Inhibitory potencies of compounds w

Inhibitory potencies of compounds were determined according
to an established procedure using a commercially available aromatase
test kit from BD Gentest.33 This fluorescence-based assay measures
the rate at which recombinant human aromatase
(baculovirus/insect cell-expressed) converts the substrate 7-methoxy-
trifluoromethylcoumarin (MFC) into a fluorescent product
(kex = 409 nm, kem = 530 nm) in a NADPH regenerating system.
Briefly, concentrated stock solutions of test compounds were prepared
in acetonitrile. 100 lL samples containing serial dilutions
of test compounds (dilution factor of 3 between samples) and
cofactor mixture (0.4 U/mL glucose-6-phosphate dehydrogenase;
16.2 lM NADP+; 825 lM MgCl2; 825 lM glucose-6-phosphate;
50 lMcitrate buffer, pH 7.5) were prepared in a 96 well plate. After
incubating the plate for 10 min at 37 C, 100 lL of an aromatase/
P450 reductase/substrate solution (105 lg protein/mL enzyme;
50 lM MFC; 20 mM phosphate buffer, pH 7.4) were added to
each well. The plate was covered and incubated for 30 min at
37 C. 75 lL of 0.5 MTris base were then added to stop the reaction
and the fluorescence of the formed de-methylated MFC was measured
with a plate reader (SpectraMax Gemini, Molecular Devices).
Fluorescence intensities, which were proportional to the
amount of reaction product generated by aromatase, were graphed
as a function of inhibitor concentration and then fit to a 3-parameter
logistic function. Inhibitory potencies were expressed in terms
of the IC50 value, the inhibitor concentration necessary to reduce
the enzyme activity by half. Each experiment was performed at
least in triplicate.
In cases in which the intrinsic fluorescence of a test compound
overlapped with the fluorescence of the reaction product, the
substrate MFC was substituted by dibenzylfluorescein (DBF) which
was converted by aromatase to fluorescein (kex = 485 nm;
kem = 530 nm).41 The protocol was the same as the one above, except
for a longer incubation time (2 h) and the use of a different
stop reagent (2 M NaOH).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ยับยั้ง potencies ของสารได้รับการพิจารณาตาม
ขั้นตอนที่จะจัดตั้งขึ้นโดยใช้ aromatase เชิงพาณิชย์ที่มี
ชุดทดสอบจาก BD Gentest.33 นี้มาตรการการตรวจสอบปริมาณการเรืองแสงตาม
อัตราที่ aromatase recombinant มนุษย์
(ไวรัส / แมลงเซลล์แสดง) แปลงสารตั้งต้น 7-methoxy -
trifluoromethylcoumarin (เอ็มเอฟ) เป็นผลิตภัณฑ์ที่เรืองแสง
. (kex = 409 นาโนเมตร Kem = 530 นาโนเมตร) ใน NADPH ระบบ regenerating
สั้นเข้มข้นโซลูชั่นหุ้นของสารทดสอบได้จัดทำ
ใน acetonitrile 100 ตัวอย่าง lL มีเจือจางอนุกรม
ของสารทดสอบ (ปัจจัยที่ทำให้เจือจาง 3 ระหว่างตัวอย่าง) และ
ส่วนผสมปัจจัย (0.4 U / มิลลิลิตร dehydrogenase กลูโคส -6- ฟอสเฟต;
16.2 LM NADP +; 825 LM MgCl2; 825 LM กลูโคส -6- ฟอสเฟต;
50 lMcitrate บัฟเฟอร์ค่า pH 7.5) ได้จัดทำขึ้น 96 แผ่นเดียว หลังจาก
บ่มแผ่นเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 37 C, 100 lL ของ aromatase /?
P450 reductase / การแก้ปัญหาสารตั้งต้น (105 LG โปรตีน / เอนไซม์มิลลิลิตร;
50 LM MFC; 20 มมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.4) ถูกเพิ่มเข้าไปใน
แต่ละดี แผ่นถูกปกคลุมและบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่
37 องศาเซลเซียส 75 lL 0.5 ฐาน MTris ถูกเพิ่มแล้วที่จะหยุดปฏิกิริยา
และการเรืองแสงของรูปแบบยกเลิกการ methylated MFC วัด
กับผู้อ่านแผ่น (SpectraMax ราศีเมถุน, อุปกรณ์โมเลกุล).
ความเข้มเรืองแสงซึ่งเป็นสัดส่วนกับ
ปริมาณของสินค้าที่สร้างปฏิกิริยา โดย aromatase ถูกกราฟ
เป็นหน้าที่ของความเข้มข้นของสารยับยั้งแล้วพอดีกับ 3 พารามิเตอร์
ฟังก์ชั่นโลจิสติก potencies ยับยั้งถูกแสดงในแง่
ของค่า IC50 เข้มข้นยับยั้งจำเป็นต้องลด
การทำงานของเอนไซม์โดยครึ่งหนึ่ง แต่ละการทดลองดำเนินการที่
น้อยในเพิ่มขึ้นสามเท่า.
ในกรณีที่เรืองแสงที่แท้จริงของสารทดสอบ
ซ้อนทับกับการเรืองแสงของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา,
พื้นผิวเอ็มเอฟได้รับการแทนที่โดย dibenzylfluorescein (DBF) ซึ่ง
ถูกดัดแปลงโดย aromatase จะ fluorescein (kex = 485 นาโนเมตร;
Kem = 530 นาโนเมตร) 0.41 โปรโตคอลเป็นเช่นเดียวกับหนึ่งดังกล่าวข้างต้นยกเว้น
เป็นเวลาบ่มนาน (2 ชั่วโมง) และการใช้งานที่แตกต่างกันของ
สารหยุด (2 M NaOH)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยับยั้ง potencies ของสารที่พิจารณาตามขั้นตอนการจัดตั้ง
ใช้ในเชิงพาณิชย์ aromatase
ชุดทดสอบจาก BD gentest.33 เรืองนี้ตามอัตราที่ใช้มาตรการ

( recombinant baculovirus / มนุษย์ aromatase เซลล์แมลงแสดง ) แปลงพื้นผิว 7-methoxy -

trifluoromethylcoumarin ( MFC ) เป็นผลิตภัณฑ์เรืองแสง ( KEX = 409 นาโนเมตร ,เขม = 530 nm ) ในระบบ nadph regenerating .
สั้นเข้มข้นหุ้นโซลูชั่นของสารทดสอบเตรียม
ในไน . 100 ตัวอย่างต่อเนื่อง จะประกอบด้วยวิธีการ
สารทดสอบ ( เจือจางปัจจัยที่ 3 ระหว่างตัวอย่าง ) และ
ผสมโคแฟกเตอร์ ( 0 U / ml เอนไซม์ glucose-6-phosphate ;
16.2 LM nadp ; 825 825 อิมอิม MgCl2 ; glucose-6-phosphate ;
50 lmcitrate บัฟเฟอร์ pH 75 ) เตรียมใน 96 ครับจาน หลังจาก
เพาะจานสำหรับ 10 นาทีที่ 37  C 100 จะของ aromatase /
พีเทส / พื้นผิวโซลูชั่น ( 105 LG โปรตีน / ml เอนไซม์ ;
50 LM MFC 20 มม. phosphate buffer pH 7.4 ) เพิ่ม

แต่ละอย่างดี แผ่นคลุมบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 
C . 75 จะ 0.5 mtris ฐานแล้วเพิ่มเพื่อหยุดปฏิกิริยา
และการเรืองแสงของรูปแบบ เดอ methylated MFC วัด
กับเครื่องอ่านแผ่น ( spectramax ราศีเมถุน , อุปกรณ์โมเลกุล ) .
fluorescence intensities ซึ่งเป็นสัดส่วนกับปริมาณของผลิตภัณฑ์ที่สร้างขึ้นโดยปฏิกิริยา

aromatase เป็นกราฟที่เป็นฟังก์ชันของความเข้มข้นและจากนั้นใช้กับฟังก์ชั่น
โลจิสติกฟังก์ชัน ยับยั้ง potencies แสดงออกในแง่
ของมูลค่า ic50 , ตัวยับยั้งของเอนไซม์ที่จำเป็นเพื่อลด
โดยครึ่งหนึ่ง แต่ละทดสอบที่

อย่างน้อยทั้งสามใบ ในกรณีที่เรืองแสงในการทดสอบสาร
ซ้อนกับเรืองของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา ,
( เลือกใช้ dibenzylfluorescein ( DBF ) ซึ่งถูกแปลงโดย aromatase
การี่ ( KEX = 485 nm ;
เขม = 530 nm ) 41 ซึ่งเป็นเดียวกันเป็นหนึ่งข้างต้น ยกเว้น
สำหรับเวลาในการบ่มนาน ( 2 ชั่วโมง ) และใช้ของสารเคมีที่หยุดที่แตกต่างกัน
( 2 M NaOH )