2.2.3. Development of the MCPyV qPC

2.2.3. Development of the MCPyV qPCR assay
A new qPCR assay was designed for MCPyV detection in water
matrices. A fragment of the VP1 gene (132 bp) was obtained by
applying a specific PCR (Bofill-Mas et al., 2010) and cloned into a
pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, WI, USA). Standard curves
were generated by transferring the plasmid construct into E. coli
DH5a cells (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). After verifying the
presence of transformed colonies containing the target sequence by
conventional PCR and purifying them with the Qiagen Plasmid Midi
kit (Qiagen GmbH Inc., Hilden, Germany), the constructions were
linearised with the Sal I restriction enzyme (Promega, Madison,
WI). Then, two primers and a hydrolysis probe were designed based
on the TaqMan® assay to amplify the specific VP1 fragment of the
viral genome (Table 1). Annealing temperatures and primer and probe concentrations for the novel MCPyV qPCR were optimised by
assaying primer concentrations ranging from 0.4 to 0.9 mM and
probe concentrations ranging from 0.225 to 0.4 mM for each reaction.
Amplifications were performed in a mixture containing 10 ml
DNA, 15 ml TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems),
0.9 mM of each primer (MCF and MCR) and 0.225 mM of
the probe (MCP). Following activation with AmpliTaq™ Gold DNA
polymerase for 10 min at 95 C, 40 cycles (15 s at 95 C and 1 min at
60 C) were performed with an MX3000P detector system (Stratagene,
La Jolla, CA, USA). Serial dilutions of the confirmed standard
ranging from 100 to 105 molecules per 10 mL were performed with
TE buffer and stored at 80 C until use. Known amounts of standard
DNA containing 100, 2  100, 5  100, 101, 2  101, 5  101 and
102 GC/reaction were analysed according to MIQE guidelines using
6 replicates to determine the sensitivity of the qPCR assay (Bustin
et al., 2009). The specificity was verified with available standard
plasmids from other human polyomaviruses (JCPyV, BKPyV, KIPyV
and WUPyV) and animal polyomaviruses (ovine PyV and bovine
PyV).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2.3 การพัฒนาวิเคราะห์ qPCR MCPyVวิเคราะห์ qPCR แบบใหม่ถูกออกแบบมาสำหรับการตรวจหา MCPyV น้ำเมทริกซ์ ส่วนของยีน VP1 (132 bp) กล่าวโดยใช้ PCR เฉพาะ (มาส Bofill et al., 2010) และโคลนเข้าไปในตัวpGEM T ง่ายเวกเตอร์ (Promega เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา) เส้นโค้งมาตรฐานสร้างขึ้น โดยถ่ายโอนสร้าง plasmid เป็น E. coliDH5a เซลล์ (Invitrogen คาร์ลส CA, USA) หลังจากตรวจสอบการของอาณานิคมที่ประกอบด้วยลำดับเป้าหมายโดยการแปรรูปPCR ธรรมดาและบริสุทธิ์ ด้วย Qiagen Plasmid Midiชุด (Qiagen GmbH Inc., Hilden เยอรมนี), การก่อสร้างได้linearised กับแซลฉันเอนไซม์จำกัด (Promega เมดิสันอินเตอร์) แล้ว ไพรเมอร์สองโพรบแบบไฮโตรไลซ์ถูกออกแบบมาตามในการทดสอบ TaqMan ®ขยาย VP1 เฉพาะการแยกส่วนของการไวรัสกลุ่ม (ตารางที่ 1) อุณหภูมิหลอมและความเข้มข้นสีรองพื้นและโพรบสำหรับ qPCR MCPyV นวนิยายถูกเหมาะงานกราฟฟิกโดยassaying ตั้งแต่ 0.4 0.9 mM ความเข้มข้นของสีรองพื้น และโพรบตั้งแต่ 0.225 0.4 mM สำหรับปฏิกิริยาแต่ละความเข้มข้นAmplifications ได้ดำเนินการในส่วนผสมประกอบด้วย 10 mlดีเอ็นเอ 15 ml TaqMan ® PCR สากลหลักผสม (Biosystems ใช้),0.9 มม.แต่ละพื้น (MCF และ MCR) และ 0.225 mM ของโพรบ (MCP) เปิดใช้งานต่อกับดีเอ็นเอทอง™ AmpliTaqพอลิเมอเรสใน 10 นาทีที่ 95 C วงจร 40 (15 s ที่ 95 C และ 1 นาทีที่60 C) ได้ดำเนินการกับระบบตรวจจับ MX3000P (StratageneLa Jolla, CA สหรัฐอเมริกา) Dilutions อนุกรมมาตรฐานรับรองตั้งแต่ 100 ถึง 105 โมเลกุลต่อ 10 mL ที่ทำด้วยบัฟเฟอร์ TE และเก็บไว้ที่ 80 C จนใช้ จำนวนมาตรฐานที่รู้จักดีเอ็นเอที่ประกอบด้วย 100, 2 100, 5 100, 101, 2 101, 5 101 และGC 102 ปฏิกิริยาที่ analysed ตามคำแนะนำ MIQE ใช้6 เหมือนกับการตรวจสอบความไวของการทดสอบ qPCR (Bustinร้อยเอ็ด al., 2009) Specificity ที่ถูกตรวจสอบกับมาตรฐานพร้อมใช้งานplasmids จาก polyomaviruses อื่น ๆ มนุษย์ (JCPyV, BKPyV, KIPyVและ WUPyV) และสัตว์ polyomaviruses (PyV แพะและวัวPyV)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2.3 การพัฒนาของการทดสอบ MCPyV qPCR
ทดสอบ qPCR ใหม่ได้รับการออกแบบสำหรับการตรวจสอบ MCPyV ในน้ำ
เมทริกซ์ ส่วนของยีน VP1 (132 bp) ที่ได้รับจาก
การใช้วิธี PCR เฉพาะ (Bofill-Mas et al., 2010) และโคลนเป็น
pGEM-T ง่ายเวกเตอร์ (Promega, Madison, WI, สหรัฐอเมริกา) เส้นโค้งมาตรฐาน
ถูกสร้างขึ้นโดยการโอนเข้ามาสร้างพลาสมิดเชื้อ E. coli
เซลล์ DH5a (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) หลังจากตรวจสอบ
การปรากฏตัวของโคโลนีที่มีการเปลี่ยนเป้าหมายลำดับโดย
วิธี PCR ธรรมดาและบริสุทธิ์ให้กับพลาสมิด Qiagen Midi
ชุด (Qiagen GmbH อิงค์ฮิลเดน, เยอรมนี), การก่อสร้างได้รับการ
เชิงเส้นกับ Sal ฉันเอนไซม์ จำกัด (Promega เมดิสัน
วิสคอนซิน ) จากนั้นทั้งสองไพรเมอร์และไฮโดรไลซิสอบสวนได้รับการออกแบบตาม
ในการทดสอบTaqMan®เพื่อขยายส่วน VP1 เฉพาะของ
จีโนมของไวรัส (ตารางที่ 1) อุณหภูมิการหลอมและความเข้มข้นของไพรเมอร์และสอบสวนนวนิยาย MCPyV qPCR ถูกเพิ่มประสิทธิภาพโดย
assaying ความเข้มข้นของไพรเมอร์ตั้งแต่ 0.4-0.9 มิลลิและ
ความเข้มข้นของการสอบสวนตั้งแต่ 0.225-0.4 มิลลิปฏิกิริยาแต่ละ.
amplifications ได้ดำเนินการในส่วนผสมที่มี 10 มล.
ดีเอ็นเอ 15 มล. TaqMan®สากล PCR โทผสม (Applied Biosystems)
0.9 มิลลิของแต่ละไพรเมอร์ (MCF และ MCR) และ 0.225 มิลลิของ
การสอบสวน (MCP) ต่อไปนี้การเปิดใช้งานกับ AmpliTaq ™ Gold ดีเอ็นเอ
โพลิเมอร์เป็นเวลา 10 นาทีที่ 95 องศาเซลเซียส 40 รอบ (15 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสและ 1 นาทีที่
60 องศาเซลเซียส) ได้ดำเนินการด้วยระบบตรวจจับ MX3000P (Stratagene,
La Jolla, CA, USA) . เจือจางอนุกรมของการยืนยันมาตรฐาน
ตั้งแต่ 100-105 โมเลกุลละ 10 มิลลิลิตรได้ดำเนินการกับ
บัฟเฟอร์ TE และเก็บไว้ที่? 80? C จนถึงการใช้งาน ที่รู้จักกันในปริมาณมาตรฐาน
ที่มีดีเอ็นเอ 100, 2 หรือไม่? 100 5? 100, 101, 2 หรือไม่? 101 5? 101 และ
102 GC / ปฏิกิริยาวิเคราะห์ตามแนวทาง MIQE ใช้
6 ซ้ำเพื่อตรวจสอบความไวของการทดสอบ qPCR (Bustin
et al., 2009) ที่เฉพาะเจาะจงได้รับการตรวจสอบกับมาตรฐานที่มีอยู่
จากพลาสมิด polyomaviruses อื่น ๆ ของมนุษย์ (JCPyV, BKPyV, KIPyV
และ WUPyV) และ polyomaviruses สัตว์ (แกะและวัว PYV
PYV)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2.3 . การพัฒนา mcpyv qpcr assay
การวิเคราะห์ qpcr ใหม่ถูกออกแบบมาสำหรับ mcpyv ตรวจจับในน้ำ
เมทริกซ์ ส่วนของ vp1 ยีน ( 132 / ) โดยนำ
ใช้ PCR ที่เฉพาะเจาะจง ( Bofill Mas et al . , 2010 ) และโคลนเข้าไป
pgem-t ง่ายเวกเตอร์ ( promega เมดิสัน , WI , USA )
เส้นโค้งมาตรฐานถูกสร้างขึ้นโดยการถ่ายโอนพลาสมิดที่สร้างในเซลล์ E . coli
dh5a ( Invitrogen Carlsbad , CA ,สหรัฐอเมริกา ) หลังจากการตรวจสอบการเปลี่ยนโคโลนีที่มี

ลำดับเป้าหมายโดย PCR ธรรมดาและบริสุทธิ์กับเพิ่มชุด MIDI
พลาสมิด ( QIAGEN GmbH บริษัทฮิลเดน , เยอรมนี ) , ที่ดินถูก
linearised กับเกลือผมเอนไซม์ ( promega Madison , WI ,
) จากนั้นสองชนิดและการสอบสวนถูกออกแบบตาม
ใน taqman ® assay เพื่อขยายเฉพาะส่วนของ vp1
จีโนมของไวรัส ( ตารางที่ 1 ) การอบอุณหภูมิและความเข้มข้นสำหรับไพรเมอร์และการสอบสวน qpcr mcpyv นวนิยายมีประสิทธิภาพโดย
assaying primer ความเข้มข้นตั้งแต่ 0.4 ถึง 0.9 มม. และ
โพรบความเข้มข้นตั้งแต่ 0.225 0.4 มม. สำหรับแต่ละปฏิกิริยา
amplifications แสดงในส่วนผสมที่บรรจุ 10 ml
ดีเอ็นเอ