้แบบสุ่มใน 65  44  14 ซม. พลาสติก
ต้นกล้ากล่องและเก็บไว้ในน้ำลึก 2 ซม. มีสาม
ซ้ำสำหรับแต่ละพันธุ์และสาย ต้นกล้าถูก
ปลูกในเรือนกระจกภายใต้แสงธรรมชาติและการระบายอากาศ
เงื่อนไขที่ 25  1 ° c.
สิบห้าขนาดเล็กนางไม้เพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลต่อพืช
(instars ที่ 2 และ 3) ถูกวางไว้ในแต่ละต้นกล้าที่
1.5-2 เวทีใบการให้คะแนนที่ทำเมื่อประมาณ
90% ของ wuyujing 3 ต้นกล้าตายแต่ละบรรทัดหรือตัวแปร ety ได้รับมอบหมายให้คะแนนตัวเลขระหว่าง 0 และ 9
ต่อไปนี้ระบบการประเมินมาตรฐานที่ใช้ irri
(1988) ค่าเฉลี่ยของสามซ้ำเป็น

ความเสียหายคะแนนการทดสอบ antixenosis
สิบห้าเมล็ดงอกต่อบรรทัดถูกหว่านในดินในต้นกล้า
กล่องพลาสติก. สองแถวต่อบรรทัด ต้นกล้า
มีปลูกอยู่ภายใต้แสงธรรมชาติที่ 25  1 องศาเซลเซียสในบ้านสีเขียว ในขั้นตอนใบ 1.5-2, ต้นกล้ากล่องมี
โอนเข้ากรงปกคลุมด้วยตาข่ายไนลอนแล้ว
เจ็ด (2-3 วัย) ขนาดเล็กนางไม้เพลี้ยกระโดดสีน้ำตาล
ถูกวางไว้ในแต่ละต้นกล้า มีสามซ้ำ
สำหรับแต่ละพันธุ์และสายมี.
จำนวนของแมลงในแต่ละต้นกล้านับ
24 ชั่วโมงหลังจากการรบกวน,และจากนั้นก็แยกย้ายกันไปอย่างสม่ำเสมอในต้นกล้า
หลังจากการนับทุกวัน ค่าเฉลี่ยของจานวนของแมลงในแต่ละบรรทัดที่คำนวณได้และถือว่าเป็นค่า
antixenosis หลังวันที่ 5 คะแนน.

antibiosis ทดสอบไม่มีสี 7 ซม. เส้นผ่าศูนย์กลางและ 17 ซม. ถ้วยแก้วสูงถูก
ที่ใช้ในการทดลองนี้ การแก้ปัญหาความร้อน (30 มล. ) มีไอเอ็นจี 1 กรัมวุ้นชั่วโมง 100 ml
2
o และ 15 มิลลิวินาทีมิลลิลิตรถูกเทลงใน
แต่ละถ้วยและ 5 เมล็ดงอกถูกนำมาปลูกหลังจาก
วัฒนธรรมกลางได้ระบายความร้อนด้วย มีสามซ้ำ
สำหรับแต่ละพันธุ์และสาย ต้นกล้าที่ปลูกในเรือนกระจก
ที่ 25  1 องศาเซลเซียสภายใต้แสงธรรมชาติ.
ในขั้นตอนใบ 1.5-2 30 เพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลขนาดเล็ก
นางไม้ (วัย 2-3) ถูกวางไว้ในแต่ละต้นกล้า
ในแต่ละถ้วยซึ่งเป็น ปกคลุมด้วยไนลอนสุทธิ
ความอยู่รอดของนางไม้ในแต่ละถ้วยที่ถูกบันทึกไว้ในแต่ละวันสำหรับ
10 วันและรอดตายเฉลี่ยของแมลงในแต่ละบรรทัด
ที่คำนวณได้และถือว่าเป็นค่า antibiosis.

การวิเคราะห์ทางสถิติการวิเคราะห์ทางสถิติของข้อมูลที่ได้รับการดำเนินการโดยใช้หนึ่งในการวิเคราะห์และ ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญถูกระบุ
โดยการทดสอบ LSD ที่พี 0.05 การใช้ Excel เวอร์ชั่น 2003 และ
สถิติ spss เวอร์ชั่น 17.0 c
2
การทดสอบได้รับการดำเนินการเพื่อตรวจสอบความดี
พอดีระหว่างความคาดหวังของเมนเดล
อัตราส่วนและข้อมูล SSR และฟีโนไทป์.

สกัดดีเอ็นเอ 2-300 มิลลิกรัมใบสดของแต่ละ f2and bc1
พืช (และผู้ปกครอง) ถูกเก็บรวบรวมและนำก่อน ระบายความร้อนด้วย
ปูน ไนโตรเจนเหลวถูกบันทึกและเนื้อเยื่อที่ถูก
พื้นดินเป็นผงดีกับสากและโอนเข้า
2.0 มล. Eppendorf หลอด;600 มล. ของบัฟเฟอร์สกัด (100 มิลลิเมตร
tris-hcl ph 8.0, 50 มล. EDTA-na2
, 500 มม. NaCl 1.25%
sds) มีการเพิ่มและหลอด Eppendorf และผสม ture ก็หดหาย หลอดถูกบ่มใน 65 ° c
อาบน้ำเป็นเวลา 30 นาทีและเขย่า 3-4 ครั้งจน sam-ple หันสีเขียวลึก หนึ่งร้อยมิลลิลิตร KAC (5 ลิตรโมเลกุล
21
)
การแก้ปัญหาคือการเพิ่มหดหายและบ่มบนน้ำแข็ง
30 นาที;300-400 มิลลิลิตรของคลอโรฟอร์ม: isoamyl แอลกอฮอล์
(24:1) การแก้ปัญหาคือการเพิ่มและการเขย่าที่ 120 รอบต่อนาทีกับ 30 นาที
; การปั่นแยกทำที่ 12 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที,
และ 200 มล. ของการแก้ปัญหาน้ำที่ด้านบนเป็น
โอนไป Eppendorf หลอดใหม่ 400 มล. ของแช่เย็น 99.9% เอทานอล
(220 องศาเซลเซียส) ได้รับการเพิ่มและการบ่มที่อุณหภูมิ 220 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที
ปั่นแยกทำที่ 12 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที;ซุปเปอร์ Natant วและล้างด้วยแอลกอฮอล์ 70% ให้แห้ง
hereditas 000 (2011) ตำแหน่งลักษณะที่เกี่ยวข้องกับความต้านทานเพลี้ยกระโดดในข้าว 3
ตารางที่ 1 การตอบสนองของพ่อแม่พันธุ์และการควบคุมเพลี้ยกระโดดสีน้ำตาล
ขนาดเล็ก หกสิบต้นกล้าถูกนำมาใช้ในการทดสอบแต่ละ
ชั่วโมง - ทนสูง HS -. ไวต่อการตอบสนองสูง
ความหลากหลาย (หมายถึง se) คำอธิบาย
rathu heenati 1.2  0.12 ชั่วโมง
mudgo 15  0.20 ชั่วโมง
02428 8.5  0.20 HS
wuyujing 3 8.3  0.24 HS
มะเดื่อ การกระจาย 1a-c.frequency ของความต้านทานใน sbph 02428 / RH f2
ประชากร (ก) การตรวจคัดกรองต้นกล้ากล่อง (ข) antixenosis
ทดสอบ. (ค) การทดสอบ antibiosis
dna dna เป็นอีกครั้งที่ระงับและละลายใน
100 มิลลิลิตรเต, และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศา c.
การขยายของไมโครและการตรวจสอบ

polymorphismเครื่องหมาย SSR และลำดับจีโนมที่ได้รับจากฐานข้อมูล
gramene ( www.gramene.org/marker/
index.html ) (mccouchet อั. 2002) การวิเคราะห์ SSR ได้รับการดำเนินการดังต่อไปนี้
ขั้นตอนของอัล chenet (1997)
มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย amplifications ได้ดำเนินการใน
10 มล. ระบบที่มี 10 มิลลิโมลต่อลิตร

21 tris-hcl ph 8.3,
50 มิลลิโมลต่อลิตร

21 kcl 1.5 mmol L21

MgCl2 50 มิลลิโมล L21

ของแต่ละ dntp, 02 มิลลิโมล L21
แต่ละไพรเมอร์, 0.5-u taqpoly merase (TAKARA, Dalian) และ 20 ng ของแม่ dna,
ใช้ Cycler ร้อน PTC-200 โปรแกรมที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที
ตามด้วย 34 รอบ 30 วินาที ที่ 94 ° C, 30 วินาทีที่ 55 ° C,
40 s ที่ 72 องศาเซลเซียสและนามสกุลสุดท้ายของ 10 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส
ผลิตภัณฑ์ dna ขยายได้ electrophoresed 8%
polyacylamide เจลไม่เสียสภาพ 0.5 บัฟเฟอร์ TBE
และการตรวจจับที่ทำโดยวิธีการย้อมสีเงิน
(sanguinettiet อั. 1994) วงถูกยิงบน
กล่องไฟไฟกับหลอด.
SSR การทำแผนที่และการตรวจสอบ QTL
กลุ่มการเชื่อมโยงที่ถูกประกอบโดยใช้ mapmarker
3.0 ซอฟต์แวร์ที่คะแนน LOD ของ 3.0 (lincolnet al.1992)
qtls ถูกตรวจพบโดยการทำแผนที่ประกอบช่วง
(CIM) โดยใช้หน้าต่าง QTL แผน 2

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธีการและวัสดุ
พืชวัสดุ
Indicavariety Mudgo และ Japonicavariety Wuyujing 3
ถูกใช้เป็นตัวควบคุมทน และไวต่อ respec-tively แม็ปประชากร 162 F
2and 150 BC1
พืช
ซึ่งขนไหม้ 02428 02428 และ
(RH) Rathu Heenati / Rathu Heenati / / 02428
BC1 ละ F2and
บุคคลที่ปฏิสนธิด้วยตนเองรับ
ชุด F
2:3and BC1F2
บรรทัด
Planthoppers เล็กสีน้ำตาล
ประชากรเพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลขนาดเล็กที่ใช้ในการศึกษา
ถูกรวบรวมจากข้าวในหนานจิง และรักษา
ในข้าวสาลีสำหรับรุ่นสี่ก่อนการโอนย้ายไป
ข้าว Wuyujing 3 สภาวะเรือนกระจกที่จิง
มหาวิทยาลัยเกษตร แมลงได้ยืนยัน
ไม่ใช่-viruliferous โดยวิเคราะห์จุด immunobinding และ PCR
ตรวจ (Qinet al. 1994) .
การประเมินความต้านทาน SBPH
ปรับปรุงกล่องมาตรฐานแหล่งตรวจทดสอบ (SSST)
ดินถูกถ่ายโอนไปถ้วยพลาสติกเส้นผ่าศูนย์กลาง 8 ซม. และ
9 ซม.ความสูงด้วยและหลุมในฐาน เมล็ดพันธุ์ทั้งหมด
germinated ที่ 30 องศาเซลเซียส สามสิบ germinated เมล็ดต่อ
F2:3or BC1F2
บรรทัดถูกปลูกในดิน ยี่สิบแปด
ถ้วย รวมทั้งทน และไวต่อการควบคุมพันธุ์,
สุ่มไว้ใน 65  44  14 ซม.พลาสติก
แหล่งกล่องและเก็บไว้ในน้ำลึก 2 ซม. มี
3 เหมือนกับสำหรับ cultivar และแต่ละบรรทัด มีกล้าไม้
ปลูกในเรือนกระจกภายใต้แสงธรรมชาติและการระบายอากาศ
25  1 ° C.
nymphs เพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลขนาดเล็ก 15 ต่อโรงงาน
(instars 2 และ 3) ใส่ในแต่ละแหล่งที่
1.5–2 ใบระยะ คะแนนเสร็จเมื่อประมาณ
เสียชีวิต 90% ของกล้าไม้ Wuyujing 3 แต่ละบรรทัดหรือวารี ety กำหนดให้คะแนนเป็นตัวเลขระหว่าง 0 ถึง 9
ต่อระบบประเมินมาตรฐานใช้ที่ IRRI
(1988) มีค่าเฉลี่ยของ replicates สามเป็น
เสียคะแนน
Antixenosis ทดสอบ
เมล็ดเปลือกงอก 15 สำหรับแต่ละบรรทัดถูกหว่านในดิน
ในแหล่งพลาสติกกล่อง สองแถวสำหรับแต่ละบรรทัด กล้าไม้
ได้เติบโตขึ้นภายใต้แสงธรรมชาติที่ 25  1° C ในบ้านเขียว ในระยะใบ 1.5–2 กล่องแหล่งถูก
เป็นกรงที่ปกคลุม ด้วยตาข่ายไนลอน แล้ว
nymphs เพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลขนาดเล็ก (2nd–3rd instar) 7
ถูกวางในแต่ละแหล่ง มีสาม replicates
สำหรับแต่ละ cultivar สาย
ถูกนับจำนวนแมลงในแต่ละแหล่ง
24 ชมหลังจากทำลาย แล้ว กระจายเท่า ๆ กันระหว่าง
กล้าไม้หลังจากการตรวจนับทุกวัน คำนวณ และถือว่าเป็นการเฉลี่ย num ber ของแมลงแต่ละบรรทัด
antixenosis ค่าหลังจาก 5 วันคะแนน
Antibiosis ทดสอบ
7 สีซีดซมเส้นผ่าศูนย์กลางและ 17 เซนติเมตรแก้วสูงถ้วยถูก
ใช้ในการทดลองนี้ โซลูชันร้อน (30 ml), ing ประกอบด้วย 1 g agar, 100 ml H
2
15 ml MS และ O มี poured เป็น
แต่ละถ้วย และมีปลูกเมล็ดพืชเปลือกงอก 5 หลังจาก
สื่อวัฒนธรรมมีระบายความร้อนด้วย มีสาม replicates
สำหรับ cultivar และแต่ละบรรทัด กล้าไม้ที่ปลูกใน
เรือนกระจกที่ 25  1° C ภายใต้แสงธรรมชาติ
ในขั้น 1.5–2 ใบ เพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลขนาดเล็ก 30
nymphs (2nd–3rd instar) ใส่ในแต่ละแหล่ง
ในแต่ละถ้วยที่ถูกปกคลุม ด้วยไนลอนสุทธิไปแล้ว ใน
อยู่รอดของ nymphs ในถ้วยแต่ละถูกบันทึกแต่ละวัน
10 วัน และรอดตายเฉลี่ยของแมลงแต่ละบรรทัด
คำนวณ และถือว่าเป็นค่า antibiosis
วิเคราะห์สถิติ
ดำเนินการวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว และระบุความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ
โดยทดสอบ LSD ที่ P  0.05 ใช้ไม่ Excel 2003 และ
ไม่โปรแกรมสถิติ 17.0 c
2
-ดำเนินการทดสอบ
ตรวจความกตัญญูพอดีระหว่างคาด Mendelian
อัตราส่วนก SSR และ phenotype ข้อมูล
สกัดดีเอ็นเอ
สดสองสามร้อยมิลลิกรัมใบของแต่ละ BC1 F2and
พืช (และครอบครัว) ได้รวบรวม และเก็บในที่เย็น ๆ ก่อน
ปูน เพิ่มไนโตรเจนเหลว และเนื้อเยื่อถูก
ดินดีโรย ด้วย pestle และโอนย้ายไป
2.0 ml หลอด Eppendorf 600 ml สกัดบัฟเฟอร์ (100 มม.
ทริสเรทติ้ง HCl pH 8.0, 50 มิลลิลิตร EDTA Na2
, 500 มม. NaCl, 1.25%
SDS) เพิ่ม และหลอด Eppendorf และผสม-ture homogenized ถูก หลอดถูก incubated ใน 65° C
อาบน้ำ 30 นาทีและ 3-4 หวั่นไหวเวลาจนเปิ้ลสามเปิดลึกสีเขียว Ml หนึ่งร้อยของ KAC (5 โมล l
21
)
โซลูชันเพิ่ม homogenized และ incubated บนน้ำแข็ง
สำหรับ 30 นาที ml 300–400: isoamyl คลอโรฟอร์มแอลกอฮอล์
(24:1) โซลูชันเพิ่ม และเขย่าที่ 120 รอบต่อนาทีสำหรับ
30 นาที centrifuging เสร็จที่ 12 000 rpm สำหรับ 5 นาที,
และมีการโอนย้าย 200 ml ของละลายที่ด้านบน
กับหลอด Eppendorf ใหม่ 400 ml ของเอทานอ 99.9% เย็นเพิ่ม และ incubated ที่ 220° C สำหรับ 20 นาที
(220°C)
Centrifuging เสร็จที่ 12 000 rpm สำหรับ 5 นาที natant เตอร์รุ่น decanted และล้าง ด้วยแอลกอฮอล์ 70% ให้แห้งการ
Hereditas 000 loci ติด (2011) ที่เกี่ยวข้องกับความต้านทานต่อเพลี้ยกระโดดในข้าว 3
1 ตาราง การตอบสนองของพ่อแม่และสายพันธุ์ควบคุมการ
เพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลขนาดเล็ก ใช้กล้าไม้หกใน
ทดสอบแต่ละรายการ HR - สูงทน HS - ไวมากต่อ
อธิบายการตอบสนองต่าง ๆ (หมายถึง SE)
 Rathu Heenati 1.2 0.12 HR
Mudgo 15  0.20 HR
 02428 8.5 0.20 HS
Wuyujing 3 8.3  0.24 HS
Fig. 1a–c.Frequency กระจายต้าน SBPH ใน F2 02428 / RH
ประชากร (ก) แหล่งกล่องตรวจทดสอบ (ข) antixenosis
ทดสอบ (ค) antibiosis test.
ดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอถูกหยุดชั่วคราวอีก และละลายใน
100 ml ของ TE และจัดเก็บที่ 4 ° C.
ขยาย microsatellites และตรวจ
โพลิมอร์ฟิซึม
รับเครื่องหมาย SSR และลำดับ genomic
จากฐานข้อมูล Gramene ( www.gramene.org/ marker/
index.html) ได้วิเคราะห์ SSR (mccouchet al. 2002)
ทำตามกระบวนการของ Chenet al. (1997)
มีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ดำเนิน amplifications
ในระบบ 10 ml ประกอบด้วย 10 mmol l
21
ทริสเรทติ้ง HCl pH 8.3,
50 mmol l
21
KCl, 1.5 mmol l21
MgCl2
, 50 mmol l21
ของ
ละ dNTP, 02 mmol l21
ของไพรเมอร์ 0.5 U Taqpoly-merase (TaKaRa ต้าเหลียน) และ 20 ng ของดีเอ็นเอต้นแบบ,
ใช้ cycler ร้อน PTC 200 โปรแกรมที่ 95° C สำหรับ
5 นาที ตาม ด้วยรอบ 34 30 s ที่ 94° C, 30 s ที่ 55° C,
40 s 72° C และส่วนขยายสุดท้าย 10 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส
ผลิตภัณฑ์ DNA เอาต์มี electrophoresed บน 8%
polyacylamide ไม่ใช่-denaturing gels ในบัฟเฟอร์ TBE  0.5
และ detections ทำ โดยวิธีย้อมสีเงิน
(sanguinettiet al. 1994) วงได้คะแนนในการ
กล่องไฟสว่าง ด้วยหลอดฟลูออเรสเซนต์
SSR แม็ปและตรวจพบ QTL
กลุ่มเชื่อมโยงถูกรวบรวมโดยใช้ MAPMARKER
3.0 ซอฟต์แวร์ที่คะแนนการลอด 3.0 (LincoLnet al.1992)
QTLs พบ โดยรวมช่วงที่แมปโดยใช้ Windows QTL Cartographer 2
(CIM)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุวิธีการและวัสดุ

indicavariety mudgo โรงงานและ japonicavariety wuyujing 3
ได้ถูกนำมาใช้ในการควบคุมและทนต่อหลุมพราง respec - tively การจับคู่ประชากร 162 F
2 และ 150 bc 1

มีพันธุ์ไม้ที่ได้จากการของ 02428 และ rathu heenati
( RH )และที่ backcross 02428 / rathu heenati // 02428 ;
แต่ละ F 2 และ bc 1
แบบเฉพาะรายเป็นแบบบริการตัวเอง - ปุ๋ยเพื่อขอรับ

ชุด F 2 : 3 และ bc 1 F 2
สาย.
ขนาดเล็กสีน้ำตาล planthoppers
ที่ขนาดเล็กสีน้ำตาล planthopper ประชากรใช้ในการศึกษา
ถูกเก็บรวบรวมจากข้าวฟิลด์ใน Nanjing และได้รับการดูแลรักษาเป็นอย่างดี
ข้าวสาลีสำหรับสี่รุ่นก่อนที่จะถูกส่งไปยัง
ข้าว wuyujing 3 ในโรงเรือนเงื่อนไขที่ Nanjing
เกษตรมหาวิทยาลัย. แมลงที่มีการยืนยันการเป็น
ไม่ใช่ - viruliferous โดยจุด( dot - immunobinding สอบและ pcr
การตรวจจับ( qinet ที่ al . 1994 )..
การประเมินผลของการทดสอบ sbph สรรหางอกจากเมล็ด - ช่องทำเครื่องหมายมาตรฐานการต่อต้าน
ซึ่งจะช่วยแก้ไขได้( ssst )
ดินก็จะพาท่านไปส่งถึงถ้วยพลาสติกขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 8 ซม.และ 9 ซม.
ในความสูงที่มีและมีหลุมที่อยู่ในฐาน เมล็ดพันธุ์ทั้งหมดเป็นคน
germinated ที่ 30 ° C สามสิบเมล็ดพันธุ์ germinated ต่อสาย
F 2 : 3 หรือ bc 1 F 2
ก็ปลูกในดิน ยี่สิบแปด
ถ้วยรวมถึงความหลากหลายและทนต่อการควบคุมได้ง่ายสัญลักษณ์
ถูกนำมาใส่ไว้ใน 65  44  14 ซม.พลาสติก
งอกจากเมล็ด - กล่องและได้รับการดูแลรักษาให้อยู่ในน้ำลึก 2 ซม.แบบสุ่ม มี
สามหาดจอมเทียนสำหรับ cultivar แต่ละตัวและบรรทัด ต้นไม้แคระมี
ปลูกในโรงเรือนที่อยู่ ภายใต้ แสงธรรมชาติช่วยระบายอากาศและ
เงื่อนไขที่ 25  1 ° C .
สิบห้าขนาดเล็กสีน้ำตาล planthopper พื้นที่หลายนิ้วต่อโรงงาน
( 2 และ 3 instars )จะถูกจัดวางในแต่ละงอกจากเมล็ดที่
1.5 - 2 ใบเวที.การให้คะแนนการทำได้เมื่อประมาณ
90% ของ 3 ต้นไม้แคระ wuyujing ได้ตายไปแต่ละสายหรือแยกกำลังไฟ - ety ถูกมอบหมายให้คะแนนเป็นตัวเลขระหว่าง 0 และ 9
ต่อไปนี้ระบบการประเมินมาตรฐานที่ใช้ในวิธี เทคโนโลยีชีวภาพ
( 1988 ) มอบความคุ้มค่าของสามหาดจอมเทียนเป็นเมล็ดพันธุ์
ความเสียหายคะแนน.

การทดสอบ antixenosis สิบห้า germinated ที่ต่อสายดินได้หว่าน
ในพลาสติกงอกจากเมล็ด - กล่องโต้ตอบสองแถวต่อสาย ต้นไม้แคระ
โตขึ้น ภายใต้ แสงจากธรรมชาติที่ 25  1 ° C ในสีเขียว - บ้าน ที่เวทีใบ 1.5 - 2 ที่งอกจากเมล็ด - กล่องถูก
โอนเข้ากรงคลุมด้วยตาข่ายไนลอนแล้ว
เจ็ด( 2 - 3 instar )ขนาดเล็กสีน้ำตาล planthopper พื้นที่หลายนิ้ว
ในแต่ละงอกจากเมล็ด มีสามหาดจอมเทียน
สำหรับแต่ละสายและ cultivar .
หมายเลขของแมลงที่งอกจากเมล็ดแต่ละนับเป็น
24 ชั่วโมงหลังจากติดและแล้วก็แยกย้ายกันไปอย่างทั่วถึงท่ามกลางต้นไม้แคระ
หลังจากการนับทุกวัน. โดยเฉลี่ย num - เหาะของแมลงในแต่ละสายจะคำนวณและได้รับการปฏิบัติในฐานะที่เป็น
ที่ antixenosis มูลค่าหลังจาก 5 วันการทำประตู.

antibiosis การทดสอบ 7 ซม.ไม่มีสีและเส้นผ่านศูนย์กลาง 17 ซม.สูงถ้วยแก้วเป็น
ใช้ในนี้เป็นการทดลอง. โซลูชันแบบร้อนที่( 30 มล.)สาหร่ายทะเลมี - ไอเอ็นจีประกันชีวิต 1 G MS 100 มล. H

o 2 และ 15 มล.เป็นเทลงใน
ถ้วยและ 5 germinated เมล็ดพันธุ์ปลูกอยู่หลังขนาดกลาง
วัฒนธรรมที่มีความร้อน มีสามหาดจอมเทียน
สำหรับสายและ cultivar แต่ละห้อง ต้นไม้แคระได้เติบโตใน
โรงเรือนที่ 25  1 ° C ภายใต้ แสงธรรมชาติ.
ที่ 1.5 - 2 ใบเวที, 30 ขนาดเล็กสีน้ำตาล planthopper
พื้นที่หลายนิ้ว (2nd- 3 instar )จะถูกจัดวางในแต่ละงอกจากเมล็ด
ในแต่ละถ้วยซึ่งก็อยู่ในข่ายไนลอน. สัญลักษณ์
ความอยู่รอดของแต่ละพื้นที่หลายนิ้วในถ้วยถูกบันทึกไว้แต่ละวันสำหรับ
10 วันและโดยเฉลี่ยความอยู่รอดของแมลงในแต่ละสาย
จะคำนวณและได้รับการปฏิบัติในฐานะที่ antibiosis มูลค่า.

ทางสถิติวิเคราะห์เชิงสถิติการวิเคราะห์ข้อมูลนั้นดำเนินการโดยใช้ทาง anova และที่สำคัญความแตกต่างกันได้รับการระบุว่า
โดย lsd การทดสอบที่ P  0.05 โดยใช้ Excel เวอร์ชัน 2003 สถิติ
spss และเวอร์ชัน 17.0 . c
2
- การทดสอบก็ทำการ
ตรวจสอบที่ดีในความเหมาะสมระหว่างคาดว่าอย่างเมนเด็ล
อัตราส่วนและ SSR และข้อมูลก.

ซึ่งจะช่วยสกัดดีเอ็นเอสองถึงสามร้อยมก.สดของแต่ละ F 2 และ bc 1
โรงงาน(และพ่อแม่)ได้จากการเก็บข้อมูลและวางไว้ในที่ที่ทำความเย็น
ปูน. ไนโตรเจนเหลวจะถูกเพิ่มและเนื้อเยื่อที่ถูก
ล่างเป็นผงชั้นดีพร้อมด้วยตะลุมพุกและจะพาท่านไปส่งยัง
2.0 ท่อดูดฝุ่น eppendorf มล.ได้600 มล.ของการขุด Buffer ( 100 มม.
บริษัททริสเรทติ้ง - HCL / ph 8.0 , 50 มล. edta - นา 2
, 500 มม. NaCl , 1.25%
เซิร์ฟเวอร์ SDS )จึงได้มีการเพิ่มและการที่ eppendorf ท่อดูดฝุ่นและผสมให้เข้ากันแบบสดพร่องมันเนยเป็นก็จะมอง. ท่อดูดฝุ่นที่เป็น incubated ใน 65 ° C
อ่างน้ำสำหรับ 30 นาทีและเขย่า 3-4 3-4 3-4 ครั้งจนกว่าสาม - PLE ที่เปลี่ยนเป็นสีเขียวเข้ม หนึ่งร้อยมล. KAC ( 5 L Website : www . mol
21
)
โซลูชันถูกเพิ่มและสดพร่องมันเนยเป็น incubated บนน้ำแข็ง
สำหรับ 30 นาที300 - 400 มล.ในยุคต้นๆ: isoamyl แอลกอฮอล์
( 24 : 1 )โซลูชันถูกเพิ่มและเขย่าที่ 120 รอบต่อนาทีสำหรับ
30 นาที; centrifuging ทำได้ที่ 12 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที,
และ 200 มล.ของโซลูชันที่เกิดจากน้ำที่อยู่ด้านบนได้ถูกโอนไป
ใหม่ eppendorf ท่อ; 400 มล.ของสดแช่เย็น 99.9% เอทานอล
( 220 ° C )ได้ถูกเพิ่มลงและ incubated ที่ 220 ° C สำหรับ 20 นาที
centrifuging ทำได้ที่ 12 , 000 รอบต่อนาทีสำหรับ 5 นาที;เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ Super - natant decanted และล้างด้วย 70% ไว้ให้แห้ง
hereditas ที่ 000 ( 2011 ) สภาพ ลักษณะที่เกี่ยวข้องกับการต่อต้าน planthopper ในข้าว 3
ตารางที่ 1 . การตอบกลับของความหลากหลายและการควบคุมพ่อแม่ผู้ปกครองจะ
planthopper สีน้ำตาลขนาดเล็ก. หกสิบต้นไม้แคระถูกใช้ใน
การทดสอบแต่ละครั้ง เฉพาะรุ่น HR - สูงทนต่อแรงกระแทก HS - ได้รับผลกระทบเป็นอย่างสูง.การตอบสนอง
ความหลากหลาย(หมายถึง SE )คำอธิบาย
rathu heenati 1.2  0.12 ชม.
mudgo 1 .5  0.20 ชม.
02428 8.5  0.20 HS
wuyujing 3 8.3  0.24 HS
รูป. 1 การกระจายความถี่ - C ในการต่อต้าน sbph ใน 02428 ที่ประชากร F 2
rh. (ก)การทดสอบการตรวจคัดกรองงอกจากเมล็ด - box ( B ) antixenosis
การทดสอบ( C )การทดสอบ antibiosis .
ดีเอ็นเอ. ดีเอ็นเอที่เป็นอีกครั้งที่ถูกระงับชั่วคราวและละลายในมล.
100 ของ Te และจัดเก็บไว้ที่ 4 ° C
การขยายสัญญาณเสียงในการตรวจจับและ microsatellites ของ

polymorphismทำเครื่องหมาย SSR และซีเควนซ์ genomic ได้
จากฐานข้อมูล gramene ( www . gramene.org/marker/
index.html) ( mccouchet al . 2002 )การวิเคราะห์ SSR เป็น
ดำเนินการตามขั้นตอนของ chenet al . ( 1997 )
พร้อมด้วยการเปลี่ยนแปลงแก้ไขเล็กน้อย. amplifications นั้นดำเนินการ
ในที่ 10 มล.ระบบประกอบด้วย 10 มิลลิโมล L

บริษัททริสเรทติ้งจำกัด 21 - HCL / ph 8.3 ,
50 มิลลิโมล L

kcl 21 , 1.5 มิลลิโมล L 21
mgcl 2
, 50 มิลลิโมล L 21

แต่ละของ dntp , 0 .2 มิลลิโมล L 21
แต่ละ primers , 0.5 U taqpoly - merase ( takara ,เมืองต้าเหลียน)และ 20 ไนจีเรียของดีเอ็นเอเทมเพลต,
การใช้ที่ PTC Model XT - 200 ความร้อน cycler ตั้งโปรแกรมที่ 95 ° C สำหรับ
5 นาที,ตามด้วย 34 รอบ 30 S ที่ 94 ° C , 30 S ที่ 55 ° C ,
40 S ที่ 72 ° C และสุดท้ายการขยาย 10 นาทีที่ 72 ° C
สินค้าดีเอ็นเอแอมพลิฟายเป็น electrophoresed บน 8%
polyacylamide ไม่ denaturing ผลิตภัณฑ์ ประเภท แวกซ์,เจลใน 0.5 บัฟเฟอร์ tbe
และตอบรับก็เป็นเหตุที่ทำให้เกิดรอยเปื้อนควรสีเงินโดยวิธี
( sanguinettiet al . 1994 ) คลื่นความถี่ที่มีคะแนนในช่องทำเครื่องหมาย
แสงที่มีแสงสว่างที่เหมาะสมพร้อมด้วยหลอดฟลูออเรสเซนต์หลอดไฟ.แผนที่
SSR และกลุ่มการตรวจจับ
การเชื่อมโยง qtl ได้ถูกนำมารวมกันโดยใช้ mapmarker
3.0 ซอฟต์แวร์ที่คะแนนเก่าของ 3.0 ( lincolnet Al 1992 )
qtls ถูกตรวจพบโดยคอมโพสิตช่วงเวลาการทำแผนที่
( CIM )โดยใช้ Windows qtl นักเขียนแผนที่ 2