2.1. Materials and chemicalsThe yel

2.1. Materials and chemicals

The yellow cocoons of the silkworm, B. mori, strain, Nangnoi, were obtained from Silk Innovation Center, Mahasarakham University, Thailand. The chemicals 2,2-diphenyl-1 picrylhydrazyl (DPPH), 2,2-azino-bis-(3-ethylenebenzothiozoline-6-sulfonic acid) (ABTS), dithiothreitol (DTT), β-mercaptoethanol (β-ME) and protease from Streptomyces griseus (Type XIV, ≥3.5 units/mg solid, E.C. 232-90-5) were purchased from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Standard protein molecular weight marker was purchased from GeneDirex Inc., Taiwan. Ammonium sulfate [(NH4)2SO4] was purchased from Carlo Erba, Italy. All other chemicals and reagents used in the study were of analytical grade.

2.2. Sericin extraction

Silk cocoons (2 g) were degummed in 200 ml of distilled water with different extraction time for 15, 30, 60, 90 and 120 min at 98 °C to obtain crude sericin extracts (CSE). Protein concentration and antioxidant activity of CSE were determined by Bradford assay and ABTS and DPPH assays, respectively.

2.3. Protein determination by Bradford assay

Sericin extract was diluted with distilled water. Sample (0.5 ml) was added to 1.0 ml of Bradford solution and incubated at room temperature for 5 min. Bovine Serum Albumin (BSA) was used as a standard reference protein. The absorbance of samples was measured at 595 nm with visible spectrophotometer (Thermo Spectronic, U.S.A.).

2.4. Protein fractionation by salting-out with saturated (NH4)2SO4

Saturated (NH4)2SO4 was added to CSE (10.0 ml) until whole yellow colored-protein precipitated. Then, it was centrifuged at 8000 g for 5 min to separate yellow-precipitate (Yellow-PT) and supernatant (SNT). The Yellow-PT was re-dissolved in distilled water and both samples were then dialyzed against distilled water for 5 h. Protein concentration was measured by Bradford assay and antioxidant activity was measured by ABTS and DPPH assays.

2.5. Treatment with dithiothreitol (DTT) and β-mercaptoethanol (β-ME)

CSE (50.0 ml) and SNT were treated with DTT. Samples containing 1200 µg/ml of protein were incubated with 0.5, 1, 5, 10 and 20 mM of DTT for 10 min at room temperature and then dialyzed against distilled water for 24 h to obtain the CSE and SNT treated with DTT. Protein concentration of the samples was determined by Bradford assay and antioxidant activity of the samples was determined by ABTS and DPPH assays. Treatment with β-ME was performed similarly to treatment with DTT except concentration of β-ME at 1, 5, 10, 20 and 30 mM to obtain the CSE and SNT treated with β-ME.

2.6. Treatment with UV light

CSE, Yellow-PT and SNT were exposed to UV light (254 nm) at a distance of 15 cm from a source lamp for 35 Section, 3, 5 and 10 min at room temperature to obtain the CSE, Yellow-PT and SNT after to UV light. Antioxidant activity of the samples was determined by ABTS and DPPH assays.

2.7. Treatment with protease

CSE, Yellow-PT and SNT were treated with protease enzyme at 37 °C pH 7.5 for 3 h. The enzyme-to-substrate protein ratio was 4:100 (w/w) (Wu et al., 2008). The pH of the sample solutions was adjusted for enzymatic hydrolysis with 0.1 mM NaOH. The enzymatic reaction was stopped by heating at 90 °C for 20 min to obtain the CSE, Yellow-PT and SNT treated with protease. Protein concentration of the samples was determined by Bradford assay and antioxidant activity of the samples was assayed by ABTS and DPPH assay. Molecular mass of the samples was estimated by SDS-PAGE.

2.8. Antioxidant activity by ABTS assay

Experiments were performed according to Re et al. (1999) with slight modifications. ABTS and potassium persulfate were dissolved in distilled water to a final concentration of 7 mM and 2.45 mM, respectively. These two solutions were mixed and the mixture was allowed to stand in the dark at room temperature for 16 h before using in order to produce ABTS radical cation (ABTS•+). For the study of antioxidant activity, ABTS•+ solution was diluted with distilled water before using. Samples were diluted in distilled water and added into 1 ml of ABTS solution. The sample was mixed and incubated in the dark at room temperature for 6 min. Then absorbance was measured at 734 nm. The total antioxidant capacity was expressed as percent inhibition, according to the equation: Percent inhibition=[1−(Abs. sample/Abs. control)]×100. The values were expressed as an IC50 value, which is the concentration of the extract that scavenges 50% of the ABTS•+

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.1. วัสดุและสารเคมีรังไหมสีเหลืองไหม B. mori สาย พันธุ์ แนงน ได้รับจากศูนย์นวัตกรรมไหม มหาวิทยาลัยมหาสารคาม ไทย การเคมี 2.2-นไดฟีนิลได-1 picrylhydrazyl (DPPH), กรด 2,2-azino-bis-(3-ethylenebenzothiozoline-6-sulfonic) (รเรียน), dithiothreitol (DTT), β-mercaptoethanol (β-ME) และโปรติเอสจาก Streptomyces griseus (ชนิด XIV, ≥3.5 หน่วย/mg ของแข็ง หรือ 232-90-5) ซื้อจาก บริษัท Sigma Aldrich (เซนต์หลุยส์ MO สหรัฐอเมริกา) เครื่องหมายโมเลกุลโปรตีนมาตรฐานซื้อจาก GeneDirex Inc. ไต้หวัน แอมโมเนียซัลเฟต [(NH4) 2SO4] ซื้อจาก Carlo Erba อิตาลี สารเคมีและสารรีเอเจนต์ที่ใช้ในการศึกษาอื่น ๆ ทั้งหมดของเกรดวิเคราะห์ได้2.2. ทองบริสุทธิ์สกัดรังไหม (2 กรัม) ถูก degummed ใน 200 ml ของน้ำกลั่นสกัดต่าง ๆ เวลา 15, 30, 60, 90 และ 120 นาทีที่ 98 ° C รับทองบริสุทธิ์ดิบสารสกัด (CSE) ความเข้มข้นของโปรตีนและอนุมูลของ CSE ถูกกำหนด โดยแบรดฟอร์ด assay และรเรียนและ DPPH assays ตามลำดับ2.3. โปรตีนกำหนด โดยทดสอบแบรดฟอร์ดสารสกัดจากทองบริสุทธิ์ถูกเจือจาง ด้วยน้ำกลั่น ตัวอย่าง (0.5 มล.) ถูกเพิ่ม 1.0 ml ของแบรดฟอร์ด และได้รับการกกที่อุณหภูมิห้อง 5 นาทีวัว Serum Albumin (บีเอสเอ) ถูกใช้เป็นโปรตีนอ้างอิงมาตรฐาน โดยวัดค่าอย่างที่ 595 nm ด้วยเห็นสเปค (เทอร์โม Spectronic สหรัฐอเมริกา)2.4. โปรตีนแยก โดยออกขยำด้วยอิ่มตัว (NH4) 2SO4อิ่มตัว (NH4) 2SO4 ถูก CSE (10.0 ml) จนตกตะกอนโปรตีนสีเหลืองทั้งหมด จากนั้น มันเป็นผลิตภัณฑ์ที่ 8000 กรัมสำหรับ 5 นาทีในการแยกสีเหลืองตะกอน (เหลือง-PT) และ supernatant (SNT) สีเหลือง-PT เป็นการละลายในน้ำกลั่น และตัวอย่างทั้งสองได้แล้ว dialyzed กับน้ำกลั่น 5 h. ความเข้มข้นของโปรตีนโดยวัดจากการทดสอบแบรดฟอร์ด และอนุมูลโดยวัดจากการรเรียนและ DPPH assays2.5. การรักษา ด้วย dithiothreitol (DTT) และβ-mercaptoethanol (β-ME)CSE (50.0 ml) และ SNT ถูกรักษา ด้วย DTT ตัวอย่างที่ประกอบด้วย 1200 µg/ml ของโปรตีนถูกกับ 0.5, 1, 5, 10 และ 20 มม.ของ DTT สำหรับ 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องได้รับการกกแล้ว dialyzed กับน้ำกลั่นใน 24 ชมขอรับ CSE และรักษา ด้วย DTT SNT กำหนดความเข้มข้นของโปรตีนตัวอย่าง โดยทดสอบแบรดฟอร์ด และอนุมูลตัวอย่างกำหนด โดยรเรียนและ DPPH assays รักษา ด้วยβ-ME ในทำนองเดียวกันเพื่อทำการรักษาด้วย DTT ยกเว้นที่ความเข้มข้นของβ-ME 1, 5, 10, 20 และ 30 มม.ขอรับ CSE และ SNT รักษา ด้วยβ-ฉัน2.6. การรักษา ด้วยแสงยูวีCSE เหลือง-PT และ SNT ได้สัมผัสกับแสงยูวี (254 nm) ในระยะ 15 ซม.จากโคมไฟแหล่งส่วน 35, 3, 5 และ 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อรับ CSE เหลือง-PT และ SNT หลังการแสงยูวี กำหนดกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระตัวอย่าง โดยรเรียนและ DPPH assays2.7 การรักษา ด้วยโปรติเอสCSE เหลือง-PT และ SNT ถูกรักษา ด้วยเอนไซม์โปรติเอสที่ 37 ° C pH 7.5 สำหรับ 3 h อัตราส่วนโปรตีนของเอนไซม์กับสารตั้งต้นคือ 4:100 (w/w) (Wu et al. 2008) ค่า pH ของการแก้ปัญหาอย่างถูกปรับปรุงสำหรับเอนไซม์ในระบบย่อยด้วย NaOH 0.1 mM หยุดปฏิกิริยาเอนไซม์ ด้วยความร้อนที่อุณหภูมิ 90 ° C 20 นาทีรับ CSE เหลือง-PT และ SNT รักษา ด้วยโปรติเอส กำหนดความเข้มข้นของโปรตีนตัวอย่าง โดยทดสอบแบรดฟอร์ด และอนุมูลตัวอย่างถูก assayed รเรียนและ DPPH assay มวลโมเลกุลของตัวอย่างได้ประมาณ โดย SDS-หน้า2.8 อนุมูล โดยทดสอบรเรียนการทดลองดำเนินการตาม Re et al. (1999) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย รเรียนและโพแทสเซียมเพอร์ซัลเฟตที่ละลายในน้ำกลั่นเพื่อความเข้มข้นสุดท้ายของ 7 มม.และ 2.45 มม. ตามลำดับ แก้ปัญหาสองเหล่านี้ถูกผสม และส่วนผสมที่ได้รับอนุญาตให้ยืนในมืดที่อุณหภูมิห้อง 16 ชม.ก่อนที่จะใช้เพื่อผลิตรเรียนรุนแรงไอออน (ABTS• +) สำหรับการศึกษาของอนุมูล ABTS• + แก้ปัญหาถูกเจือจาง ด้วยน้ำกลั่นก่อนที่จะใช้ ตัวอย่างถูกเจือจางในน้ำกลั่น และเพิ่มใน 1 มิลลิลิตรของโซลูชันรเรียน ตัวอย่างผสม และรับการกกในมืดอุณหภูมิห้องสำหรับ 6 นาที แล้วค่าที่ถูกวัดที่ 734 nm กำลังการผลิตรวมสารต้านอนุมูลอิสระถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์การยับยั้ง ตามสมการ: เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง = [1− (ตัวควบคุมตัวอย่าง/วันหยุดตามวันหยุดตาม)] × 100 ค่าถูกแสดงเป็นค่า IC50 ซึ่งเป็นความเข้มข้นของสารสกัดที่ scavenges 50% ของ ABTS• +

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.1 วัสดุและสารเคมี

รังเหลืองไหมบี Mori ความเครียดแน่งน้อย, ที่ได้รับจากศูนย์นวัตกรรมไหม, มหาวิทยาลัยมหาสารคาม, ไทย สารเคมี 2,2-diphenyl-1 picrylhydrazyl (DPPH), 2,2-azino-bis- (กรด 3 ethylenebenzothiozoline-6-sulfonic) (ABTS) dithiothreitol (DTT) β-mercaptoethanol (β-ME) และ โปรติเอสจาก Streptomyces griseus (ชนิดที่สิบสี่≥3.5 / หน่วย mg ของแข็ง EC 232-90-5) ที่ซื้อมาจาก Sigma-Aldrich จำกัด ( St. Louis, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา) เครื่องหมายโปรตีนน้ำหนักโมเลกุลมาตรฐานซื้อจาก GeneDirex อิงค์ไต้หวัน แอมโมเนียมซัลเฟต [(NH4) 2SO4] ซื้อมาจากคาร์โลเออร์บา, อิตาลี สารเคมีอื่น ๆ ทั้งหมดและสารเคมีที่ใช้ในการศึกษาคือการวิเคราะห์ของเกรด.

2.2 เซริซินสกัด

รังไหม (2 กรัม) ถูก degummed ใน 200 มิลลิลิตรของน้ำกลั่นที่มีเวลาการสกัดที่แตกต่างกัน 15, 30, 60, 90 และ 120 นาทีที่ 98 องศาเซลเซียสเพื่อให้ได้สารสกัดจากเซริซินดิบ (CSE) ความเข้มข้นของโปรตีนและสารต้านอนุมูลอิสระของ CSE ถูกกำหนดโดยแบรดฟอทดสอบและ ABTS และตรวจ DPPH ตามลำดับ.

2.3 ความมุ่งมั่นของโปรตีนโดยแบรดฟอทดสอบ

Sericin สารสกัดถูกเจือจางด้วยน้ำกลั่น ตัวอย่าง (0.5 มล.) ถูกเพิ่มเข้ามา 1.0 มล. ของการแก้ปัญหาแบรดฟอและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที เซรั่มอัลบูมิวัว (BSA) ถูกใช้เป็นโปรตีนมาตรฐานอ้างอิง ค่าการดูดกลืนของกลุ่มตัวอย่างได้รับการวัดที่ 595 นาโนเมตรที่มีการมองเห็น spectrophotometer (เทอร์โม SPECTRONIC, สหรัฐอเมริกา).

2.4 แยกโปรตีนโดยการเติมเกลือออกกับอิ่มตัว (NH4) 2SO4

อิ่มตัว (NH4) 2SO4 ถูกบันทึกอยู่ใน CSE (10.0 มล.) จนกระทั่งทั้งสีเหลืองสีโปรตีนตกตะกอน จากนั้นมันก็หมุนเหวี่ยงที่ 8000 กรัมเป็นเวลา 5 นาทีในการแยกตะกอนสีเหลือง (Yellow-PT) และสารละลาย (SNT) สีเหลือง-PT เป็นอีกครั้งที่ละลายในน้ำกลั่นและกลุ่มตัวอย่างทั้งสองถูก dialyzed แล้วกับน้ำกลั่นเป็นเวลา 5 ชั่วโมง ความเข้มข้นของโปรตีนโดยวัดจากแบรดฟอทดสอบและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระโดยวัดจาก ABTS และตรวจ DPPH.

2.5 การรักษาด้วย dithiothreitol (DTT) และβ-mercaptoethanol (β-ME)

CSE (50.0 มล.) และ SNT รับการรักษาด้วย DTT ตัวอย่างที่มี 1,200 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรของโปรตีนที่ถูกบ่มกับ 0.5, 1, 5, 10 และ 20 มม DTT เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องแล้ว dialyzed กับน้ำกลั่นเป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพื่อให้ได้ CSE และ SNT รับการรักษาด้วย DTT โปรตีนเข้มข้นของกลุ่มตัวอย่างถูกกำหนดโดยแบรดฟอทดสอบและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของกลุ่มตัวอย่างถูกกำหนดโดย ABTS และตรวจ DPPH การรักษาด้วยβ-ME ได้ดำเนินการในทำนองเดียวกันการรักษาด้วย DTT ยกเว้นความเข้มข้นของβ-ME ที่ 1, 5, 10, 20 และ 30 มิลลิเมตรเพื่อให้ได้ CSE และ SNT รับการรักษาด้วยβ-ME.

2.6 การรักษาด้วยแสงยูวี

CSE เหลือง-PT และ SNT ได้สัมผัสกับแสงยูวี (254 นาโนเมตร) ที่ระยะห่าง 15 ซม. จากโคมไฟที่มา 35 มาตรา, 3, 5 และ 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องจะได้รับ CSE, สีเหลือง PT และ SNT หลังกับแสงยูวี ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของกลุ่มตัวอย่างถูกกำหนดโดย ABTS และตรวจ DPPH.

2.7 การรักษาด้วยน้ำย่อย

CSE เหลือง-PT และ SNT รับการรักษาด้วยเอนไซม์โปรติเอสที่ 37 ° C ค่า pH 7.5 เป็นเวลา 3 ชั่วโมง อัตราส่วนโปรตีนเอนไซม์เพื่อพื้นผิวเป็น 4: 100 (w / w) (. Wu et al, 2008) ค่า pH ของตัวอย่างการแก้ปัญหาที่ถูกปรับเอนไซม์ย่อยสลาย 0.1 มิลลิ NaOH ปฏิกิริยาของเอนไซม์ก็หยุดด้วยความร้อนที่ 90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีเพื่อให้ได้ CSE เหลือง-PT และ SNT รับการรักษาด้วยน้ำย่อย โปรตีนเข้มข้นของกลุ่มตัวอย่างถูกกำหนดโดยแบรดฟอทดสอบและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของกลุ่มตัวอย่างได้รับการวิเคราะห์โดยวิธี ABTS DPPH และการทดสอบ มวลโมเลกุลของกลุ่มตัวอย่างถูกประเมินโดยวิธี SDS-PAGE.

2.8 ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ABTS โดยการทดสอบ

การทดลองดำเนินการตามเรื่อง et al, (1999) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ABTS และโพแทสเซียมเพอร์ซัลเฟตละลายในน้ำกลั่นความเข้มข้นสุดท้ายของ 7 มม 2.45 มิลลิตามลำดับ ทั้งสองการแก้ปัญหาที่ถูกผสมและส่วนผสมที่ได้รับอนุญาตให้ยืนอยู่ในที่มืดที่อุณหภูมิห้องนาน 16 ชั่วโมงก่อนที่จะใช้เพื่อผลิตไอออน ABTS รุนแรง (ABTS • +) สำหรับการศึกษาของสารต้านอนุมูลอิสระ, การแก้ปัญหา ABTS • + ถูกเจือจางด้วยน้ำกลั่นก่อนที่จะใช้ ตัวอย่างที่ถูกเจือจางในน้ำกลั่นและเพิ่มเข้าไปใน 1 มิลลิลิตรของการแก้ปัญหา ABTS กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการผสมและบ่มในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 6 นาที จากนั้นดูดกลืนแสงวัดที่ 734 นาโนเมตร สารต้านอนุมูลอิสระทั้งหมดได้รับการแสดงเป็นร้อยละยับยั้งตามสมการยับยั้งร้อยละ = [1- (.. Abs ตัวอย่าง / Abs Control)] × 100 ค่าถูกแสดงเป็นค่า IC50 ซึ่งเป็นความเข้มข้นของสารสกัดที่ scavenges 50% ของ ABTS •ด้าน +