2.3. Purification of amylaseA combi

2.3. Purification of amylase
A combination of ammonium precipitation, desalting, Sephadex
G-200 gel filtration chromatography (column dimension 2.6 
10 cm) and DEAE-Sephadex A50 ion-exchange chromatography
was employed to separate and purify the amylase enzyme from
pitaya peel. The initial concentrations of the protein concentration
and the amylase were 12.34 U/ml and 0.91 mg/ml, respectively.
The crude enzyme was first brought to 20% saturation with the
gradual addition of powdered ammonium sulphate and allowed
to stir gently for 1 h. The precipitate was removed by centrifugation
at 10,000 rpm for 30 min and dissolved in 100 mM sodium
acetate buffer (pH 5.0). The supernatant was saturated with 40%,
60% and 80% ammonium sulphate. The precipitate of each step
was dissolved in a small volume of 100 mM sodium acetate buffer
(pH 5.0) and dialyzed against 100 mM sodium acetate buffer
(pH 5.0) overnight with frequent (6–8 interval) buffer changes and
centrifuged again. The dialyzed solution was added to a Sephadex
G-200 column, which was eluted with equilibrating buffer
(100 mM sodium acetate buffer (pH 5.0 + 0.20 mM NaCl). A flow
rate of 1 ml/min was maintained, and 5 fractions of 1.0 ml each
were collected. The amylase activity and protein content of each
fraction was determined at 280 nm. The non-retained fraction
from the Sephadex G-200 column was pooled and submitted to A50. The column was eluted with 100 mM sodium acetate buffer
(pH 5.0) to wash the unbound proteins. The bound proteins were
eluted with linear salt gradients of 1%, 2%, 3%, 4% and 5% NaCl in
the same buffer. The collected fractions of each step were analysed
for amylase activity and protein content at 280 nm. The soluble
protein was determined as described by Bradford (1977) after each
step of purification. The purified enzyme was characterised from
the active pooled fraction. The active pooled fractions were kept
at 4 C for one overnight for future experiments and analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3 การทำให้บริสุทธิ์ของ amylaseการรวมกันของแอมโมเนียฝน desalting, Sephadexเจล G 200 กรอง chromatography (คอลัมน์ขนาด 2.610 เซนติเมตร) และ A50 DEAE Sephadex chromatography แลกเปลี่ยนไอออนได้รับการว่าจ้าง การแยกบริสุทธิ์เอนไซม์ amylase จากpitaya เปลือก ความเข้มข้นเริ่มต้นของความเข้มข้นของโปรตีนและ amylase 12.34 U/ml และ 0.91 mg/ml ตามลำดับเอนไซม์ดิบถูกนำตัวไป 20% ความเข้มด้วยก่อนสมดุลแห่งผงแอมโมเนียมซัลเฟต และอนุญาตให้กวนเบา ๆ สำหรับ 1 h Precipitate ถูกเอาออก โดย centrifugationที่ 10000 รอบต่อนาที 30 นาทีและละลายใน 100 mM โซเดียมบัฟเฟอร์ acetate (pH 5.0) Supernatant ไม่อิ่มตัว มี 40%60% และ 80% แอมโมเนียมซัลเฟต Precipitate ของแต่ละขั้นตอนถูกละลายในปริมาตรเล็ก ๆ ของบัฟเฟอร์ acetate โซเดียม 100 มม.(pH 5.0) และ dialyzed กับบัฟเฟอร์ acetate โซเดียม 100 มม.(pH 5.0) ค้างคืนกับสิ่งเปลี่ยนแปลงบัฟเฟอร์ (ช่วง 6-8) และcentrifuged อีก การแก้ปัญหา dialyzed ถูกเพิ่ม Sephadex มีคอลัมน์ G 200 ซึ่งมี eluted กับ equilibrating บัฟเฟอร์(100 มม.โซเดียม acetate บัฟเฟอร์ (pH 5.0 + 0.20 mM NaCl) ขั้นตอนการอัตรา 1 ml/min ยังคงอยู่ และ 5 ส่วนของ 1.0 mlถูกรวบรวมไว้ Amylase กิจกรรมและโปรตีนเนื้อหาของแต่ละกำหนดเศษส่วนที่ 280 nm เศษส่วนที่ไม่สะสมจาก 200 Sephadex G คอลัมน์ถูกทางถูกพู และส่ง A50 คอลัมน์ถูก eluted กับบัฟเฟอร์ acetate โซเดียม 100 มม.(pH 5.0) ล้างโปรตีนที่ไม่ถูกผูกไว้ โปรตีนที่ถูกผูกไว้ได้eluted กับการไล่ระดับสีเกลือเชิงเส้น 1%, 2%, 3%, 4% และ 5% NaCl ในบัฟเฟอร์ที่เดียวกัน ส่วนรวบรวมของแต่ละขั้นตอนถูก analysedเนื้อหากิจกรรมและโปรตีนของ amylase ที่ 280 nm การละลายน้ำโปรตีนถูกกำหนดเป็นโดยแบรดฟอร์ด (1977) หลังจากแต่ละขั้นตอนการฟอก เอนไซม์บริสุทธิ์ถูกโรคจากส่วนรวมงาน ส่วนรวมการใช้งานที่ถูกเก็บไว้ที่ C 4 พรรณไม้หลากหลายชนิดหนึ่งสำหรับการทดลองในอนาคตและวิเคราะห์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 การทำให้บริสุทธิ์ของอะไมเลส
รวมกันของการตกตะกอนแอมโมเนียม desalting, เอนไซม์
G-200 โคกรองเจล (มิติคอลัมน์ 2.6?
10 เซนติเมตร) และ DEAE-เอนไซม์ A50 แลกเปลี่ยนประจุ
ถูกจ้างมาเพื่อแยกและชำระเอนไซม์อะไมเลสจาก
เปลือกแก้วมังกร ความเข้มข้นเริ่มต้นของความเข้มข้นของโปรตีน
และอะไมเลสเป็น 12.34 U / ml และ 0.91 mg / ml ตามลำดับ
เอนไซม์เป็นครั้งแรกที่มาถึง 20% ที่มีความอิ่มตัว
นอกจากนี้ทีละน้อยของแอมโมเนียมซัลเฟตผงและได้รับอนุญาตให้
ลงไปผัดเบา ๆ เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตะกอนถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยง
ที่ 10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาทีและละลายใน 100 มิลลิเมตรโซเดียม
อะซิเตทบัฟเฟอร์ (pH 5.0) สารละลายที่ได้รับการอิ่มตัวด้วย 40%,
60% และ 80% แอมโมเนียมซัลเฟต ตะกอนของแต่ละขั้นตอน
ถูกละลายในปริมาณเล็ก ๆ ของ 100 มิลลิเมตรโซเดียมอะซิเตทบัฟเฟอร์
(pH 5.0) และ dialyzed กับ 100 มิลลิเมตรโซเดียมอะซิเตทบัฟเฟอร์
(pH 5.0) ค้างคืนกับบ่อย (6-8 ช่วงเวลา) การเปลี่ยนแปลงบัฟเฟอร์และ
ปั่นอีกครั้ง การแก้ปัญหา dialyzed ถูกบันทึกอยู่ในเอนไซม์
คอลัมน์ G-200 ซึ่งได้รับการชะด้วย equilibrating บัฟเฟอร์
(100 มิลลิเมตรโซเดียมอะซิเตทบัฟเฟอร์ (pH 5.0 + 0.20 mM NaCl). การไหล
อัตรา 1 มิลลิลิตร / นาทีได้รับการรักษาและ 5 เศษส่วน 1.0 มลแต่ละ
ถูกเก็บรวบรวม. เนื้อหากิจกรรมอะไมเลสและโปรตีนของแต่ละ
ส่วนถูกกำหนดที่ 280 นาโนเมตร. ส่วนที่ไม่ได้เก็บไว้
จากคอลัมน์เอนไซม์ G-200 ได้รับการรวบรวมและส่งไปยัง A50. คอลัมน์นี้ถูกชะกับ 100 มิลลิเมตรบัฟเฟอร์โซเดียมอะซิเตท
( พีเอช 5.0) ในการล้างโปรตีนหลุด. โปรตีนผูกพันถูก
ชะด้วยการไล่ระดับสีเชิงเส้นของเกลือ 1%, 2%, 3%, 4% และ 5% โซเดียมคลอไรด์ใน
บัฟเฟอร์เดียวกัน. เก็บเศษส่วนของแต่ละขั้นตอนการวิเคราะห์
กิจกรรมอะไมเลส และปริมาณโปรตีนที่ 280 นาโนเมตร. ละลาย
โปรตีนที่ถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้โดยแบรด (1977) หลังจากที่แต่ละ
ขั้นตอนของการทำให้บริสุทธิ์. เอ็นไซม์บริสุทธิ์ก็มีลักษณะจาก
ส่วน pooled ใช้งาน. เศษส่วน pooled ใช้งานถูกเก็บไว้
ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลาหนึ่งคืนสำหรับ การทดลองในอนาคตและการวิเคราะห์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 บริสุทธิ์ของเอนไซม์อะไมเลส
รวมกันตกตะกอนแอมโมเนียม desalting Sephadex G-200 gel filtration chromatography (
คอลัมน์ขนาด 2.6 
10 ซม. ) และการทำไอออนโครมาโตกราฟีสามารถท้า
ใช้เพื่อแยกบริสุทธิ์เอนไซม์อะไมเลสจากเปลือกแก้วมังกร
. เริ่มต้น ความเข้มข้นของโปรตีนและเอนไซม์อะไมเลส
12.34 U / ml ) และ 0.91 mg / ml ตามลำดับ
เอนไซม์ดิบก่อนนำ 20% การอิ่มตัวกับ
เพิ่มทีละส่วนของผงแอมโมเนียมซัลเฟตและอนุญาต
กวนเบา ๆเป็นเวลา 1 ชั่วโมงและจะถูกลบออกโดยการเหวี่ยงแยก
ที่ 10 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาทีและปริมาณ 100 มิลลิเมตรโซเดียม
อะซิเตทบัฟเฟอร์ pH 5.0 ) และน่านเป็นอิ่มตัวกับ 40 %
60% และ 80% แอมโมเนียมซัลเฟต ที่ของแต่ละขั้นตอน