MATERIALS AND METHODSBacterial stra

MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains and inoculum preparation. A. citrulli strain
AAC00-1 was used in this study and was routinely grown on
King’s medium B (19) or nutrient agar (Becton-Dickinson, Sparks,
MD) for 48 h at 28°C. To prepare inoculum, nutrient broth was
inoculated with a single colony of AAC00-1 from a 48 h agar
culture and incubated overnight at 30°C on a rotary shaker
(Innova; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) at 250 rpm.
The culture was centrifuged at 6,000 × g (Allegra 25R, Beckman
Coulter, Fullerton, CA) for 5 min and the supernatant was
decanted. The pellet was resuspended in 0.1 M phosphate
buffer saline solution (PBS) and the bacterial concentration was
adjusted to an optical density of 0.3 at 600 nm (≈1 × 108 CFU/ml)
spectrophometrically (Spectronic 20; Bausch and Lomb, Rochester,
NY) and diluted to a final concentration of ≈1 × 106 CFU/ml
in PBS.
Generation of infested watermelon seed lots. Four A. citrulli
infested seed lots (two seed lots each by pericarp- and pistilinoculation)
were generated for this study (Table 1). Pericarpinoculated
seed lots (1 and 2) were generated under greenhouse
conditions in 2008 and 2009, respectively, as follows. Briefly, 20
watermelon plants (‘Crimson Sweet’) were grown in 15-liter
plastic pots and at anthesis, 30 to 40 attached female blossoms
were pollinated and simultaneously inoculated by gently rubbing
their ovaries with a cotton swab saturated with a cell suspension
with ≈1 × 106 AAC00-1 CFU/ml. Blossoms were enclosed in
plastic bags for 24 h and fruits were allowed to develop for
30 days after pollination. Fruits were harvested and stored at 4°C
until seed extraction. For seed extraction, fruits were surface
sterilized with either 70% ethanol or 0.5% NaOCl and seeds were
manually extracted and air-dried at 25°C on paper towels. Seeds
from different fruits that were treated similarly were pooled and
stored at 4°C until they were used. Pistil-inoculated seed lots
(3 and 4) were generated in 2008 and 2009, respectively, by pollinating
female watermelon blossoms and simultaneously inoculating
their stigmas with AAC00-1 as previously described (24,
41). Briefly, 20 to 25 watermelon plants (‘Crimson Sweet’) were
grown in 15-liter plastic pots under greenhouse conditions and at
anthesis, stigmas were pollinated. Subsequently, 10 μl of a suspension
containing ≈1 × 108 AAC00-1 CFU/ml (≈1 × 106 CFU/
blossom) was transferred to each stigma using a micropipette.
Five blossoms were inoculated per plant, tagged, and allowed to
develop for 30 days after pollination. Thirty-five to forty fruits
were harvested at maturity and seeds were extracted as described
above and pooled to a produce each seed lot.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการสายพันธุ์แบคทีเรียและการเตรียม inoculum ต้องใช้ citrulli อ.AAC00-1 ถูกใช้ในการศึกษานี้ และเติบโตขึ้นเป็นประจำในขนาด B (19) หรือธาตุอาหาร agar (Becton สัน สปาร์คMD) สำหรับ 48 h ที่ 28 องศาเซลเซียส การเตรียม inoculum มีธาตุอาหารซุปinoculated กับอาณานิคมเดียว AAC00 1 จาก agar 48 hวัฒนธรรม และ incubated ค้างคืนที่ 30° C ในเชคเกอร์โรตารี่(หัวใจ รัฐนิวบรันสวิกวิทยาศาสตร์ Co. เอดิสัน NJ) ที่ 250 rpmวัฒนธรรมถูก centrifuged ที่ g × 6000 (Allegra 25R, BeckmanCoulter ฟูลเลอร์ตัน CA) 5 นาทีและ supernatant ถูกdecanted เม็ดถูก resuspended ในฟอสเฟต 0.1 Mเกลือบัฟเฟอร์ (PBS) และแบคทีเรียความเข้มข้นปรับปรุงให้มีความหนาแน่นออปติคัลของ 0.3 ที่ 600 nm (≈1 × 108 CFU/ml)spectrophometrically (Spectronic 20 ก็ออกจากและ Lomb โรเชสเตอร์NY) และทำให้ความเข้มข้นสุดท้ายของ ≈1 × 106 CFU/mlใน PBSรุ่นรบกวนแตงโมเมล็ดจำนวนมาก Citrulli สี่อ.รบกวนเมล็ดจำนวนมาก (สองเมล็ดจำนวนมากแต่ละ pericarp และ pistilinoculation)สร้างขึ้นสำหรับการศึกษานี้ (ตารางที่ 1) Pericarpinoculatedเมล็ดจำนวนมาก (1 และ 2) ถูกสร้างภายใต้เรือนกระจกเงื่อนไขในปี 2008 และ 2009 ตามลำดับ เป็นดังนี้ สั้น ๆ 20แตงโมพืช ('แดงหวาน') ถูกปลูก 15 ลิตรกระถางพลาสติก และ anthesis บลอสซั่มหญิงแนบ 30 ถึง 40pollinated และ inoculated กัน โดยถูเบา ๆรังไข่ของพวกเขากับสำลีอิ่มตัวกับระงับเซลล์กับ ≈1 × 106 AAC00 1 CFU / มล.บลอสซั่มอยู่ภายในถุงพลาสติกสำหรับ 24 ชมและผลไม้ได้รับอนุญาตให้พัฒนาสำหรับ30 วันหลังจาก pollination ผลไม้เก็บเกี่ยว และเก็บที่ 4° Cจนกระทั่งเมล็ดสกัด สำหรับการแยกเมล็ด ผลไม้มีผิวsterilized ทั้งเอทานอล 70% หรือ 0.5% NaOCl และเมล็ดได้ด้วยตนเองแยก ก air-dried ที่ 25° C บนผ้าขนหนูกระดาษ เมล็ดพืชจากผลไม้ต่าง ๆ ที่ได้รับการรักษาในทำนองเดียวกันถูกทางถูกพู และเก็บที่ 4° C จนกว่าจะได้ใช้ Pistil inoculated เมล็ดจำนวนมาก(3 และ 4) สร้างขึ้นในปี 2008 และ 2009 ตามลำดับ โดย pollinatingบลอสซั่มหญิงแตงโมและ inoculating พร้อมกันของ stigmas กับ AAC00 ก่อนหน้านี้เป็นอธิบาย (2441) กันสั้น ๆ 20-25 แตงโมพืช ('แดงหวาน') ได้ปลูกในกระถางพลาสติก 15 ลิตรสภาวะเรือนกระจก และที่anthesis, stigmas ที่ pollinated ในเวลาต่อมา 10 μl ของระงับประกอบด้วย ≈1 × 108 CFU/ml AAC00 1 (≈1 × 106 CFU /บลอสซัม) ถูกถ่ายโอนไปละสติกมาใช้ micropipette การบลอสซั่มห้า inoculated ต่อพืช แท็ก และอนุญาตให้พัฒนาสำหรับ 30 วันหลังจาก pollination ผลไม้ห้าสามสิบสี่สิบมีการเก็บเกี่ยวที่ครบกำหนด และเมล็ดถูกแยกตามด้านบน และทางถูกพูเพื่อผลิตเป็นจำนวนมากแต่ละเมล็ด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการสายพันธุ์แบคทีเรียและการเตรียมหัวเชื้อ
สายพันธุ์เอ citrulli
AAC00-1 ถูกใช้ในการศึกษาครั้งนี้และได้เติบโตขึ้นเป็นประจำใน
B กลางของกษัตริย์ (19) หรืออาหารเลี้ยงเชื้อ (Becton-ดิกคินสันปาร์กส์,
MD) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงวันที่ 28 ° C เพื่อเตรียมความพร้อมหัวเชื้อน้ำซุปสารอาหารที่ได้รับเชื้อด้วยอาณานิคมเดียวของ AAC00-1 จากอาหารเลี้ยงเชื้อเอช 48 วัฒนธรรมและบ่มค้างคืนที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสบนเครื่องปั่นหมุน(Innova; New Brunswick Scientific Co. , เอดิสัน, นิวเจอร์ซีย์) ที่ 250 รอบต่อนาทีวัฒนธรรมที่ได้รับการหมุนเหวี่ยงที่ 6,000 × g (Allegra 25R, เบคค์โคลเตอร์ฟุลเลอร์, CA) เป็นเวลา 5 นาทีและใสถูกdecanted เม็ดถูก resuspended ใน 0.1 M ฟอสเฟตน้ำเกลือบัฟเฟอร์(พีบีเอส) และความเข้มข้นของเชื้อแบคทีเรียที่ถูกปรับให้มีความหนาแน่นออปติคอล0.3 ที่ 600 นาโนเมตร (108 ×≈1 CFU / ml) spectrophometrically (SPECTRONIC 20; Bausch Lomb และโรเชสเตอร์, นิวยอร์ก ) และเจือจางความเข้มข้นสุดท้ายของ≈1× 106 CFU / ml ในพีบีเอส. การสร้างจำนวนมากเมล็ดแตงโมรบกวน สี่เอ citrulli รบกวนเมล็ดจำนวนมาก (สองจำนวนมากเมล็ดแต่ละ pericarp- และ pistilinoculation) ถูกสร้างขึ้นสำหรับการศึกษานี้ (ตารางที่ 1) Pericarpinoculated จำนวนมากเมล็ดพันธุ์ (1 และ 2) ถูกสร้างขึ้นภายใต้เรือนกระจกเงื่อนไขในปี2008 และ 2009 ตามลำดับดังต่อไปนี้ สั้น ๆ , 20 พืชแตงโม (สีแดงเข้มหวาน ') ถูกนำมาปลูกใน 15 ลิตรหม้อพลาสติกและที่ดอกบาน, 30-40 แนบดอกเพศหญิงถูกผสมและเชื้อพร้อมกันเบาๆ ถูรังไข่ของพวกเขาด้วยสำลีอิ่มตัวกับเซลล์แขวนลอยกับ≈ 1 × 106 AAC00-1 CFU / ml ดอกถูกใส่ไว้ในถุงพลาสติกเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและผลไม้ที่ได้รับอนุญาตในการพัฒนาสำหรับ 30 วันหลังจากการผสมเกสร ผลไม้ที่เก็บเกี่ยวและเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสจนกระทั่งสกัดเมล็ด สำหรับการสกัดเมล็ดผลไม้ถูกพื้นผิวที่ผ่านการฆ่าเชื้อด้วยเอทานอล 70% หรือ 0.5% NaOCl และเมล็ดพืชที่ถูกสกัดด้วยตนเองและอากาศแห้งที่อุณหภูมิ25 องศาเซลเซียสบนผ้าขนหนูกระดาษ เมล็ดจากผลไม้ต่าง ๆ ที่ได้รับการรักษาในทำนองเดียวกันถูกรวบรวมและเก็บไว้ที่4 องศาเซลเซียสจนกว่าพวกเขาจะถูกนำมาใช้ ตัวเมีย-เชื้อจำนวนมากเมล็ดพันธุ์(ที่ 3 และ 4) ได้รับการสร้างขึ้นในปี 2008 และ 2009 ตามลำดับโดยการผสมเกสรดอกแตงโมเพศหญิงและพร้อมฉีดวัคซีนstigmas ของพวกเขาด้วย AAC00-1 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (24, 41) สั้น ๆ , 20-25 พืชแตงโม (สีแดงเข้มหวาน ') ถูกนำมาปลูกในกระถางพลาสติก15 ลิตรภายใต้เงื่อนไขที่เรือนกระจกและดอกบาน, stigmas ถูกเรณู ต่อมา 10 ไมโครลิตรของระบบกันสะเทือนที่มี≈1× 108 AAC00-1 CFU / ml (≈1× 106 CFU / ดอก) ถูกย้ายไปปานแต่ละใช้ไมโคร. ห้าดอกถูกเชื้อต่อต้นติดแท็กและได้รับอนุญาตให้พัฒนา30 วันหลังจากการผสมเกสร สามสิบ 5-40 ผลไม้ที่เก็บเกี่ยวเมื่อครบกำหนดและเมล็ดสกัดตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและรวบรวมเพื่อการผลิตจำนวนมากในแต่ละเมล็ด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ
สายพันธุ์แบคทีเรียและการเตรียมเชื้อ . 1 . citrulli เมื่อย
aac00-1 ถูกใช้ในการศึกษานี้คือตรวจที่ปลูกบน
กษัตริย์ medium B ( 19 ) หรือ NUMB3RS ( เบคตอนดิกคินสัน ประกายไฟ
, MD ) 48 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 28 องศา โดยเตรียม น้ำซุปที่ใส่ธาตุ
เดียวอาณานิคมของ aac00-1 จาก 48 ชั่วโมงวุ้น
วัฒนธรรม บ่มค้างคืนที่ 30 ° C ใน
เครื่องปั่น Rotary ( Innova ;บรุนซ์ใหม่ทางวิทยาศาสตร์ Co . , เอดิสัน , นิวเจอร์ซีย์ ) ที่ 250 รอบต่อนาที
วัฒนธรรมคือระดับที่× 6000 กรัม ( Allegra 25r เบ็คแมน
โคลเตอร์ ฟูลเลอร์ตัน ( CA ) เป็นเวลา 5 นาที และสูงคือ
ริน . เม็ดเป็น resuspended ใน 0.1 M phosphate buffer
น้ำเกลือ ( PBS ) และความเข้มข้นของแบคทีเรียคือ
ปรับการซิกแซ็ก 0.3 ที่ 600 nm ( ≈ 1 × 108 CFU / ml )
spectrophometrically ( spectronic Bausch Lomb 20 ; และ Rochester , NY ,
) และเจือจางให้มีความเข้มข้นสุดท้าย≈ 1 × 106 cfu / ml
ใน PBS .
รุ่นรบกวนมาก เมล็ดพันธุ์แตงโม 4 . citrulli
รบกวนเมล็ดสองเมล็ดแต่ละเปลือกและ pistilinoculation )
ถูกสร้างขึ้นสำหรับการศึกษา ( ตารางที่ 1 ) pericarpinoculated
เมล็ด ( 1 และ 2 ) ถูกสร้างขึ้นภายใต้เรือนกระจก
เงื่อนไขในปี 2008 และ 2009 ตามลำดับ ดังนี้ สั้น , พืชแตงโม 20
( 'crimson หวาน ' ) ปลูกในกระถางพลาสติก 15 ลิตร
และดอกบาน 30 ถึง 40 ติดหญิงบุปผา
เป็นเชื้อผสมพร้อมกันเบา ๆถู
รังไข่ด้วยผ้าฝ้ายอิ่มตัวกับเซลล์แขวนลอย
กับ≈ 1 × 106 aac00-1 CFU / ml ถูกล้อมรอบในดอก
ถุงพลาสติก 24 H และผลไม้ได้รับอนุญาตให้พัฒนา
30 วัน หลังจากการผสมเกสร ผลเก็บเกี่ยวและเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศา C
จนถึงแยกเมล็ด การสกัดเมล็ดผลไม้ผิว
ฆ่าเชื้อด้วยเอทานอลให้ 70% หรือ 0.5% ไม่ระบุ และเมล็ด
สกัดด้วยตนเองและอากาศแห้งที่อุณหภูมิ 25 ° C บนผ้าขนหนูกระดาษ เมล็ดจากผลไม้ต่างๆที่ได้รับ

รวมกันได้และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศา C จนกว่าพวกเขาจะถูกใช้ เกสรพืชเมล็ด
( 3 และ 4 ) ถูกสร้างขึ้นในปี 2008 และ 2009 ตามลำดับ โดย pollinating ดอกตัวเมียและพร้อมกันณแตงโม

ของพวกเขาเป็นกับ aac00-1 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 24
41 ) สั้น 20 ถึง 25 พืชแตงโม ( 'crimson หวาน ' )
ปลูกในกระถางพลาสติก 15 ลิตร ภายใต้สภาวะเรือนกระจก และดอกบาน
,เป็นเป็นเกสร . ต่อมา 10 μ L ของช่วงล่าง
ที่มี≈ 1 × 108 aac00-1 CFU / ml ( ≈ 1 × 106 cfu /
ดอก ) ย้ายไปแต่ละจุดใช้ไมโครปิเปต .
5 ดอก ปลูกเชื้อต่อต้น , แท็ก , และอนุญาตให้
พัฒนาเป็นเวลา 30 วัน หลังจากการผสมเกสร สามสิบห้าสี่สิบผลไม้
เก็บที่ครบกําหนดและเมล็ดถูกสกัดไว้
ด้านบนและด้านการผลิตแต่ละเมล็ดมาก