2.5. Microbiological analyses 2.5.1

2.5. Microbiological analyses
2.5.1. Total microbial abundance, cell viability, dehydrogenase activity Total microbial abundance (N. cell/g soil) was measured by the epifluorescence direct count method, using DAPI (40,6-diamidino- 2-phenylindole) as the DNA fluorescent dye. The DAPI method is able to detect all the microbial cells in a sample whatever their physiological state and metabolic activity and for this reason is suitable for total microbial counts [48]. At day 420 three soil (rhizosphere) or composite subsamples (1 g each) were analysed for each experimental plot considered in the study (Rhizosphere, A, B, C, D soil). At day 0, topsoil (0–20 cm) only was used for microbiological analyses. All samples were immediately trans-ferred into a fixed solution containing 1.5% formaldehyde and 0.5% Tween 20. After shaking, the suspension was left for 24 h to allow larger particles to settle out. DAPI was then added to an aliquot of the supernatant (30 min in the dark at 4 _C) and subsequently the solution was filtered through a 0.2 mm polycarbonate filter. The microbial cells were counted under a Leica DM 4000 B fluorescence microscope (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany) [48]. Similarly, in order to estimate cell viability (% live cells/ live + dead), three sub-sample replicates (1 g each) of fresh soil were analysed for each plot considered in the study (Topsoil for t = 0 days; Rhizosphere, A, B, C and D soil for t = 420 days). Two fluorescent dyes, SYBR Green II and propidium iodide (Sigma– Aldrich, Germany), were used to distinguish viable (green) and dead (red) cells under the fluorescence microscope (Leica DM 4000B Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany), as reported previously [49–51]. This method makes it possible to assess microorganism viability because the red propidium iodide can only enter cells that are dead or damaged (which could be detected by DAPI stain because DNA has a relatively high stability). Finally, three other soil sub-samples (5 g each) were collected from each plot to analyse microbial dehydrogenase activity (Topsoil for t = 0 days; Rhizosphere, A, B, C and D soil for t = 420 days). Dehydrogenase activity is a good indicator for evaluating the status and functioning of soil microbial communi-ties, as it reflects microbial respiration rate, which providesinformation on the active portion of the soil microbial community [49,52]. This method is based on extraction and colorimetric determination of the intensely coloured 2,3,5-triphenyl formazan (TPF) produced from the reduction of colourless 2,3,5-triphenylte- trazoliumchloride (TTC) in soil samples 24 h after an incubation at 37 _C in the dark [49,52]. Soil dehydrogenase activity was expressed as mg TPF/g dry soil.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5. จุลินทรีย์วิเคราะห์ 2.5.1. รวมความอุดมสมบูรณ์ของจุลินทรีย์ เซลล์ชีวิต กิจกรรมพร่องรวมจุลินทรีย์มากมาย (ดิน N. เซลล์/g) โดยวัดจากวิธีการนับโดยตรง epifluorescence ใช้สีย้อมดีเอ็นเอเรืองแสง DAPI (40,6-diamidino-2-phenylindole) วิธี DAPI สามารถตรวจพบเซลล์จุลินทรีย์ทั้งหมดในตัวอย่างไม่ว่าสถานะทางสรีรวิทยาและกิจกรรมการเผาผลาญ และด้วยเหตุนี้จึงเหมาะสำหรับการนับจำนวนจุลินทรีย์ทั้งหมด [48] วัน 420 สามดิน (ไรโซสเฟียร์) หรือ subsamples คอมโพสิต (1 g) ถูกนำมาวิเคราะห์สำหรับพล็อตแต่ละทดลองพิจารณาในการศึกษา (ไรโซสเฟียร์ A, B, C, D ดิน) วันที่ 0 ชั้นดิน (0-20 เซนติเมตร) เท่านั้นถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยามาก ตัวอย่างทั้งหมดได้ทันทีทรานส์-ferred เป็นการแก้ปัญหาถาวรที่ประกอบด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ 1.5% และ 0.5% แต่ 20 หลังจากสั่น ช่วงล่างซ้ายใน 24 ชมเพื่อให้อนุภาคขนาดใหญ่การทำให้ ส่วนลงตัวของ supernatant (30 นาทีในมืดที่ 4 _C) แล้วถูก DAPI และต่อมามีโซลูชันที่ถูกกรองผ่านตัวกรองโพลีคาร์บอเนต 0.2 mm เซลล์จุลินทรีย์นับภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงไล DM 4000 B (ไลก้า Microsystems GmbH, Wetzlar เยอรมนี) [48] ในทำนองเดียวกัน เพื่อให้ประเมินศักยภาพเซลล์ (เซลล์สด%/ สด + ตาย), สามตัวอย่างย่อย replicates (1 g) ของดินสดถูกนำมาวิเคราะห์สำหรับพล็อตแต่ละพิจารณาในการศึกษา (ชั้นดินสำหรับ t = 0 วัน ไรโซสเฟียร์ A, B, C และ D ดินสำหรับ t = 420 วัน) สองสีเรืองแสง SYBR Green II และไอโอไดด์ propidium (Sigma-Aldrich เยอรมัน), ใช้เพื่อแยกการทำงาน (สีเขียว) และตาย (สีแดง) เซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (ไลก้า DM 4000B ไล Microsystems GmbH, Wetzlar เยอรมนี), ตามรายงานก่อนหน้านี้ [49 – 51] วิธีนี้ทำให้สามารถประเมินศักยภาพของจุลินทรีย์เนื่องจากไอโอไดด์ propidium สีแดงสามารถป้อนได้เฉพาะเซลล์ที่ตาย หรือเสียหาย (ซึ่งอาจตรวจพบโดยการย้อม DAPI เนื่องจากดีเอ็นเอมีความเสถียรค่อนข้างสูง) ในที่สุด สามดินย่อยตัวอย่างอื่น ๆ (5 g) ได้รวบรวมจากพล็อตแต่ละการวิเคราะห์กิจกรรมของจุลินทรีย์พร่อง (ชั้นดินสำหรับ t = 0 วัน ไรโซสเฟียร์ A, B, C และ D ดินสำหรับ t = 420 วัน) พร่องกิจกรรมเป็นตัวบ่งชี้ที่ดีสำหรับประเมินสถานะ และการทำงานของดินจุลินทรีย์ปพลิเนคไท สะท้อนถึงอัตราการหายใจจุลินทรีย์ providesinformation ซึ่งในส่วนงานของชุมชนจุลินทรีย์ดิน [49,52] วิธีนี้ขึ้นอยู่กับการดูดและการกำหนดสีของสีเข้มข้น 2,3,5-triphenyl formazan (TPF) ผลิตจากการลดลงของสีใส 2,3,5-triphenylte-trazoliumchloride (TTC) ในดินตัวอย่าง 24 ชม.หลังจากการบ่มที่ 37 _C ในมืด [49,52] กิจกรรมดินพร่องถูกแสดงเป็นมิลลิกรัม TPF/g ดินแห้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.5 จุลชีววิทยาวิเคราะห์
2.5.1 รวมความอุดมสมบูรณ์ของจุลินทรีย์มีชีวิตเซลล์ dehydrogenase กิจกรรมรวมความอุดมสมบูรณ์ของจุลินทรีย์ (เอ็นเซลล์ / g ดิน) โดยวัดจาก epifluorescence วิธีการนับโดยตรงโดยใช้ DAPI (40,6-diamidino- 2 phenylindole) เป็นสีย้อมดีเอ็นเอเรืองแสง วิธี DAPI สามารถที่จะตรวจสอบได้ทุกเซลล์ของจุลินทรีย์ในตัวอย่างสิ่งที่รัฐและการเผาผลาญกิจกรรมทางสรีรวิทยาของพวกเขาและด้วยเหตุผลนี้เหมาะสำหรับการนับจำนวนจุลินทรีย์ทั้งหมด [48] ในวันที่สาม 420 ดิน (ราก) หรือ subsamples คอมโพสิต (1 กรัม) สำหรับการวิเคราะห์แต่ละแปลงทดลองการพิจารณาในการศึกษา (บริเวณราก, A, B, C, D ดิน) ในวันที่ 0, ดิน (0-20 ซม.) เท่านั้นที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยา ตัวอย่างทั้งหมดถูก Trans-ferred ทันทีในการแก้ปัญหาที่มีคงที่ 1.5% ดีไฮด์และ 0.5% Tween 20. หลังจากสั่นระงับถูกทิ้งไว้เป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพื่ออนุญาตให้มีอนุภาคขนาดใหญ่ที่จะชำระออก DAPI ถูกเพิ่มเข้ามาแล้วหารของสารละลาย (30 นาทีในที่มืดที่ 4 _C ครั้ง) และต่อมาการแก้ปัญหาถูกกรองผ่านตัวกรองโพลีคาร์บอเนต 0.2 มิลลิเมตร เซลล์ของจุลินทรีย์นับภายใต้ Leica DM 4000 B เรืองแสงกล้องจุลทรรศน์ (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, เยอรมนี) [48] ในทำนองเดียวกันเพื่อที่จะประเมินความมีชีวิตเซลล์ (% สดเซลล์ / สด + ตาย) สามย่อยตัวอย่างซ้ำ (1 กรัม) ของดินสดถูกนำมาวิเคราะห์สำหรับแต่ละล็อตการพิจารณาในการศึกษา (ดินดำสำหรับ t = 0 วันอาณาบริเวณรากพืช A, B, C และ D ดินสำหรับ t = 420 วัน) สองสีย้อมเรืองแสงสีเขียว SYBR ครั้งที่สองและไอโอไดด์ propidium (Sigma- ดิช, เยอรมนี) ถูกนำมาใช้ในการแยกแยะความแตกต่างที่ทำงาน (สีเขียว) และคนตาย (สีแดง) เซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Leica DM 4000B Leica Microsystems GmbH, Wetzlar เยอรมนี) เช่น รายงานก่อนหน้านี้ [49-51] วิธีการนี้จะทำให้มันเป็นไปได้ที่จะประเมินความมีชีวิตของจุลินทรีย์เพราะไอโอไดด์ propidium สีแดงเท่านั้นที่สามารถเข้าสู่เซลล์ที่มีคนตายหรือเสียหาย (ซึ่งอาจจะมีการตรวจพบโดย DAPI คราบดีเอ็นเอเพราะมีเสถียรภาพค่อนข้างสูง) ในที่สุดสามดินย่อยตัวอย่างอื่น ๆ (5 กรัม) ถูกรวบรวมมาจากแต่ละแปลงการวิเคราะห์กิจกรรมของจุลินทรีย์ dehydrogenase (ดินดำสำหรับ t = 0 วันบริเวณราก, A, B, C และ D ดินสำหรับ t = 420 วัน) กิจกรรม dehydrogenase เป็นตัวบ่งชี้ที่ดีสำหรับการประเมินสถานะและการทำงานของจุลินทรีย์ในดินสื่อสารการผูกเป็นมันสะท้อนให้เห็นถึงอัตราการหายใจของจุลินทรีย์ซึ่ง providesinformation ในส่วนของชุมชนจุลินทรีย์ดิน [49,52] วิธีการนี้จะขึ้นอยู่กับการสกัดและการกำหนดสีของสีอย่างเข้มข้น 2,3,5-triphenyl formazan (TPF) ผลิตจากการลดลงของสี trazoliumchloride 2,3,5-triphenylte- (TTC) ในตัวอย่างดิน 24 ชั่วโมงหลังจากการบ่ม ที่ 37 _C ในที่มืด [49,52] ดินกิจกรรม dehydrogenase ถูกแสดงเป็นมิลลิกรัม TPF / g ดินแห้ง